CN105061602B - 用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用，属于生物技术领域。所述融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。制备融合蛋白的方法，包括：将所述融合蛋白的编码基因插入pCold I质粒，得到重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得阳性重组菌；诱导所述阳性重组菌表达融合蛋白，纯化后得到所述融合蛋白。本发明融合蛋白，免疫反应性良好，产量较高，可以用于同时检测抗F4和F5型猪产肠毒素性大肠杆菌抗体。本发明试剂盒方面，检测准确、操作简便，特异性、敏感性、重复性均良好，适合于在临床应用中进行推广，为抗ETEC抗体的快速检测提供了可靠手段。

Description

用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方 法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用。

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)系人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻最常见的病原性大肠杆菌，其致病力主要由黏附素性菌毛和肠毒素两种毒力因子构成，二者密切相关且缺一不可。ETEC首先通过特异性粘附素吸附到小肠粘膜上皮细胞表面的受体上，并定植于肠表面。初生幼畜被ETEC感染后因剧烈水样腹泻和迅速脱水死亡，发病率、死亡率高。据统计，国内幼畜ETEC性腹泻病在幼畜腹泻病中所占比例为：猪35％，牛26％，羊17％，尤其是一周以内的新生幼畜。

猪产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F7(F41)和F18，其中以F4的流行最为普遍，因而也尤为重要。F4菌毛是我国仔猪腹泻病原黏附素的优势抗原，主要引发新生仔猪、吸乳仔猪，甚至断奶仔猪发生腹泻。F5引发的仔猪腹泻仅次于F4。

黏附素抗原具有良好的免疫原性，用带有黏附素的菌体或纯化的黏附素抗原免疫动物体均可以产生高效价的特异性抗体。因此，抗黏附素抗体的检测已成为诊断ETEC的重要指标。目前，对ETEC致病因子的血清学检测方法有凝集试验、琼脂扩散试验和反向间接血凝抑制试验等，但这些方法耗时、费力、灵敏性差、特异性不高。荧光抗体技术虽然有较好的特异性和敏感性，但比较主观且不适合大规模样品检测；ELISA方法具有敏感性好、特异性强、易操作等优点。以往多采用菌体作为包被抗原，虽成本低廉，但纯度和产量较低，且特异性差，易产生交叉反应；有研究者用纯化的黏附性菌毛作为包被抗原，特异性较好，但黏附素纯化方法较繁琐。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，可以用于同时检测抗F4和F5型猪产肠毒素性大肠杆菌抗体，有利于更加全面的监测猪群ETEC感染和疫苗诱导的抗体水平。

本发明的另一目的是提供所述融合蛋白的制备方法，该方法可以实现所述融合蛋白可溶性表达，且该融合蛋白免疫反应性良好，产量较高。

本发明的再一目的是提供所述融合蛋白在制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的ELISA试剂盒方面的应用。该试剂盒检测准确、操作简便，特异性、敏感性、重复性均良好，适合于在临床应用中进行推广，为ETEC的快速检测提供了可靠手段。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明提供所述融合蛋白的编码基因。

优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供含有所述基因的表达盒、载体或细胞。

本发明还提供制备所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：将所述融合蛋白的编码基因插入pCold I质粒，得到重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得阳性重组菌；诱导所述阳性重组菌表达融合蛋白，纯化后得到所述融合蛋白。

优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

最后，本发明提供所述融合蛋白在制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体中的ELISA试剂盒中的应用以及检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括采用所述融合蛋白包被的ELISA板条。

有益效果：本发明用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，可以用于同时检测抗F4型以及F5型猪产肠毒素性大肠杆菌的抗体，有利于更加全面的监测猪群ETEC感染和疫苗诱导的抗体水平。本发明所述融合蛋白的制备方法，可以实现所述融合蛋白可溶性表达，且该融合蛋白免疫反应性良好，产量较高。本发明所述融合蛋白可以应用于制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒检测准确、操作简便，特异性、敏感性、重复性均良好，成本较低，适合于在临床应用中进行推广，为ETEC的快速检测提供了可靠手段。

附图说明

图1是p Cold I-F4-F5酶切鉴定电泳图，其中M1：DL-2000，M2：DL-15000，1-3：重组质粒pCold I-F4-F5的EcoR I和SalI酶切产物。

图2：pCold I-F4-F5/BL21重组菌蛋白表达的SDS-PAGE分析，其中M：中分子量蛋白质标准，1：诱导后重组菌全菌蛋白；2：诱导后重组菌裂解液上清；3：包涵体重悬液。

图3：pGEX-4T-1-F4-F5/BL21重组菌SDS-PAGE分析，其中M：中分子量蛋白质标准，1和3：包涵体沉淀，2和4：诱导后重组菌裂解液上清。

图4是融合蛋白F4-F5的Western blot分析，其中M：中分子量蛋白质标准；1：融合蛋白F4-F5与F4阳性血清的免疫印迹；2：融合蛋白F4-F5与F5阳性血清的免疫印迹。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1制备用于检测抗ETEC抗体的融合蛋白

1、设计用于检测抗ETEC抗体的融合基因

通过生物学软件DNAStar分析ETEC F4(K88)菌毛和ETEC F5(K99)菌毛的核苷酸和氨基酸序列。运用密码子优化软件CodonAdaptationTool(JCAT)分析后，替换F4和F5菌毛核苷酸序列中大肠杆菌的稀有密码子为偏爱密码子，并在F4和F5菌毛的基因片段之间添加linker序列，设计得到了融合基因，序列如SEQ ID NO:2所示。在融合基因的5’端添加EcoRI酶切位点，在3’端添加Sal I酶切位点，送南京金斯瑞生物技术公司合成。

融合基因编码用于检测抗ETEC抗体的融合蛋白F4-F5。融合蛋白F4-F5的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2、融合蛋白F4-F5表达载体的构建

将合成的融合基因片段与pCold I载体(TaKaRa)分别使用EcoR I和Sal I双酶切，然后混合，于37℃孵育3h。连接产物转化Trans5α感受态细胞(TaKaRa)，并涂布至含氨苄青霉素抗性(100μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜。挑取单克隆，于含氨苄青霉素抗性的LB培养基中振荡培养10h后，提取质粒，酶切鉴定结果如图1所示，证实融合基因片段成功插入载体。将该阳性重组质粒命名为pCold I-F4-F5。

另外，将融合基因片段分别插入常用原核表达载体pET28a、pGEX-4T-1和pET22b，经酶切鉴定后分别得到阳性重组质粒pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5和pET22b-F4-F5。

3、重组表达质粒的诱导表达

重组质粒pCold I-F4-F5转化BL21感受态细胞(TaKaRa)，挑取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定。将阳性重组菌命名为pCold I-F4-F5/BL21。

pCold I-F4-F5/BL21活化培养至OD₆₀₀达到1.2，取1ml菌液保存，其余菌液中加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导。诱导后每隔3h取1ml菌液，至诱导后12h。将收集到的菌液4℃、12000r/min离心5min收集沉淀。每管沉淀用80μL的PBS缓冲液悬起后加入20μL SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，用SDS-PAGE电泳分析。电泳结果如图2所示，参照分子质量标准，可见诱导表达获得蛋白大小约为29kD，与融合蛋白F4-F5加his-tag(GEhealthcare)大小一致，证明该重组质粒在大肠杆菌中得到了表达。

取1mL诱导12h的pCold I-F4-F5/BL21菌液，12000rpm离心2min，用300μL PBS缓冲液重悬菌体。冻融3次，超声破碎，离心分离上清液与沉淀。用300μL PBS缓冲液重悬包涵体沉淀。各取40μL菌体裂解液上清与包涵体重悬液，加入10μL SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图2所示，可见融合蛋白F4-F5主要在上清中表达，表达量占菌体总蛋白的35％左右。

另外，将重组质粒pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5和pET22b-F4-F5分别按照常规方法转入感受态细胞BL21，分析各重组菌的蛋白表达情况。以pET28a和pET22b为表达载体时，目标蛋白没有获得表达。以pGEX-4T-1为表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达，分子量约为56kD，如图3所示。

4、融合蛋白F4-F5的Western Blot实验

取诱导后12h的pCold I-F4-F5/BL21菌液进行SDS-PAGE电泳。将电泳结束后的SDS-PAGE凝胶，不经染色，直接用转印装置将蛋白以20V电转印到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，转印时间为1.5h。取出NC膜，在TBST缓冲液中漂洗一下，加入封闭液(含2％脱脂奶粉的TBST缓冲液)，平放于摇床上缓缓摇动1h。将NC膜用剪刀分成两片，分别放入用封闭液稀释的兔源F4型ETEC阳性血清和兔源F5型ETEC阳性血清(购买于中国兽药监察所)中，平放于摇床上室温作用1h。取出NC膜，用TBST缓冲液洗5遍，每次5min。把NC膜放入用封闭液1:10000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，购买于南京诺唯赞生物科技有限公司)，平放于摇床上室温作用1h。取出NC膜，用TBST缓冲液洗5遍，每次5min。把NC膜放入10mL可溶性TMB单组份底物显色液(购买于南京助研生物科技有限公司)中，避光显色1min～15min，一旦出现条带，立即取出浸入ddH₂O中漂洗以终止反应并拍照。从图4可以看出，转印有融合蛋白F4-F5的NC膜可以分别与F4和F5阳性血清发生特异性反应，且条带清晰、单一，表明融合蛋白F4-F5能够同时检测出F4和F5菌毛。

5、融合蛋白F4-F5的纯化

将pCold I-F4-F5/BL21表达菌接种至5ml LB培养基，活化培养过夜。取2ml菌液转接至200ml LB培养基中，培养至OD₆₀₀达到1.2，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导培养12h。收集菌液，12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体沉淀并称重。每克菌体沉淀加10ml Bindingbuffer溶液(GE healthcare生物有限公司)重悬，再次12000rpm离心10min，弃上清。

每克菌体沉淀加5mL Binding buffer溶液重悬，超声破碎。12000rpm离心30min，收集上清液，0.45μm滤器过滤后作为融合蛋白粗提液。将融合蛋白粗提液采用Ni-TED柱(GEhealthcare生物有限公司)进行纯化。上样后，使用10mL Binding buffer洗涤Ni-TED柱，收集1mL洗涤液。用5mL Elution buffer(GE healthcare生物有限公司)洗脱，每次1mL，洗5次，收集各洗脱液。SDS-PAGE检验，纯化效果良好，纯度达到90％，浓度为2.14mg/mL，该重组蛋白易于制备与纯化。

实施例2检测抗ETEC抗体试剂盒的组成及使用方法

一.试剂盒的组成

1.洗涤液：配制pH7.4、0.01M磷酸盐缓冲液，加入终浓度为0.05％的吐温-20。具体配制方法：称取KH₂PO₄0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、NaCl 8g溶于水，然后定容至1000mL，加入0.5mL吐温-20。

2.稀释液：pH7.4、0.01M磷酸盐缓冲液，配制方法同上。

3.终止液：是2M硫酸溶液，将111.2mL浓硫酸用水稀释并定容至1000mL。

4.底物显色液：可溶性TMB单组份底物显色液(购买于南京助研生物科技有限公司)。

TMB是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的缩写。

5.ETEC阳性血清标准品：从多份ETEC免疫仔猪血清中，选择微量凝集实验(微量凝集试验检测鸡大肠杆菌抗体方法的建立与应用,中国畜禽传染病,1996(6):34-37.)检测为阳性且本实施例中试剂盒检测结果OD₄₅₀介于0.9-1.2之间的阳性血清，充分混合，分装后所得，0.5mL/管。阳性血清混合物特异性实验检测为阴性，方法参照实施例3。

6.ETEC阴性血清标准品：从无ETEC免疫史和感染史的仔猪血清中，选择微量凝集实验检测为阴性且本实施例中试剂盒检测结果OD₄₅₀＜0.314的阴性血清，充分混合，分装后所得，0.5mL/管。阴性血清混合物特异性实验检测为阴性，方法参照实施例3。

7.融合蛋白F4-F5包被的ELISA板条/酶标板。

8.辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG：购买于美国BETHYL公司。

二.酶标板的包被及试剂盒的使用方法

1.酶标板包被方法的优化

(1)抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定

采用方阵滴定法确定抗原最适包被浓度和血清最适稀释度。具体方法如下：用稀释液将纯化的融合蛋白F4-F5按如下稀释度进行梯度稀释1:1000(0.5ug/ml)、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000。将各稀释度的融合蛋白F4-F5以100μL/孔的量加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，4℃包被过夜。弃去抗原液，用洗涤液充分洗涤三次，每次200μL/孔，每次洗涤时间为5min。然后使用5％(质量百分浓度)的脱脂乳溶液(将脱脂乳粉溶于水制得)封闭，200μL/孔，37℃封闭1h。弃去封闭液，用上述的操作方法洗涤。将ETEC阳、阴性血清标准品采用稀释液分别依次做1:100、1:200稀释直至1:3200，以每孔100μL的量分别加入到聚苯乙烯微量反应板中，在37℃的条件下作用60min；弃去血清，用上述的操作方法洗涤。加入采用稀释液按照1:15,000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，100μL/孔，在37℃的条件下作用30min；弃去酶标二抗，用上述操作方法洗涤，尽量弃去孔内液体，加入可溶性TMB单组份底物显色液，100μL/孔，37℃避光显色10min，最后加入终止液终止反应；选取阳性血清OD₄₅₀值接近1左右，阴性血清OD₄₅₀低于0.3，且阳性血清OD₄₅₀/阴性血清OD₄₅₀最大时的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳工作浓度。

方阵滴定结果如表1所示，采用稀释度为1:8000的融合蛋白F4-F5(对应的浓度0.0625μg/mL)包被酶标板，血清稀释度为1:200时，阳性血清OD₄₅₀值接近1，阴性血清OD₄₅₀值接近0.3，且P/N值为4.45较大。因此确定融合蛋白F4-F5的最佳包被浓度为0.0625μg/mL，血清的最佳稀释度为1:200。

表1：ELISA方阵

(2)包被条件的选择

采用最佳包被浓度将融合蛋白F4-F5包被酶标板，分别在4℃反应过夜、37℃反应1h、37℃反应2h，进行包被。用阴、阳性血清标准品进行ELISA检测，测定OD₄₅₀并分析P/N变化情况，评价其包被效果。确定最佳包被条件为37℃反应2h。

(3)封闭液的选择

采用最佳包被浓度将融合蛋白F4-F5包被酶标板，包被结束后洗涤，分别用5％(质量百分浓度)脱脂乳溶液、1％(质量百分浓度)BSA溶液、1％(质量百分浓度)明胶溶液作为封闭液，封闭1h。在其他条件相同的情况下，用阴、阳性血清标准品进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其封闭效果。最终确定最佳封闭液为5％脱脂乳溶液。

(4)封闭条件的确定

采用标题(1)-(3)中确定的条件，将封闭液分别在37℃封闭1h、2h和3h，用阴、阳性血清标准品进行ELISA检测，测定OD₄₅₀并分析P/N变化情况，评价其封闭效果。最终确定最佳封闭条件为37℃反应1h。

(5)酶标板包被的最优方法

具体如下：采用稀释度为1:8000的融合蛋白F4-F5(对应的浓度0.0625μg/mL)以100μL/孔的量在37℃条件下包被酶标板，包被时间为2h，弃去包被液，用洗涤液充分洗涤三次，每次200μL/孔，每次洗涤时间为5min。用5％脱脂乳溶液在37℃条件下进行封闭，200μL/孔，封闭时间为1h。弃去封闭液，用上述的操作方法洗涤。

2.ELISA操作程序的优化

(1)最适抗原抗体反应时间的确定

取包被好的酶标板，加入最佳稀释度的血清后，37℃分别孵育30min、45min、60min。在其他条件不变的情况下进行ELISA检测，测定OD₄₅₀值并分析P/N变化情况，评价其效果。确定最适抗原抗体反应时间为60min。

(2)羊抗猪酶标二抗最适工作浓度的确定

将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(美国BETHYL公司)分别按照稀释度为1:10,000、1:15,000、1:20,000进行稀释，在其他条件不变的情况下进行ELISA检测，根据OD450值和P/N值变化情况，评价其效果。最终确定辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG最适工作浓度：稀释度为1:15,000。

(3)羊抗猪酶标二抗最适显色时间的确定

加入底物显色液后于室温分别作用5min、10min、15min，在其他条件为上述所优化的最佳条件，根据OD450值和P/N值变化情况，确定最佳显色时间。结果如表2所示，最佳显色时间为10min。

表2：最适显色时间的确定

(4)最终确定的ELISA操作程序：

取出已包被好的酶标板，用稀释液将待检血清、ETEC阴性血清标准品、阳性血清标准品分别做1:200稀释，加入酶标板各孔，每孔100μL，每份待检血清与ETEC阴性血清标准品、阳性血清标准品各加2孔，37℃反应60分钟；弃去孔内液体，每孔用200μL洗涤液洗涤5次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG采用稀释液作1:15000，每孔加入100μL，37℃反应30分钟；弃去孔内液体，每孔用200μL洗涤液洗涤5次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL底物显色液，室温避光显色10分钟后，加入50μL终止液；用酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值(OD₄₅₀)，计算OD₄₅₀平均值、S/P值并判定结果。

3.阴阳性临界值的确定

用已建立的间接ELISA方法检测53份ETEC阴性份血清(无ETEC免疫史和感染史的仔猪血清)，读取OD₄₅₀值，计算出53份阴性份血清的OD₄₅₀值的平均值(X)和标准方差(SD)，根据阴阳性临界值＝X+3SD，算出阴阳性判定值。经计算X＝0.167，SD＝0.049，因此ELISA阴阳性血清判定值＝0.227+3*0.049＝0.314。即待检血清样品的OD₄₅₀≥0.314，判定为阳性血清，OD₄₅₀＜0.314，判定为阴性血清。

为消除每次间接ELISA检测时，实验环境及操作的影响，每次检测时加入阳性血清标准品和阴性血清标准品，通过计算各份待检血清样品OD₄₅₀的比值S/P，来进行阴阳性判断。取上述OD₄₅₀＜0.314的53份ETEC阴性血清，按已确定的条件进行间接ELISA，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，计算各份血清OD₄₅₀与标准阳性血清OD₄₅₀的比值S/P，计算S/P值的平均值X及标准方差SD，阴阳性临界值＝X十3SD。

经计算，53份血清的S/P平均值X＝0.096，SD＝0.044，因此ELISA阴阳性临界值＝0.096+3*0.044＝0.23。因此，当待检血清样品S/P值≥0.23时为阳性，S/P值＜0.23时为阴性。

实施例3 特异性实验

考察实施例2中试剂盒的特异性。采用实施例2中试剂盒以间接ELISA方法对已知的PEDV(猪流行性腹泻病毒)、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、PRV(伪狂犬病毒)、CSFV(猪瘟病毒)、PCV2(猪圆环病毒2型)、APP(猪胸膜肺炎放线杆菌)和SS(猪链球菌)的阳性血清进行检测。每份血清做3个平行重复。用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，以确定该间接ELISA方法的特异性。其中PEDV、PRRSV、PRV、CSFV、PCV2的阳性血清购自IDEXX公司，APP和SS阳性血清购自武汉科前生物科技有限公司。结果显示，PEDV、PRRSV、PRV、CSFV、FMDV、PCV2、APP、SS阳性血清的S/P均小于0.23，判定为阴性。

实施例4 敏感性试验

分别采用实施例2中试剂盒和微量凝集试验检测4份ETEC阳性血清(是微量凝集试验筛选的F4型ETEC阳性血清和F5型ETEC阳性血清)，以比较两种方法的敏感性(表3)。1#血清，稀释度为1:6400时，试剂盒ELISA检测转为阴性；1#血清稀释度为1:800时，微量凝集试验结果转为阴性。2#血清，稀释度为1:6400时，ELISA检测结果仍未转为阴性(OD450＝0.454＞0.314；2#血清，稀释度为1:1600时，微量凝集试验结果转为阴性。3#血清，稀释度为1:3200时，ELISA检测结果转为阴性；3#血清，稀释度为1:800时，微量凝集试验结果转为阴性。4#血清，稀释度为1:3200时，ELISA检测结果转为阴性；4#血清，稀释度为1:400时，微量凝集试验结果转为阴性。上述实验结果，显示实施例2中试剂盒具有非常高的敏感性。

表3：微量凝集试验和实施例2中试剂盒对4份ETEC阳性血清的敏感性检测结果

注：表3中“凝集”是微量凝集试验的缩写，“ELISA”是实施例2中试剂盒检测方法的缩写。

实施例5 重复性试验

考察实施例2中试剂盒的重复性。

1、批内重复实验：

通过微量凝集试验筛选到了数份F4型ETEC阳性血清和F5型ETEC阳性血清。从F4型ETEC阳性血清和F5型ETEC阳性血清中分别随机挑选4份不抗体水平的血清，共获得8份血清，用于批内重复实验。

每批次试剂盒使用同批诱导纯化制备的融合蛋白F4-F5。分别考察三个批次试剂盒的批内重复性。

批内重复性考察方法：从各批次试剂盒内随机抽出一个试剂盒，同时检测同一份血清样品。在一周内随机选取3个时间段检测8份血清样品。计算各份血清样品S/P值，以及S/P值的平均值X，标准差SD，变异系数CV，结果如表4。

表4：批内重复性实验结果

由表4可知，采用不同批次试剂盒在不同时间检测8份血清样品，得到的S/P值的变异系数在3.60％-7.89％之间，同批试剂盒在不同时间操作检测结果重复性良好。

2、批间重复实验：

通过微量凝集试验筛选到了数份F4型ETEC阳性血清和F5型ETEC阳性血清。从F4型ETEC阳性血清和F5型ETEC阳性血清中分别随机挑选4份不抗体水平的血清，共获得8份血清，用于批间重复实验。

每批次试剂盒使用同批诱导纯化制备的融合蛋白F4-F5。分别从三批次试剂盒内随机选择一个，同时检测同一份血清样品。在同一时间，对上述8份随机选择的含不同水平抗ETEC抗体的血清进行检测。计算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值X，标准差SD，变异系数CV，具体情况见表5。

表5：批间重复性实验结果

由表4可知，8份血清样品S/P值的变异系数在1.75-4.90％之间，不同批次的融合蛋白F4-F5检测结果重复性良好。

实施例6 检测免疫猪血清

采用实施例2制备的试剂盒检测免疫猪血清中抗F4和F5型ETEC抗体水平。

选取3头怀孕母猪(编号分别为1#、2#和3#)，产前40天免疫接种商品化猪大肠杆菌三价F4-F5-F6疫苗(中牧集团)，分别于免疫前、生产前(免疫后35天)采集血清；然后选取1#母猪的新生仔猪3头，分别于吮吸初乳后7天、30天采集血清，待35天断奶后，采集2月龄和3月龄仔猪血清。所有母猪和仔猪血清，使用实施例2中试剂盒检测抗体滴度。结果显示(表6)，母猪免疫后35天，较免疫前OD₄₅₀有明显升高；新生仔猪由于吮吸初乳，母源抗体维持在较高水平，断奶后2月龄抗体滴度逐渐下降，3月龄仔猪血清OD₄₅₀已接近阴性。实验结果表明，本发明提供的抗ETEC血清抗体ELISA试剂盒可以用来评估疫苗的免疫效果，为猪场ETEC疫情的防控提供技术支撑。

表6：实施例2中试剂盒监测疫苗诱导抗体的消长(OD₄₅₀)

组别

免疫前

生产前

初乳7天

初乳21天

2月龄

3月龄

母猪1#

0.373

1.221

/

/

/

/

母猪2#

0.353

1.158

/

/

/

/

母猪3#

0.255

1.11

/

/

/

/

仔猪1#

/

/

1.068

0.88

0.316

0.235

仔猪2#

/

/

1.05

0.675

0.296

0.218

仔猪3#

/

/

0.996

0.503

0.373

0.248

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用

<130> 20150803

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 融合蛋白F4-F5

<400> 1

Met Thr Gly Asp Phe Asn Gly Ser Val Asp Ile Gly Gly Ser Ile Thr

1 5 10 15

Ala Asp Asp Tyr Arg Gln Lys Trp Glu Trp Lys Val Gly Thr Gly Leu

20 25 30

Asn Gly Phe Gly Asn Val Leu Asn Asp Leu Thr Asn Gly Gly Thr Lys

35 40 45

Leu Thr Ile Thr Val Thr Gly Asn Lys Pro Ile Leu Leu Gly Arg Thr

50 55 60

Lys Glu Ala Phe Ala Thr Pro Val Thr Gly Gly Val Asp Gly Ile Pro

65 70 75 80

His Ile Ala Phe Thr Asp Tyr Glu Gly Ala Ser Val Val Leu Arg Asn

85 90 95

Pro Asp Gly Glu Thr Asn Lys Lys Gly Leu Ala Tyr Phe Val Leu Pro

100 105 110

Met Lys Asn Ala Glu Gly Thr Lys Val Gly Ser Val Lys Val Asn Ala

115 120 125

Gly Pro Gly Pro Thr Ser Ala Thr Cys Thr Ile Asp Pro Glu Val Asn

130 135 140

Gly Asn Arg Thr Ser Thr Ile Asp Leu Gly Gln Ala Ala Ile Ser Gly

145 150 155 160

His Gly Thr Val Val Asp Phe Lys Leu Lys Pro Ala Pro Gly Ser Asn

165 170 175

Asp Cys Leu Ala Lys Thr Asn Ala Arg Ile Asp Trp Ser Gly Ser Met

180 185 190

Asn Ser Leu Gly Phe Asn Asn Thr Ala Ser Gly Asn Thr Ala Ala Lys

195 200 205

Gly Tyr His Met Thr Leu Arg Ala Thr Asn Val Gly Asn Gly Ser Gly

210 215 220

Gly Ala Asn Ile Asn Thr Ser Phe Thr Thr Ala Glu Tyr Thr His Thr

225 230 235 240

Ser Ala Ile Gln Ser Phe Asn Tyr Ser Ala Gln Leu Lys Lys Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Pro Ser Asn Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Val Phe Thr Thr Ser

260 265 270

Ala Ser Phe Leu Val Thr Tyr

275

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 融合蛋白F4-F5

<400> 2

atgaccggcg acttcaatgg tagcgtggac atcggcggct ccatcacggc tgacgattac 60

cgccagaaat gggagtggaa agttggtacc ggcctgaacg gcttcggtaa cgtactgaat 120

gacctgacca acggcggtac caaactgacg atcacggtga ccggtaacaa accgattctg 180

ctgggccgta ctaaagaagc cttcgctacg ccggtgactg gtggtgtgga cggcatcccg 240

cacatcgcct tcaccgacta cgaaggtgct agcgtggtgc tgcgtaaccc ggatggtgaa 300

accaataaaa agggtctggc gtacttcgtc ctgcctatga aaaacgctga gggcaccaaa 360

gttggtagcg taaaagtgaa tgcgggtccg ggcccgactt ctgccacctg taccattgac 420

ccggaagtga acggtaatcg tacctctact atcgacctgg gccaggcggc catctccggc 480

cacggtacgg tggttgattt taaactgaaa ccggcaccag gctctaacga ctgcctggca 540

aaaaccaacg cgcgcatcga ttggtccggt tctatgaact ccctgggctt caacaacacc 600

gcgagcggta acaccgccgc taaaggttac catatgaccc tgcgcgcgac taacgtaggt 660

aacggtagcg gtggtgcaaa tattaacacc agcttcacca ctgcggagta cacccatacc 720

agcgctatcc agtccttcaa ctattctgcg caactgaaaa aggacgatcg cgccccatct 780

aacggtggct acaaggcagg cgtgttcacc acttctgcat ctttcctggt cacttac 837

Claims (4)

1.一种用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，采用如下方法制备：将所述融合蛋白的编码基因插入pCold质粒，得到重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得阳性重组菌；诱导所述阳性重组菌表达融合蛋白，纯化后得到所述融合蛋白。

2.根据权利要求1所述用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1或2所述融合蛋白在制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体中的ELISA试剂盒中的应用。

4.一种检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括采用权利要求1或2所述融合蛋白包被的ELISA板条。