CN102731615A - Prrsv的检测试剂和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及猪繁殖与呼吸病毒的检测试剂和检测方法。在一方面，本发明提供了编码的非结构蛋白2(Nsp2)中的免疫原性片段。特别地，本申请提供的免疫原性片段在减毒PRRSV的Nsp2蛋白中不存在但是存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白中。在另一方面，本发明还提供了寡核苷酸引物。特别地，本申请提供的寡核苷酸引物的待扩增区域包括Nsp2蛋白的至少部分编码序列，其在减毒PRRSV的Nsp2编码序列中不具有，但是存在于野生型PRRSV的Nsp2编码序列中。本申请还提供了这些相关检测试剂用于检测的方法，以及用这些方法区分减毒PRRSV免疫的猪和野生型PRRSV感染的猪的方法。
Description
技术领域
本发明涉及兽医领域，具体涉及猪繁殖与呼吸病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus，PRRSV)的检测试剂和检测方法。具体地，本发明涉及PRRSV编码的Nsp2蛋白中的免疫原性片段及其用途，以及PRRSV中的Nsp2编码序列中的片段及其用途。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种感染率高、发病急、病死率高的接触性传染病。2006年我国大规模爆发该疾病，引起大量的妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，育肥猪高热、厌食、死亡，给我国的养猪业造成了严重的经济损失。经过病毒分离和病毒基因组的序列比对发现，引起该高热病是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
PRRSV是一种正链RNA病毒，目前已发现两种基因型：欧洲型和美洲型。PRRSV基因组中有多个开放阅读框，其中第一个开放阅读框(ORF1a和ORF1b)含有PRRSV基因组的80％的序列，其编码PRRSV病毒复制所必须的RNA复制酶(Straw et al，Diseases ofSwine，9TH edition，chapter 24(2006))。ORF1a和ORF1b被翻译成一个多蛋白(poly-protein)，该多蛋白被其中含有的蛋白酶活性区域切割成多个非结构蛋白，包括Nsp1-Nsp12(见，例如，Vries et al，Seminars in Virology，8：33-47(1997)；Allende et al，Journal of General Virology，80：307-315(1999))。
Nsp2蛋白具有蛋白酶活性区域，在多蛋白的酶切处理中起重要的作用。已经发现，Nsp2蛋白对PRRSV的致病性至关重要，Nsp2中缺失某些序列后会导致PRRSV无法存活(Han et al.，Journal of Virology，81(18)：9878-9890(2007))，或者感染细胞的能力减弱(Kimet al，Virus Genes，38：118-128(2008))。本领域也已经开发出了具有Nsp2缺失的减毒PRRSV疫苗(中国专利申请CN101633909A)。
在病毒传播的情况下，如果能够及时识别出感染了致病性病毒的动物，并及早将这些被感染的动物从畜群中隔离，那么往往能够避免病毒的扩大传播，减少经济损失。但目前针对PRRSV的检测方法具有很多局限性，例如，需要病毒分离鉴定、使用活病毒存在散度危险、实验条件要求较高、操作繁锁以及难以区分天然感染的动物和经疫苗免疫的动物等。在兽医实际临床工作中，大量的血清样品监测及预防未知疾病的爆发迫切需要一种反应快速、操作简便、结果准确、生物安全性高的检测试剂和方法。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其含有与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述免疫原性片段包括至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个连续的氨基酸。
在某些实施方式中，所述多肽能够在体内产生特异性结合所述免疫原性片段的抗体。在某些实施方式中，所述多肽能够检测样品中是否存在特异性结合所述免疫原性片段的抗体。
在某些实施方式中，所述多肽含有SEQ ID NO：1中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述免疫原性片段选自：SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)、GHLQKEKEA(SEQ ID NO：3)和PRTPAPSVSAESDLT(SEQ ID NO：4)。
在某些实施方式中，所述多肽与载体物质相连。在某些实施方式中，所述载体是载体蛋白或聚合物。
在另一方面，本发明提供了一种检测试剂，其包含本发明提供的分离的多肽。在另一方面，本发明还提供了一种检测装置，其包括含有所述多肽的所述检测试剂，并且所述检测试剂附着在固相支持物上。
在另一方面，本发明还提供了一种检测样品中抗体的方法，所述样品来自被PRRSV感染的猪，该方法包括将所述样品与本发明提供的分离的多肽接触，并检测所述多肽与样品中抗体的特异性结合。
在另一方面，本发明还提供了用本发明提供的多肽区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪的方法。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
在另一方面，本发明还提供了一种分离的抗体，其能够特异性结合本发明提供的多肽中的免疫原性片段。在某些实施方式中，本发明提供的抗体进一步带有标记物。在某些实施方式中，所述标记物可以是荧光标记物、发光标记物、放射性标记物、酶标记物或有色物质标记物。
在另一方面，本发明还提供了一种检测试剂，其包含了本发明提供的分离的抗体。在另一方面，本发明还提供了一种检测装置，其包括含有所述抗体的所述检测试剂，并且所述检测试剂附着在固相支持物上。
在另一方面，本发明还提供了一种检测样品中PRRSV存在的方法，所述方法包括将所述样品与本发明提供的分离的抗体接触，并检测所述抗体与样品中所述PRRSV中的抗原的特异性结合。
在另一方面，本发明还提供了用本发明提供的抗体区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪的方法。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
在另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括本发明提供的分离的多肽，其中所述多肽附着在固相支持物上。在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括一种检测抗体。在某些实施方式中，所述检测抗体带有标记物。在某些实施方式中，所述检测抗体是抗猪抗体。
在另一方面，本发明还提供了寡核苷酸引物，其能检测生物样品中PRRSV的存在。
在另一方面，本发明还提供了检测生物样品中的PRRSV的方法，包括使用本发明的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小。
附图说明
图1(a)是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株TJM(PRRSV TJM)与猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株VR-2332和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株基因缺失模式图。
图1(b)是寡核苷酸引物杂交序列在PRRSV的Nsp2编码区域及其附近的相对位置。
图2是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株TJM(PRRSV TJM)与猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株VR-2332和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株基因缺失序列比对图。
图3是PRRSV TJM株的非结构蛋白Nsp2基因中缺失的碱基序列。
图4是PRRSV TJM株编码的非结构蛋白Nsp2中缺失的蛋白序列。
图5是PRRSV TJM株编码的Nsp2蛋白的缺失序列中的B细胞表位合成多肽。
图6是PRRSV TJ强毒株攻击后的抗体检测结果。
图7是PRRSV TJM疫苗免疫后，用PRRSV TJ株攻击后测得的抗体检测结果。
图8是用寡核苷酸引物扩增样品中的cDNA后用电泳检测的结果。
具体实施方式
本发明涉及PRRSV基因组编码的Nsp2蛋白序列中的一个或多个免疫原性片段。Nsp2蛋白编码序列已经在多个PRRSV毒株的基因组中被识别(见，例如，Allende et al，Journalof General Virology，80：307-315(1999)；美国专利申请US20100215694)，Nsp2蛋白的N末端切割位点和C末端切割位点也已经公开(见，例如，Nielsen et al.，Journal of GeneralVirology，82：1263-1272(2001)；Ziebuhr et al.，Journal of General Virology，81：853-879(2000))。Nsp2蛋白的编码序列可以通过本领域公知的方法确定。例如，可以通过将PRRSV的基因组序列与已知PRRSV基因组序列比对，根据已知PRRSV基因组中的Nsp2序列确定。或者，可以通过在PRRSV基因组的ORF1a中识别已知的Nsp2的N末端和C末端切割位点，从而找出Nsp2蛋白的编码序列。
Nsp2蛋白具有蛋白酶活性结构域，被认为介导ORF1编码的多蛋白的剪切和处理。Nsp2蛋白还被认为参与RNA复制酶复合物的形成，对PRRSV的复制起重要作用。已经发现，Nsp2蛋白中缺失部分氨基酸序列会导致PRRSV的致病性减弱甚至消失(见，例如，中国专利申请CN101633909A)。这样的减毒PRRSV已被证明能够用于制备PRRSV疫苗，用于免疫猪并预防猪感染野生型PRRSV。
在一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其含有Nsp2蛋白序列中的一个或多个免疫原性片段，该免疫原性片段在减毒PRRSV的Nsp2蛋白序列中不具有，但是存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白序列中。
在本申请中，“减毒PRRSV”是指在Nsp2蛋白中缺失了部分氨基酸序列的PRRSV，其能够感染宿主，但是不能引起猪繁殖与呼吸综合征，或者其引起的症状较少和/或较轻。减毒PRRSV包括活的减毒PRRSV以及由其灭活得到的灭活产物。
“猪繁殖与呼吸综合征”是指天然的PRRSV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽、母猪繁殖障碍、仔猪生长缓慢或死亡等。
“野生型PRRSV”在本申请中是指能够感染宿主，并且能够引起猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV。在某些实施方式中，野生型PRRSV感染宿主后引起的猪繁殖与呼吸综合征的症状与天然的PRRSV毒株或PRRSV标准株引起的症状相当，甚至可能强于PRRSV标准株引起的症状。PRRSV标准株例如，但不限于，美洲型标准株VR-2332(全基因组序列的GenBank登录号：AY 150564)，欧洲型标准株Lelystad株(见，例如，WO92/21375)。
“PRRSV”在本申请中包括PRRSV病毒以及能够产生PRRSV病毒的遗传物质，例如但不限于，含有PRRSV全基因组的RNA分子、含有能够组装成PRRSV全基因组的多个RNA分子、含有编码PRRSV全基因组的DNA分子、以及含有编码部分PRRSV全基因组的多个DNA分子，其能够组装成PRRSV全基因组。
“免疫原性片段”在本申请中是指，能够被抗体特异性识别的多肽片段。对于一段给定的多肽序列，可以通过本领域公知的多种方法来确定其中包含的免疫原性片段。
在某些实施方式中，可以用本领域公知的软件对给定序列进行免疫原性片段的预测。可以采用的软件例如，但不限于，DNAStar的Lasergene软件(见，例如，T.Burland et al.，DNASTAR’s Lasergene Sequence Analysis Software，Methods in Molecular Biology，Vol 132，71-91(1999))，PEOPLE软件(Alix et al.，Vaccine，18(324)：311-314，1999)，BEPITOPE软件(Odorico M et al，J.Mol.Recognit，16：20-22，2003)，Beepred，ABCpred软件(Saha S et al，Proteins，65(1)：40-48，2006)，CEP软件(Kulkarni-Kale U et al，Nucleic Acids Res，33：W168-W171(2005)，DiscTope软件(Haste A P et al，Protein Science，15：2558-2567(2006))，MEPS软件(Castrignano T et al，BMC Bioinformatics，8(Suppl 1)：S6-S10，2007)等。本领域人员可以根据给定的多肽序列选择适合的软件，按照软件开发商的说明或指示，提供相应的序列信息和条件参数，从而获得预测的免疫原性片段。’
在某些实施方式中，可以通过具体的设备和技术来预测给定多肽序列中的免疫原性片段，例如但不限于，X射线晶体衍射技术、核磁共振、质谱等(见Methods in Molecular Biology，Vol 66：Epitope Mapping Protocols，Humana Press，Edited by：Glenn E.Morris，1996)。
在某些实施方式中，还可以制备得到预测的免疫原性片段，并验证其与抗体特异性结合的能力，以确证该预测的免疫原型片段确实具有免疫原性。
本申请提供的免疫原性片段在减毒PRRSV的Nsp2蛋白序列中不具有，但是存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白序列中。通过本领域公知的序列比对方法，可以知道在减毒PRRSV的Nsp2蛋白序列中不存在但是在野生型PRRSV中存在的序列。例如，可以比对减毒PRRSV和野生型PRRSV的Nsp2蛋白序列或核苷酸编码序列，从而获知在野生型PRRSV的Nsp2蛋白中存在但是在减毒PRRSV的Nsp2蛋白中不存在的多肽序列。根据该识别出的多肽序列，可以通过本领域公知的方法预测出其中存在的免疫原性片段。任选地，还可以进一步验证该免疫原性片段的免疫原性。
在某些实施方式中，本申请提供的免疫原性片段在PRRSV TJM株的Nsp2蛋白序列中不具有，但是却存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白序列中。
“PRRSV TJM株”是指保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。PRRSV TJM株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CGMCC No.3121；分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2009年6月15日。PRRSV TJM株的全基因组序列已经被测序，其基因组序列见SEQ ID NO：6，其编码的Nsp2蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：7。
在某些实施方式中，本申请提供的免疫原性片段在SEQ ID NO：7不具有但是存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白序列中。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其含有与SEQ ID NO：1具有至少75％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。
在某些实施方式中，所述与SEQ ID NO：1具有至少75％同源性的多肽片段不存在于PRRSV TJM株的Nsp2蛋白中(或不存在于SEQ ID NO：7中)，但存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白中。SEQ ID NO：1是野生型PRRSV TJ株的Nsp2蛋白中的部分序列，但是减毒PRRSV TJM株的Nsp2蛋白中却缺失了SEQ ID NO：1这段序列。PRRSV TJ株的全基因组序列已公开，见GenBank登录号EU860248，以及SEQ ID NO：5。PRRSV TJ株是美洲型PRRSV毒株，感染猪宿主后会引起猪繁殖与呼吸综合征(见，中国专利ZL200710121202.1)。PRRSV TJ株的Nsp2蛋白序列与多个美洲型PRRSV毒株有高度的同源性，例如，与美洲型标准株VR-2332的Nsp2蛋白序列具有77.9％的同源性。
“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.et al，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
在某些实施方式中，本申请提供的分离的多肽含有与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述分离的多肽含有与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述分离的多肽不包括野生型PRRSV的Nsp2蛋白全长。
在某些实施方式中，所述分离的多肽含有与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽片段中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述免疫原性片段包括至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、或至少14个连续的氨基酸。
在某些实施方式中，所述分离的多肽含有与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段，其中所述免疫原性片段包括至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、或至少14个连续的氨基酸。
在某些实施方式中，本申请提供的分离的多肽能够在体内产生特异性结合所述免疫原性片段的抗体。在某些实施方式中，所述分离的多肽能够被体内的免疫系统识别，并能够诱导免疫系统产生一种或多种抗体，所述抗体能够特异性结合所述多肽中的所述一个或多个免疫原性片段。
在某些实施方式中，本申请提供的多肽能够特异性结合抗体，所述抗体能够识别所述多肽中的所述免疫原性片段。
在某些实施方式中，本申请提供的多肽能够检测样品中是否存在特异性结合所述免疫原性片段的抗体。在某些实施方式中，样品中存在一种或多种抗体，所述抗体能够特异性结合所述多肽中的所述一个或多个免疫原性片段，当所述多肽与样品接触时，所述多肽能够与样品中的所述抗体特异性结合，并使得样品中的所述抗体能够被检测。
在某些实施方式中，本申请提供的分离的多肽含有SEQ ID NO：1中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述免疫原性片段选自：SVKITRPKYSAQAI(SEQ IDNO：2)、GHLQKEKEA(SEQ ID NO：3)和PRTPAPSVSAESDLT(SEQ ID NO：4)。在某些实施方式中，所述免疫原性片段是SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)。
本发明提供的所述分离的多肽可以通过本领域公知的任何适当的方法获得，例如但不限于，通过化学合成的方法和生物重组表达的方法等。
本申请提供的所述多肽可以通过本领域公知的适用的化学方法合成，例如，但不限于，基于液相的多肽合成方法和基于固相的多肽合成方法等(见，例如，Michael W.Pennington，Peptide synthesis protocols，Methods in molecular biology，volume 35，published by HumanaPress，1994；John M.Waler et al.，Molecular biomethods handbook，Chapter 32，published bySpringer，2008)。
本申请提供的所述多肽还可以通过生物重组表达的方法获得。例如，可以将编码所述多肽的多核苷酸序列引入适当的表达宿主中(例如原核细胞如大肠杆菌、或真核细胞如酵母细胞或哺乳动物细胞等)，并在适于所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞。在某些实施方式中，可以将含有编码所述多肽的核苷酸序列的表达载体(例如质粒)，引入到适当的表达宿主中进行表达。重组表达产生的所述多肽可以通过任何适当的方式回收，例如但不限于，裂解表达宿主并从裂解液中回收，或者收集培养物的上清液并从上清液中回收表达得到的所述多肽。任选地，还可以通过本领域公知的任何适当的方法分离和/或纯化所述的多肽，例如，但不限于，分子排阻色谱法、亲和柱层析法、离子交换柱层析法等(见，例如，Deutscher，Methods in enzymology，182(1990)；Scopes，Protein purification：Principlesand Practices，Springer-Verlag，New York(1982))。
在某些实施方式中，本申请提供的所述分离的多肽可以与载体物质相结合。本领域人员可以根据实际的需要将本申请提供的多肽与适合的载体物质相结合，例如，通过缀合的方式(conjugating)、通过偶联的方式(coupling)、或通过融合蛋白的方式相结合。在某些实施方式中，载体物质有助于提高本申请的多肽的免疫原性。例如，结合有载体物质的本申请的多肽可以更有效地刺激免疫系统，从而有助于产生特异性针对本申请多肽的抗体。在某些实施方式中，载体物质有助于提高本申请多肽的分子量。例如，具有适当分子量的本申请的多肽可以更容易被免疫系统识别，或者更容易固定在固相载体上，或者更适用于样品的检测。在某些实施方式中，载体物质有助于本申请多肽的分离和纯化。例如，可以使用商业可获得的分离纯化方法来纯化带有载体物质的本申请的多肽。在某些实施方式中，载体物质还可以有助于本申请多肽的重组表达和/或输出。例如，带有载体物质的本申请的多肽可以被分泌到重组表达宿主的细胞外或者周质中，从而有助于本申请多肽的表达和收集。在某些实施方式中，载体物质还可以有助于增加或降低本申请多肽的溶解度。本领域技术人员理解，所有适用于上述实际需要的载体物质都在本申请的范围内。
在某些实施方式中，所述载体物质可以是载体蛋白。适用的载体蛋白的例子可以包括，但不限于，白蛋白、匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、亲合素、链霉亲合素、甲状腺球蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、和壳多糖结合蛋白等。
在某些实施方式中，所述载体物质可以是聚合物。适用的载体聚合物的例子可以包括，但不限于，多聚氨基酸(例如，多聚组氨酸、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸等)、聚乙二醇、Ficoll、葡聚糖、和树形聚合物(dendrimer)等。
本领域技术人员可以通过公知的任何适当的方法将本申请提供的多肽与适合的载体物质相结合，例如，但不限于，通过化学方法(例如，使用双功能偶联剂，见，例如，SusanHockfield，Selected methods for antibody and nucleic acid probes，published by CSHL Press，1993，page 72-75；John D.Pound，Immunochemical Protocols，published by Humana Press，1998，page 74-78；J.Mark Carter，The protein protocols handbook，Part VII，1996，page679-687；Francesco M.Veronese，Biomaterials，22：405-417(2001)；Greg T.Hermanson，Bioconjugate techniques，published by Academic Press，2008，page 754-757)或生物重组表达的方法(例如，表达成融合蛋白，见，例如，S.J.Higgins etal.Protein expression：a practicalapproach，published by Oxford University Press，1999，page 174-199)。
在某些实施方式中，本申请提供的所述多肽还可以与佐剂组成免疫原性组合物。佐剂可以保护抗原不受体内破坏，和/或非特异性地刺激免疫系统，从而有助于增强对所述多肽的免疫反应。佐剂的例子包括，但不限于，矿物盐类(例如，氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化钙)、油包水乳剂(例如，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等)、皂苷类(saponin)佐剂(如：StimulonTM等)、细菌或微生物衍生物类(如，脂多糖、脂A衍生物(lipid A derivatives)等)、和微粒(如聚-α羟基酸等)。
含有本发明多肽的检测试剂和检测方法
在另一方面，本申请提供了一种检测试剂，其包含本申请提供的分离的多肽。所述检测试剂中可以含有适当量的、适当纯度的、和/或适当浓度的所述分离的多肽，使得所述检测试剂中的多肽能够用于实现检测的目的。在某些实施方式中，所述检测试剂可以含有冻干形式的或溶于适当溶剂的所述多肽。在某些实施方式中，所述检测试剂中还可以进一步含有适当的辅料，例如但不限于，适当的缓冲剂、适当的防腐剂、适当的蛋白等。
在另一方面，本发明还提供了一种检测装置，其包括含有所述多肽的所述检测试剂，并且所述检测试剂附着在固相支持物上。在某些实施方式中，所述固相支持物可以是任何适用于检测并且适用于附着所述检测试剂的材料。例如，但不限于，塑料板、塑料盘、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、玻璃板、小珠等。
所述检测试剂可以以任何适当的方式附着在适当的固相支持物上，例如但不限于，通过固定、包被、吸附、喷涂、打印等方式附着。在某些实施方式中，可以将含有检测试剂的溶液与固相支持物接触一段时间，然后除去接触后的检测试剂溶液。在某些实施方式中，可以将含有检测试剂的溶液、混悬液或乳液等喷在或涂在固相支持物上，再通过干燥等方式除去检测试剂中的溶剂成分。在某些实施方式中，还可以将所述检测试剂印在或压制在所述固相支持物上。
在另一方面，本发明还提供了一种检测样品中抗体的方法，所述样品来自疑似被PRRSV感染的猪，该方法包括将所述样品与本发明提供的分离的多肽接触，并检测所述样品中是否存在与所述多肽特异性结合的抗体。
可以使用本领域已知的任何适当的检测方法来检测所述多肽与样品中抗体的特异性结合。
在某些实施方式中，所述检测方法可以使用夹心法(Sandwich method)的检测原理。可以将未标记的捕获分子(如：本申请提供的多肽)固定在固相载体上，然后加入含有待测抗体的样品并接触足够长的时间，使样品中的抗体与捕获分子充分结合，再加入能够特异性结合待测抗体的检测抗体，从而形成捕获分子-待测抗体-检测抗体的三联体复合物。通过检测该三联体复合物中的检测抗体产生的信号，可以间接检测样品中的待测抗体。
检测抗体可以是抗猪的抗体。抗猪抗体可以是其他物种产生的针对猪抗体的抗体。可以用作检测抗体的抗猪抗体例如，但不限于，小鼠抗猪抗体、大鼠抗猪抗体、兔抗猪抗体、羊抗猪抗体、鸡抗猪抗体、和驴抗猪抗体等。抗猪的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。抗猪的抗体可以通过商业途径购得，或者也可以通过常规的抗体制备方法制备得到(见，例如：Harlow等，Antibodies：A laboratory manual，Cold Spring Harbor，1988)。
检测抗体可以带有标记物。在本申请中，术语“标记物”是指可以被直接或间接检测的分子。某些标记物可以直接产生可检测的信号，如颜色、发光、荧光、放射性等；某些标记物可以与特定的物质反应(如：酶与底物的反应)，并产生可检测的信号如颜色改变、荧光、发光等，从而得以被间接检测。标记物可以是酶、荧光物质、化学发光物质、放射性物质、有色物质等。
在某些实施方式中，所述检测方法可以使用直接检测法的检测原理。可以将本发明提供的多肽与标记物结合，并使所述标记的多肽与样品中的待测抗体特异性结合，形成标记的多肽-抗体复合物。通过检测该复合物中的标记物，可以检测样品中的待测抗体。
在某些实施方式中，所述检测方法还可以使用竞争结合的检测原理。可以使用带有标记物的竞争结合物，使其干扰本申请所述多肽和样品中所述待测抗体的特异性结合，并与待测抗体或本申请所述多肽形成复合物，通过测定该复合物中竞争结合物的标记物信号，可以获得样品中待测抗体的信息。
在某些实施方式中，可以使用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)、免疫荧光法、化学免疫发光法、免疫放射法、免疫层析法、免疫渗滤法等来检测本发明所述多肽与样品中抗体的特异性结合。
在某些实施方式中，可以使用ELISA检测样品中的待测抗体。例如，可以将本发明提供的多肽或检测试剂固定在固相支持物上，并使其与样品(例如，PRRSV感染的猪的血液或血清)充分接触以形成捕获分子-待测抗体复合物，然后加入酶标记的检测抗体，该检测抗体可以特异性结合待测抗体(例如，羊抗猪抗体)，允许检测抗体与待测抗体反应足够长的时间以形成捕获分子-待测抗体-检测抗体的三联复合物，再加入足量的底物，使其与在适当的条件下与检测抗体上标记的酶充分反应，然后检测反应后的底物的信号变化，该信号变化间接指示样品中待测抗体的存在和/或含量。
在某些实施方式中，检测抗体上标记的酶可以催化底物反应并改变底物的颜色。底物的颜色改变可以通过分光光度计、酶标仪等仪器检测。在某些实施方式中，检测抗体上标记的酶可以改变底物的荧光或者通过化学反应产生发光，这样的底物信号可以通过发光检测仪或荧光检测仪进行检测。在某些实施方式中，可以使用的酶的例子包括，但不限于，荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、细菌荧光素酶等)、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶、脲酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶等)、杂环氧化酶等。可以使用本领域公知的技术将酶标记到检测抗体上，例如，见P.Tijssen，Practice and theory of enzymeimmunoassays，Volume 15，Chapter 11，published by Elsevier，1985；O′Sullivan et al.，Methodsfor the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，inMethods in Enzym.(ed J.Langone & H.Van Vunakis)，published by Academic press，New York，73：147-166(1981)。
在某些实施方式中，可以使用免疫荧光法检测样品中的待测抗体。例如，可以使用双抗体夹心法的原理，形成捕获分子-待测抗体-检测抗体的三联体复合物，其中的检测抗体带有荧光染料标记。通过检测三联体复合物中的荧光染料发出的荧光信号，可以间接指示样品中待测抗体的存在和/或含量。检测抗体上的荧光信号可以通过本领域公知的方法进行检测，例如，但不限于，荧光显微镜、荧光检测仪等。可以使用的荧光染料例如，但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(TRITC)、荧光素、二氯三嗪基氨基荧光素(DATF)、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、LRSC(lissamine-rhodamine sulfonyl chloride)、丹磺酰氯、德州红、R-藻红蛋白等。可以使用本领域公知的任何适当的方法将荧光染料标记在检测抗体上，例如，见，Wulf Storch，Immunofluorescence in clinical immunology：a primer and atlas，published by Birkhauser，Chapters 2 and 3(2000)。
在某些实施方式中，可以使用化学免疫发光法检测样品中的待测抗体。例如，可以使用双抗体夹心法的原理，形成捕获分子-待测抗体-检测抗体的三联体复合物，其中的检测抗体带有化学发光物质标记。通过检测三联体复合物中的化学发光物质发出的光信号，可以间接指示样品中待测抗体的存在和/或含量。检测抗体上的化学发光信号可以通过本领域公知的方法进行检测，例如，但不限于，使用催化剂和/或氧化剂以诱导化学发光物质的氧化和发光，并用化学发光检测仪检测其发光信号。可以使用的化学发光物质例如，但不限于，鲁米诺(luminol)及其衍生物、异鲁米诺(iso-luminol)、吖啶酯及其衍生物、三联吡啶钌等。可以使用本领域公知的任何适当的方法将化学发光物质标记在检测抗体上，例如，见，J.Stuart Woodhead et al.，Pure & Appl.Chem.，57(3)：523-529(1985)；D.M.Kemeny，ELISA and other solid phase immunoassays：theoretical and practical aspects，published by JohnWiley and Sons，1988；Aldo Roda，Chemiluminescence and Bioluminescence：Past，Present andFuture，published by Royal Society of Chemistry，2010。
在某些实施方式中，可以使用免疫放射法检测样品中的待测抗体。例如，可以将本发明提供的多肽用放射性元素标记，然后与含有待测抗体的样品接触并充分反应，分离得到特异性结合的抗原抗体复合物，并检测其放射性。放射性信号可以指示样品中待测抗体的存在和/或含量。放射性信号可以通过本领域公知的任何适当的方法检测，例如但不限于，放射性计数仪、闪烁计数仪、γ计数仪等。可以使用的放射性标记物例如，但不限于，122I、123I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y等。可以使用本领域公知的任何适当的方法将放射性物质标记在本发明提供的多肽上，例如，见，M.Holtzhauer，Basicmethods for the biochemical lab，Springer Lab Manuals，Chapter 6，2006。
在某些实施方式中，可以使用免疫层析法检测样品中的待测抗体。例如，可以将本发明提供的多肽固定在免疫层析的固相载体上，使样品中的待测抗体与标记物质结合，并使标记后的待测抗体朝向固定有所述多肽的方向进行层析泳动，当样品中的待测抗体接触到所述固定的多肽时，会因特异性结合而被固定的多肽截留。被截留的待测抗体由于带有标记物，会在被截留的区域形成可视的印迹或条带，通过目测即可识别。免疫层析法中可以使用的标记物例如，但不限于，胶体金标记的检测抗体、胶体银标记的检测抗体等。可以使用本领域公知的任何适当的制备适用于免疫层析法的标记物，例如，可以将检测抗体与金属胶体溶液在适当的条件下混合，并分离得到金属胶体物标记的检测抗体(见，例如，G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，published by Academic Press，page 919-936，2008)。
在某些实施方式中，可以使用免疫渗滤法检测样品中的待测抗体。例如，可以将本发明提供的多肽固定在免疫渗滤的固相载体上，加入含有待测抗体的样品并使其充分反应形成多肽-抗体复合物，然后加入标记物，充分反应后在加样反应区滴加入洗涤液，洗涤液在渗滤的作用下滤过固相载体，多肽-抗体-标记物复合物被截留在固相载体上。通过检测复合物中的标记物的信号，可以间接指示样品中待测抗体的存在和/或含量。可以使用的标记物例如，但不限于，金属胶体物标记的蛋白或抗体，酶标记的蛋白或抗体等。标记物的信号可以通过适当的方法检测，例如，当标记物是胶体金标记的抗体时，可以直接目测识别，当标记物是酶标记的检测抗体时，可以加入酶的底物使其充分反应后再目测识别。
在另一方面，本发明提供了一种区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪的方法，所述方法包括：用所述猪的样品接触本发明提供的多肽，以及检测所述样品中是否存在与本发明提供的所述多肽特异性结合的抗体。如果样品中存在与本发明提供的所述多肽特异性结合的抗体则表明该样品来自于被所述野生型PRRSV感染的猪。如果样品中不存在与本发明提供的所述多肽特异性结合的抗体，则表明该样品没有被感染或被减毒PRRSV感染。
在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒的美洲型PRRSV。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同源性的多核苷酸分子，并且该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同源性的多核苷酸分子，该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的多肽。
在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒的PRRSV活疫苗。在某些实施方式中，所述PRRSV减毒活疫苗含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
在某些实施方式中，所述野生型PRRSV是美洲型PRRSV。在某些实施方式中，所述野生型PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述野生型PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。
在某些实施方式中，所述猪的样品可以是任何含有待测抗体的猪的样品，包括但不限于，血液、血浆、体液等。在某些实施方式中，所述猪的样品是猪的血液或血浆。
在另一方面，本申请还提供了将本发明的多肽用于制备检测试剂的用途。
在某些实施方式中，所述检测试剂能够用于检测样品中抗体，所述样品来自被PRRSV感染的猪。在某些实施方式中，可以用所述检测试剂通过适当的检测方法检测样品中的抗体，所述方法包括将所述样品与本发明提供的分离的多肽接触，并检测所述多肽与样品中抗体的特异性结合。
在某些实施方式中，所述检测试剂能够用于区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪。在某些实施方式中，可以用所述检测试剂通过以下方法区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪，所述方法包括：用所述猪的样品接触本发明提供的多肽，以及检测所述样品中是否存在与本发明提供的所述多肽特异性结合的抗体，其中样品中存在与本发明提供的所述多肽特异性结合的抗体则表明该样品来自于被所述野生型PRRSV感染的猪。
抗体
在另一方面，本申请还提供了一种分离的抗体，其能够特异性结合本发明提供的多肽中的免疫原性片段。
在本申请中，术语“抗体”应理解为包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性(双价)抗体、以及抗原结合片段，例如但不限于，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)，双价单链抗体(BsFv)、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体、或任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段。
本领域技术人员能够通过本领域公知的任何适合的方法制备得到所述分离的抗体。
例如，如果要制备多克隆抗体，可以用含有本发明多肽的抗原物质以合适的频率或间隔对合适的动物(例如，鼠、兔、羊、猪、牛等)进行免疫(例如，通过注射的方式)。通过收集并处理被免疫动物的血清，可以获得本发明的分离的多克隆抗体。也可以进一步通过分离纯化的步骤(例如，通过免疫亲和柱层析法)筛选得到能够特异性结合本发明多肽的多克隆抗体，或者获得所需纯度的本发明的多克隆抗体。多克隆抗体的制备和纯化在本领域早已是公知技术，具体可以参见：Harlow等，Antibodies：A laboratory manual，ColdSpring Harbor，1988。
再例如，如果要制备单克隆抗体，可以用含有本发明多肽的抗原物质以合适的频率或间隔对合适的动物(例如，鼠、兔、羊、猪、牛等)进行免疫(例如，通过注射的方式)，获取被免疫动物的B细胞并通过杂交瘤技术制得单克隆抗体(见，例如，Harlow等，Antibodies：A laboratory manual，Cold Spring Harbor，1988；Monoclonal Antibody production，published by National academies Press，1999；J.Eryl Liddell et al.，A practical guide tomonoclonal antibodies，published by John Wiley and Sons，1991)。为获得特异性结合本发明多肽的单克隆抗体以及具有期望性质的单克隆抗体，例如，具有较高的亲和力、较好的特异性等，可以使用本领域公知技术筛选获得的单克隆抗体，例如，使用ELISA方法、免疫印迹法、免疫组化的方法等(见，例如，J.Eryl Liddell et al.，A practical guide to monoclonalantibodies，published by John Wiley and Sons，1991)。还可以通过噬菌体展示技术来获得和筛选特异性结合本发明多肽的单克隆抗体，见，例如，Philippa M.O’Brien et al.，Antibody phagedisplay：methods and protocols，published by Humana Press，2002；Kay et al.，Phage display ofpeptides and proteins：A laboratory manual，San Diego：Academic Press，1996。
再例如，可以通过本领域公知的方法制备抗原结合片段，例如，但不限于，用蛋白酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解抗体，或者将编码抗原结合片段的多核苷酸导入适当的表达宿主进行重组表达以获得期望的抗原结合片段。
制得的抗体可采用适当的纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、以及硫酸铵沉淀等，见，例如James W.Goding，Monoclonal antibodies：principles and practice，published by Academic Press，1996。在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
在某些实施方式中，本发明提供的抗体进一步带有结合物(见，例如，″ConjugateVaccines″，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse and R.E.Lewis，Jr.(eds.)，Carger Press，New York，(1989))。结合物可以以任何适当的方式与本发明提供的抗体连接，例如但不限于，通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合(coordinate binding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体连接。在某些实施方式中，本发明公开的抗体可以通过工程的方法使其含有表位结合部分以外的特定位点，这些位点可用来结合一种或多种结合物。例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸残基、组氨酸残基，用于协助与标记物的共价连接。在某些实施方式中，抗体可间接连于结合物，或通过另一个结合物相连。例如，所述抗体或其抗原结合片段可结合生物素，然后间接结合第二个结合物，其与亲和素相连。
在某些实施方式中，所述结合物是标记物。在某些实施方式中，所述标记物可以是荧光标记物、化学发光标记物、放射性标记物、酶标记物或有色物质标记物。荧光标记物的例子包括，但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(TRITC)、荧光素、二氯三嗪基氨基荧光素(DATF)、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、LRSC(lissamine-rhodamine sulfonyl chloride)、丹磺酰氯、德州红、R-藻红蛋白。化学发光标记物的例子包括，但不限于，鲁米诺(luminol)及其衍生物、异鲁米诺(iso-luminol)、吖啶酯及其衍生物、三联吡啶钌。放射性标记物的例子包括，但不限于，122I、123I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y等。酶标记物的例子包括，但不限于，荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、细菌荧光素酶等)、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶、脲酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶等)、杂环氧化酶等。有色物质标记物的例子包括，但不限于，胶体金、胶体银等。
含有本发明抗体的检测试剂和检测方法
在另一方面，本发明还提供了一种检测试剂，其包含了本发明提供的分离的抗体。所述检测试剂中可以含有适当量的、适当纯度的、和/或适当浓度的所述分离的抗体，使得所述检测试剂中的抗体能够用于实现检测的目的。在某些实施方式中，所述检测试剂可以含有冻干形式的或溶于适当溶剂的所述抗体。
在另一方面，本发明还提供了一种检测装置，其包括含有所述抗体的所述检测试剂，并且所述检测试剂附着在固相支持物上。所述固相支持物可以是任何适用于检测并且适用于附着所述检测试剂的材料。所述检测试剂可以以任何适当的方式附着在适当的固相支持物上，例如但不限于，通过固定、包被、吸附、喷涂、打印等方式附着。
在另一方面，本发明还提供了一种检测样品中PRRSV存在的方法，所述样品来自疑似被PRRSV感染的猪，所述方法包括将所述样品与本发明提供的分离的抗体接触，并检测所述样品中是否存在与所述抗体特异性结合的抗原。
在某些实施方式中，所述PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。
所述抗体与样品中所述PRRSV中的抗原的特异性结合可以通过本领域公知的任何适合的方法检测，例如但不限于，基于夹心法的检测方法、基于直接检测法的方法和基于竞争结合的检测方法。例如，本领域技术人员可以使用前述的ELISA方法、免疫荧光法、化学免疫发光法、免疫放射法、免疫层析法、免疫渗滤法和免疫组织化学等方法来检测本发明所述抗体与样品中所述PRRSV抗原的特异性结合(见，例如，Frederick A.Murphy et al.，Veterinary virology，published by Elsevier，1999)。
在某些实施方式中，可以使用ELISA方法，通过夹心法的原理检测样品中PRRSV存在。例如，可以使用未标记的本发明的抗体作为捕获分子，捕获样品中的PRRSV抗原，再加入带有酶标记物的检测抗体，其可以特异性结合被捕获的抗原，形成捕获分子-PRRSV抗原-检测抗体的三联复合物，最后加入酶的底物与三联复合物中的酶反应，通过检测底物发出的信号可以获知样品中PRRSV的存在。也可以使用直接检测法的原理检测样品中PRRSV存在。例如，可以使用带有标记物的本发明的抗体，允许其与样品接触足够长时间以充分结合，再检测特异性结合的抗原-抗体复合物中的标记物产生的信号。再例如，可以使用带有生物素标记的本发明的抗体，允许其与样品中的PRRSV抗原形成特异性结合的复合物，再加入亲和素标记的酶，使其与生物素标记的本发明的抗体特异性结合，然后加入酶的底物，并检测该底物产生的信号，从而获知样品中PRRSV抗原的存在。
在某些实施方式中，可以使用免疫荧光法、化学免疫发光法、免疫放射法等，其工作原理与ELISA的方法相类似，区别在于检测物质上的标记物是荧光染料、化学发光物质或放射性物质，并且根据标记物的不同而选用相应的检测设备进行检测，例如，用荧光显微镜、荧光检测仪、化学发光检测仪、或γ计数仪进行检测。
在某些实施方式中，可以使用免疫层析法检测样品中PRRSV抗原的存在。例如，可以将本发明提供的抗体固定在免疫层析的固相载体上，使样品中的PRRSV抗原与标记物质结合并在所述固相载体上朝所述抗体的方向进行层析泳动，被固定的抗体能够截留带有标记物的PRRSV抗原，从而使得该抗原被检测到。免疫层析法还可以使用阳性对照物质。还可以使用免疫渗滤法，其工作原理与免疫层析法类似，区别在于通过基于渗滤的步骤而非层析的步骤分离特异性结合的抗原-抗体复合物。
在某些实施方式中，还可以使用免疫组织化学的方法检测样品中PRRSV抗原的存在。例如，可以将待测样品进行固定(见，例如，″Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology，″3rd edition(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP)Editor，TheBlakston Division McGraw-Hill Book Company，New York)，再将其与本发明的抗体接触并特异性结合。如果使用的本发明的抗体带有标记物，则可以直接通过检测标记物来获知样品中PRRSV抗原的存在。如果使用的本发明的抗体不带有标记物，则可以加入能够特异性结合本发明抗体的带有标记物的检测抗体，以形成抗原-本发明抗体-检测抗体的三联复合物，通过检测三联复合物中的标记物的信号，可以获知样品中PRRSV抗原的存在。
在另一方面，本发明还提供了用本发明提供的抗体区分经PRRSV疫苗免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪的方法，所述方法包括：用所述猪的样品接触本发明提供的抗体，以及检测所述样品中是否存在与所述抗体特异性结合的抗原。如果所述样品中存在与所述抗体特异性结合的抗原，则表明该样品来自于被所述野生型PRRSV感染的猪。如果样品中不存在与本发明提供的所述多肽特异性结合的抗体，则表明该样品来自于未感染的猪或被减毒PRRSV感染的猪。
在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒的美洲型PRRSV。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同源性的多核苷酸分子，并且该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同源性的多核苷酸分子，该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的多肽。
在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒的PRRSV活疫苗。在某些实施方式中，所述PRRSV减毒活疫苗含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
在某些实施方式中，所述野生型PRRSV是美洲型PRRSV。在某些实施方式中，所述野生型PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述野生型PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。
在某些实施方式中，所述猪的样品可以是任何含有PRRSV抗原的猪的样品，包括但不限于，血液、血浆、体液、分泌物、排泄物、组织样品等。在某些实施方式中，所述猪的样品是猪的血液、血浆、呼吸道分泌物、排泄物等。
在另一方面，本申请还提供了将本发明的抗体用于制备检测试剂的用途。
在某些实施方式中，所述检测试剂能够用于检测样品中的PRRSV抗原，所述样品来自被PRRSV感染的猪。在某些实施方式中，可以用所述检测试剂通过适当的检测方法检测样品中的PRRSV抗原，所述方法包括将所述样品与本发明提供的分离的抗体接触，并检测所述抗体与样品中PRRSV抗原的特异性结合。
在某些实施方式中，所述检测试剂能够用于区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪。在某些实施方式中，可以用所述检测试剂通过以下方法区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪，所述方法包括：用所述猪的样品接触本发明提供的抗体，以及检测所述样品中是否存在与本发明提供的所述抗体特异性结合的PRRSV抗原，其中样品中存在与本发明提供的所述抗体特异性结合的PRRSV抗原则表明该样品来自于被所述野生型PRRSV感染的猪。
试剂盒
在另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括本发明所述的分离的多肽，其中所述多肽附着在固相支持物上。
在某些实施方式中，试剂盒中含有的本发明所述的多肽含有Nsp2蛋白序列中的一个或多个免疫原性片段，该免疫原性片段在减毒PRRSV的Nsp2蛋白序列中不具有，但是存在于野生型PRRSV的Nsp2蛋白序列中。在某些实施方式中，试剂盒中含有的本发明所述的多肽含有与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。在某些实施方式中，所述免疫原性片段包括至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。
所述固相支持物可以是任何适用于检测并且适用于附着所述检测试剂的材料。例如，但不限于，塑料板、塑料盘、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、玻璃板、小珠等。所述多肽可以以任何适当的方式附着在适当的固相支持物上，例如但不限于，通过固定、包被、吸附、喷涂、打印等方式附着。附着在固相支持物上的本发明的多肽能够实现用于检测的目的，例如，附着足够牢固，附着的量足够多等。本领域技术人员可以根据适用的检测方法，根据现有技术中已知的附着方法进行选择。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括一种检测抗体。检测抗体可以以任何适当的方式在试剂盒中提供，包括但不限于，冻干粉末形式，溶液形式等。在某些实施方式中，所述检测抗体是抗猪抗体，例如，但不限于，小鼠抗猪抗体、大鼠抗猪抗体、兔抗猪抗体、羊抗猪抗体、鸡抗猪抗体、和驴抗猪抗体等。
所述检测抗体可以进一步带有标记物，例如但不限于，酶、荧光物质、化学发光物质、放射性物质、有色物质等。例如，所述带有标记物的检测抗体可以是，酶标抗体、荧光标记的检测抗体、化学发光物质标记的检测抗体、放射性物质标记的检测抗体、胶体金标记的抗体等。可选地，在某些实施方式中，所述试剂盒还进一步包括标记物的检测分子，例如，酶的底物、底物显色液、和显色终止液等。
任选地，所述试剂盒中还可以进一步包括一种或多种用于检测和/或区分的试剂，例如但不限于，样品稀释液、样品洗涤液、标准阳性血清、和标准阴性血清等。任选地，所述试剂盒中还可以进一步包括一种或多种便于试剂盒储存的试剂，例如但不限于干燥剂等。所述试剂盒还可以具有使用说明书，其包括所述试剂盒的使用方法、储存方法、或注意事项等内容。
在某些实施方式中，所述试剂盒还可以进一步包括一种减毒PRRSV疫苗制剂。所述减毒PRRSV可以是减毒的美洲型PRRSV。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同源性的多核苷酸分子，并且该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同源性的多核苷酸分子，该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的多肽。
在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是减毒的PRRSV活疫苗。在某些实施方式中，所述PRRSV减毒活疫苗含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
所述试剂盒中的减毒PRRSV可以以任何适用于动物免疫的形式提供。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是无菌的制剂。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV是冻干的无菌制剂。在某些实施方式中，所述减毒PRRSV进一步含有冻干保护剂。冻干保护剂有助于在冻干制备过程中保护减毒PRRSV的活性。冻干保护剂可以含有任何适合的成分，例如但不限于，蔗糖、L-谷氨酸钠、水解乳白蛋白、和明胶等。
所述试剂盒中的减毒PRRSV可以用本领域公知的方法制得。例如，可以将减毒PRRSV在适合其生长的细胞中(例如，Marc-145细胞)培养扩增，当培养细胞表现出一定程度的细胞病变时收获病毒液。任选地，可以进一步将收获的减毒PRRSV与适合的辅料混合，例如但不限于，冻干保护剂、防腐剂等。辅料可以是无菌的。
寡核苷酸引物
在另一方面，本发明还提供了可用于检测样品中PRRSV存在的寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物可以用于扩增样品中的多核苷酸模板(如，cDNA模板)，通过分析扩增产物，从而可以分析样品中是否存在PRRSV，或者存在的PRRSV是否具有某些特定的序列缺失。
“引物”在本申请中是指一段寡核苷酸分子，其长度在10-38个核苷酸之间，优选地在15-30个核苷酸之间，或15-25个核苷酸之间，或17-25个核苷酸之间。引物通常用于在聚合酶链式反应(PCR)中扩增DNA序列。可以在一段待扩增的DNA模板序列的5’上游和3’下游各设计一条引物，即，5’引物和3’引物，其能够与DNA双链分别特异性杂交。5’引物与待扩增的DNA模板序列的反义链互补；3’引物与待扩增的DNA模板序列的正义链互补。本领域公知，DNA模板序列的“正义链”的序列与转录得到的编码蛋白的mRNA的序列相同，在本申请中，SEQ ID NOs：5-6，8-19都是正义链DNA。正义链的互补序列即为“反义链”，因此，与SEQ ID NOs：5-6，8-19互补的所有序列都是反义链DNA。
“杂交”在本申请中是指引物与模板DNA之间通过碱基配对形成氢键。“特异性杂交”在本申请中是指引物与模板DNA之间通过碱基配对形成足够多的氢键，使得对模板DNA的扩增得以进行。在某些实施方式中，所述引物中至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的核苷酸与模板DNA之间形成氢键。在某些实施方式中，所述引物与模板DNA互补。“互补”在本申请中可以与“特异性杂交”互换使用。
可以通过PCR反应，用引物扩增DNA模板上的序列。PCR反应通常包括多个反应循环，每个循环包括DNA双链退火、引物杂交和引物延伸等步骤。在退火温度下，DNA模板双链解开成单链，5’引物和3’引物分别与两条DNA模板单链特异性杂交，5’引物杂交的模板序列称为5’上游序列和3’引物杂交的模板序列称为3’下游序列。然后DNA聚合酶在两条引物的3’端依次添加与DNA模板互补的核苷酸，以合成与两条DNA模板链分别互补的新的DNA链。新合成的DNA链在下一个反应循环中又可以作为新的DNA模板，进行新一轮的DNA合成。因此，通过PCR反应，可以使在5’上游序列和3’下游序列之间的DNA模板序列(即，待扩增序列)得到指数级的扩增，得到的产物通常称为扩增产物。一般而言，扩增产物的长度应大于等于5’引物和3’引物的长度之和。扩增产物的DNA正义链的5’端序列起始点为5’引物序列，扩增产物的DNA反义链的5’端序列起始点为3’引物序列。
在某些实施方式中，本申请提供的寡核苷酸引物的待扩增序列包括了Nsp2蛋白的至少部分编码序列，该编码序列在减毒PRRSV的Nsp2编码序列中不具有，但是存在于野生型PRRSV的Nsp2编码序列中。
在某些实施方式中，本申请提供的寡核苷酸引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列。“传统型PRRSV”在本申请中是指，与PRRSV美洲型标准株VR-2332相比，该PRRSV的Nsp2编码序列基本上不具有核苷酸的缺失。“基本上不具有……缺失”在本申请中是指缺失的核苷酸数目小于等于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、或3个。传统型PRRSV可以是已知序列的PRRSV，例如但不限于，PRRSV VR-2332株和16244B株(Genbank登录号：AF046869)。
在某些实施方式中，本申请提供的寡核苷酸引物能够鉴别高致病性的PRRSV。“高致病性的PRRSV”在本申请中是指，与PRRSV美洲型标准株VR-2332相比，该PRRSV的Nsp2编码序列缺失了90个不连续的核苷酸(见，例如，图1，图2，Tian et al.PLoS ONE2(6)：e526，(2007)doi：10.1371)，且其Nsp2编码序列基本上不具有其他缺失。在某些实施方式中，所述90个不连续的核苷酸位于VR-2332毒株的Nsp2编码基因的第1441-1443位、和第1609-1695位氨基酸。已经发现，在中国多个省份分离到的高致病性PRRSV毒株中都具有类似的90个核苷酸不连续缺失，而且具有该种90个核苷酸不连续缺失的PRRSV毒株被认为比标准毒株更强的致病性(见，例如，Tian et al，PLoS ONE 2(6)：e526，(2007)doi：10.1371)。在某些实施方式中，本申请提供的寡核苷酸引物能够鉴别样品中的PRRSV是否具有所述90个不连续的核苷酸，进而可以样品中存在的PRRSV的致病性强弱。
在某些实施方式中，本申请提供的寡核苷酸引物能够鉴别减毒的PRRSV。如前所述，减毒的PRRSV在其Nsp2编码序列中存在能够使其致病性减弱的序列缺失。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV在其Nsp2编码序列中缺失了一段长为360个核苷酸的片段，该片段编码与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的多肽。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV在其Nsp2编码序列中基本上不具有其他的缺失。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV在其Nsp2编码序列中可以进一步缺失其他核苷酸序列。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV在其Nsp2编码序列中可以进一步缺失所述90个不连续的核苷酸。在某些实施方式中，所述PRRSV减毒的PRRSV为含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV(即，PRRSVTJM株)。
在某些实施方式中，本申请提供了第一组分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NOs：8-10，以及与SEQ ID NOs：8-10之一具有至少80％同源性的序列，且所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：13-19的序列，以及与SEQ ID NOs：13-19之一具有至少80％同源性的序列；其中所述5’引物和所述3’引物的长度分别在10-38个核苷酸之间；且所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。所述引物在Nsp2编码序列上的相对位置见图1(b)。
在某些实施方式中，本申请提供了使用所述第一组分离的寡核苷酸引物检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：使用所述第一组分离的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；使用所述第一组分离的寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者存在的PRRSV为减毒PRRSV；如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约90个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为高致病性的PRRSV；如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸或450个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
本领域人员能够理解，当样品中不存在PRRSV时，由于没有对应的模板，所述引物组合无法通过PCR反应得到扩增产物。当样品中存在的PRRSV缺失了SEQ ID NO：13时，与SEQ ID NO：13互补的3’引物无法与样品中的模板杂交，从而无法扩增得到对应的DNA单链，因此也不能得到双链的扩增产物。当样品中存在的PRRSV缺失了SEQ IDNO：13时，与SEQ ID NO：13的3’下游区域互补的3’引物和上述的5’引物能够通过PCR扩增得到扩增产物，但是该扩增产物不含有SEQ ID NO：13，因此理论上应该比传统型PRRSV的扩增产物短约360bp。同理，当样品中存在的PRRSV既缺失了90个不连续的核苷酸又缺失了SEQ ID NO：13时，通过上述引物组合得到的扩增产物理论上应该比传统型PRRSV的扩增产物短约450bp。当样品中存在的PRRSV只缺失了90个不连续的核苷酸时，得到的扩增产物理论上应该只比传统型PRRSV的扩增产物短约90bp。通过对扩增产物的分子量的检测或分析，可以很容易地知道样品中的PRRSV在Nsp2的核苷酸序列中是否存在缺失以及缺失片段的大小，再根据这些缺失片段所对应的生物学性质，进而可以判断样品中的PRRSV的致病性。例如，与传统型PRRSV的扩增产物相比，仅缺失90bp片段的PRRSV很可能是高致病型PRRSV，仅缺失360bp片段的PRRSV很可能是减毒的PRRSV，而缺失450bp片段的PRRSV很可能也是减毒的PRRSV。根据对样品中PRRSV的致病性的判断，可以对畜群进行相应的隔离措施，将感染传统型和高致病型PRRSV的猪与未感染或感染减毒PRRSV的猪进行分离，从而防止致病性病毒的传播，有助于减少可能的经济损失。
在某些实施方式中，本申请提供了第二组分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：11和与之具有至少80％同源性的序列，且所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：13-19的序列以及与SEQ ID NOs：13-19之一具有至少80％同源性的序列；其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
在某些实施方式中，本申请提供了使用所述第二组分离的寡核苷酸引物检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：使用所述第二组分离的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；使用所述第二组分离的寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
在某些实施方式中，本申请提供了第三组分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NOs：11-13，以及与SEQ ID NOs：11-13之一具有至少80％同源性的序列，且所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：14-16，以及与SEQ ID NOs：14-16之一具有至少80％同源性的序列；其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
在某些实施方式中，本申请提供了使用所述第三组分离的寡核苷酸引物检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：使用所述第三组分离的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；使用所述第三组分离的寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
在某些实施方式中，本申请提供了第四组分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：12和与之具有至少80％同源性的序列，且所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：17-19，以及与SEQ ID NOs：17-19之一具有至少80％同源性的序列；其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
在某些实施方式中，本申请提供了使用所述第四组分离的寡核苷酸引物检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：使用所述第四组分离的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；使用所述第四组分离的寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
在某些实施方式中，本申请提供了第五组分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：8-10，以及与SEQ ID NO：8-10之一具有至少80％同源性的序列，且所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NO：13和与之具有至少80％同源性的序列；其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
在某些实施方式中，本申请提供了使用所述第五组分离的寡核苷酸引物检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：使用所述第五组分离的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；使用所述第五组分离的寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约90个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为高致病性PRRSV；且如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
在某些实施方式中，本申请提供了第六组分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：13和与之具有至少80％同源性的序列，且所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NO：13和与之具有至少80％同源性的序列；其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
在某些实施方式中，本申请提供了使用所述第六组分离的寡核苷酸引物检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：使用所述第六组分离的寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV。
在另一方面，本发明还提供了分离的DNA片段，其含有一扩增产物，其中所述扩增产物是在含有PRRSV的样品和本发明提供的任意一对5’引物和3’引物的存在下，通过聚合酶链式反应获得。在某些实施方式中，所述5’引物和3’引物为所述第一组分离的寡核苷酸引物、第二组分离的寡核苷酸引物、第三组分离的寡核苷酸引物、第四组分离的寡核苷酸引物、第五组分离的寡核苷酸引物或第六组分离的寡核苷酸引物。
本领域技术人员已知，可以根据本领域公知的常识来选择合适的引物杂交位置和引物序列。例如，可以参考待扩增序列的长度来选择引物杂交的位置。例如，如果确定了5’引物的位置，则可以根据所述5’引物的杂交位置以及期望的扩增产物的大小来选择3’引物的杂交位置；反之亦然。
本领域技术人员可以根据本领域公知常识选择合适的扩增产物的长度。在某些实施方式中，扩增产物的长度小于等于6000个碱基对(6000bp)、5500bp、5000bp、4500bp、4000bp、3500bp、或3000bp。在某些实施方式中，扩增产物的长度范围可以是，例如，约100bp-约3000bp，约100bp-约2500bp，约100bp-约2000bp，约100bp-约1900bp，约100bp-约1800bp，约100bp-约1700bp，约100bp-约1600bp，约100bp-约1500bp，约100bp-约1400bp，约100bp-约1300bp，约100bp-约1200bp，约100bp-约1100bp，约100bp-约1000bp，或约100bp-约800bp等。在某些实施方式中，可以根据感兴趣的缺失片段的长度来选择合适的扩增片段长度。例如，可以选择一适合的扩增产物长度，使得能够通过电泳的方法知道扩增产物中是否含有感兴趣的缺失片段。例如，如果感兴趣的缺失片段为360bp，则相应的扩增产物可以小于等于6000bp、5500bp、5000bp、4500bp、4000bp、3500bp、或3000bp；如果感兴趣的缺失片段为90bp，则相应的扩增产物可以小于等于3000bp、2500bp、2000bp。
根据选择的引物杂交位置和扩增片段长度及序列，可以通过本领域公知的常识进行引物序列的设计，见，例如，J.Bartlett et al，PCR Protocols，published by Humana Press，2003；A.Yuryev，PCR primer design，published by Humana Press，2007。
在某些实施方式中，本发明提供的所述与SEQ ID NO：8互补的5’引物为5′-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3′。在某些实施方式中，本发明提供的所述与SEQ ID NO：15互补的3’引物为5′-CGCCGAGAAGACCCAGA-3′。
在某些实施方式中，本发明提供的寡核苷酸引物组合中，所述5’引物为5′-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3′，且所述3’引物为5′-CGCCGAGAAGACCCAGA-3′。
在某些实施方式中，所述生物样品来自疑似感染了PRRSV的猪。所述生物样品可以是，例如但不限于，血液、血浆、体液、分泌物(如呼吸道分泌物)、排泄物(如尿液、粪便等)、组织样品(如淋巴组织、肺部组织、肌肉组织)等。
在某些实施方式中，所述逆转录产物通过逆转录PCR方法获得。例如，可以将来自疑似感染了PRRSV的猪的样品进行常规处理，分离得到RNA(例如，使用Trizo1)，再通过逆转录PCR的方法获得RNA的逆转录产物(例如，使用六聚随机引物和逆转录聚合酶，或使用针对PRRSV基因设计的引物和逆转录聚合酶等，另见，例如，J.O’Connell，RT-PCRprotocols，Methods in Molecular Biology，Vol 193，published by Humana Press，2002)。
获得的逆转录产物可以作为DNA模板，用本申请提供的引物进行扩增。在某些实施方式中，所述扩增可以通过PCR的方法进行。本领域技术人员能够根据本领域的公知常识对PCR的反应条件进行选择和优化，例如但不限于，PCR反应中使用的聚合酶种类、PCR反应的温度、反应的循环次数、和反应体积等(见，例如，J.Bartlett et al，PCR Protocols，published by Humana Press，2003)。
扩增产物的存在可以通过本领域已知的任何适合的方法进行检测，例如，但不限于，琼脂糖凝胶电泳。可以使用适合的检测分子进行检测，例如，但不限于，DNA双链嵌入染料(如，溴化乙锭、DNA双链结合的荧光染料等)。
任选地，还可以检测扩增产物的分子量大小。例如，使用DNA分子量标记进行电泳，并将扩增产物的电泳条带与DNA分子量标记的电泳条带进行比较。再例如，可以使用传统型PRRSV的逆转录产物在同样条件下进行扩增，其扩增产物的分子量大小可以预先推算，因此可以作为对照。
具体实施例
实施例1：应用本发明B细胞表位多肽建立猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA的诊断方法
本实验室分离得到一株PRRSV TJ株，经过细胞传代至92代，发现该病毒的Nsp2基因上出现了进一步的缺失，而且病毒的毒力出现减弱。已经制备了PRRSV TJM-F92代弱毒株(即：PRRSV TJM株)并且研发成为PRRS减毒活疫苗，其特征在于病毒的Nsp2核苷酸序列全长为2490bp，与PRRSV TJ株Nsp2核苷酸序列相比连续缺失360个核苷酸(见图3)，该核苷酸编码PRRSV TJ株的Nsp2蛋白中的第598-717位氨基酸(见图4，SEQID NO：1)；与VR-2332毒株编码的Nsp2蛋白序列相比，TJM株编码的Nsp2蛋白缺失第481位、第537-565位和628-747位氨基酸，共缺失150个氨基酸。
本实验室针对PRRSV TJM疫苗株Nsp2缺失的120个氨基酸序列(即：SEQ ID NO：1)，分析得到优势的B细胞表位，建立一种能够鉴别检测PRRSV强毒株与TJM疫苗株的ELISA方法。本实验室首次人工合成了PRRSV Nsp2基因的特异性B细胞抗原优势表位，并适用于大规模检测PRRSV抗体，为我国PRRSV疫苗(TJM株)的推广使用及PRRS的净化提供了一种快捷的技术手段。
1试验材料
1.1包被抗原：合成的B细胞表位多肽
1.2试验用血清及动物：猪繁殖与呼吸综合征病毒(TJ株)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒高免血清(TJM株)均由本发明人按照常规方法用PRRS抗体阴性猪制备，标准阴性血清为经过IDEXX PRRS抗体试剂盒检测为阴性的血清。
2试验方法
试验方法采用间接ELISA方法，检测按常规方法在酶标板上进行。将本发明合成的B细胞表位用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后，包被酶标反应板放置在4℃过夜，翌日取出后洗涤，用封闭液封闭2h，洗涤后，加入待检血清，放置在37℃温箱反应45min，取出后洗涤，加入适当浓度的酶标二抗结合物，放置在37℃温箱反应1h，取出后洗涤，加入底物显色液。37℃反应10-15分钟后，用2M H2SO4终止反应。酶标仪测定OD450nm值。试验设阳、阴性血清和免疫血清对照。
本试验同时进行了摸索下述间接ELISA诊断方法的最佳条件的一系列试验：抗原最佳浓度和血清最佳稀释度；最佳封闭试剂和最佳封闭时间；一抗待检血清最佳稀释度和最佳反应时间；酶标二抗最佳稀释度和最佳反应时间；底物最佳显色时间，经过了一系列的试验摸索，最终确立了上述实验条件的最佳值，具体如下：
2.1B细胞表位的确定及合成
通过生物学软件DNAStar对PRRSV TJ株非结构蛋白Nsp2全序列与实验室人员测定的PRRSV TJM-F92疫苗株的非结构蛋白Nsp2全序列进行比对，寻找缺失的碱基序列(见图3)，并且推导出缺失基因的氨基酸序列(见图4)。
利用DNAStar中的Kyte-Doolittle方案预测缺失序列的亲水性，Emini方案预测蛋白的表面可及性，Jameson-Wolf方案预测缺失序列的抗原指数，对B细胞表位进行综合分析，根据20种氨基酸残基抗原性指数对预测的表位进行综合评判，选取合适的B细胞表位(见图5)，委托北京赛百盛基因技术有限公司合成。
2.2优势B细胞表位多肽的确定
以0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)将溶解的B表位多肽1/100倍稀释，100μL/孔4℃包被过夜。倾去孔内液体，用含0.05％Tween-20的0.02mol/L PBS(PBST，pH 7.2)洗5min×4次。加入含10％胎牛血清的PBST，100μL/孔，4℃封闭过夜，洗涤后加入1∶50稀释的PRRSV阴、阳性血清及PRRSV TJM疫苗免血清100μL/孔，37℃作用1h，洗涤后加入1∶10000稀释的兔抗猪酶标二抗100μL/孔，37℃作用1h，洗涤后加入新鲜配制的TMB底物溶液100μL/孔，37℃显色15min。加入2M H2SO4溶液50μL/孔终止反应，于酶联检测仪上读出OD450值。每个稀释度做两个重复，取其平均值。选择OD值较大的多肽并且与PRRSV TJM疫苗免疫血清和阴性血清的OD值最为接近的多肽为最佳多肽。
2.3B细胞表位多肽的最佳包被量及一抗血清最佳反应稀释度的确定
将筛选的多肽分别以50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625μg/mL 8个倍比稀释度，包被酶标板，4℃过夜。洗涤、封闭后，加入分别进行50、100、200、400倍稀释的阳性血清，以方阵滴定法确定抗原浓度和待检血清的最佳稀释倍数。考虑抗原节省问题，且OD值最大，选择最佳抗原包被浓度为12.5μg/mL，待检血清最佳反应浓度为1∶200倍稀释。
2.4封闭液的确定
本试验分别用含10％的胎牛血清、5％脱脂牛奶、1％牛血清白蛋白，100μL/孔，在37℃反应2h，进行ELISA试验，选择合适的封闭液。试验结果表明10％的胎牛血清的封闭效果最好，能有效的封闭表面的残留活性部位，试验特异性较高，结果令人满意。所以本实验选用10％的胎牛血清的PBS(0.01M pH7.4，PBS具体配制方法：NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12HO 2.9g；KH2PO40.5g，加水溶解定容至1升)缓冲液作为试验用封闭液，封闭时间为2h
2.5待检血清最佳作用时间的确定
以最适的多肽浓度和最佳多肽包被条件包被酶标板，洗涤后，分为4组，将PRRS阴、阳性血清按最适稀释度稀释，在37℃分别作用30、45、60、90min，按间接ELISA程序测定，当待检血清作用45min时，OD值最大切P/N值最大。因此，本实验确定一抗待检血清最佳作用时间为45min。
2.6酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定
以最适的多肽浓度和最佳多肽包被条件包被酶标板，洗涤后，分为4组，将PRRS阴、阳性血清按最适稀释度稀释，在37℃作用最佳时间。酶标二抗按1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000稀释。每个稀释度作4个平行试验孔，作用时间分别为30、45、60、90min，洗涤后，每孔加入新鲜配制的底物液，当酶标二抗以1∶10000倍稀释，作用时间60min时，P/N值最大，因此确定酶标二抗最佳稀释倍数为1∶10000，作用时间60min。
2.7底物作用时间的确定
按照已经确定的间接ELISA条件将实验分成六组，加入新鲜配置的底物溶液后，分别在8、10、12、15、18、20min加入2M H2SO4 50μL终止反应，于酶联检测仪上读出OD450值，当底物作用15分钟时，P/N值最大，随着时间的延长，阴性孔的OD值随之增大，因此确定底物作用时间为15分钟。
2.8判定标准的确定
利用已优化的反应条件检测经IDEXX PRRS抗体检测试剂盒验证为PRRS阴性的猪血清50份，计算S/P值，S/P值＝(样品的OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)。根据统计学分析，样品S/P的平均值X＝0.593，标准差SD＝0.064，取知心区间上限X+3SD＝0.785，作为阳性血清的下限；X+2SD＝0.721，定为可疑界限。根据统计学原理，S/P值≥X+3SD时，可以在99.7％的水平上判定为阳性。因此，得到间接ELISA的判定标准，即S/P值≥0.785判定为阳性，S/P值≤0.721判定为阴性，介于二者之间为＝者判为可疑。
实施例2：本发明间接ELISA诊断试剂盒的制备
1包被有抗原的酶标板的制备
1.1包被：抗原的最终浓度为12.5μg/mL，每孔包被量为100μL，盖上包被微孔板，置于4℃冰箱孵育过夜；
1.2洗涤：孵育过夜后，弃去酶标板内的包被液，开始洗涤(洗涤液的组成及配制为：0.01M pH7.4的PBS加0.05％Tween20)，每孔洗涤3遍，时间间隔为每次3min，洗涤完后，将包被板在吸水纸上扣干。
1.3封闭：用封闭液进行封闭(封闭剂为10％胎牛血清的PBS)，封闭完成后，盖上包被微板孔，置于37℃温箱中孵育2h。
1.4洗涤：封闭结束后，弃去酶标板内的封闭液，将封闭好的酶标板洗涤，每孔洗涤3次，时间间隔为每次3分钟，洗涤完后，将包被板在吸水纸上扣干。
1.5保存：4℃中保存，有效期6个月。
2阴性血清的制备
2.1制造用动物选取4-6周龄的PRRS阴性猪
2.2血清制造采集PRRS阴性猪的血液，分离血清，用0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下每瓶分装1ml，保存于-20℃冰箱中。
2.3阴性对照血清检验
2.3.1物理性状液体时为淡黄色或者淡红色清亮液体。
2.3.2无菌检验按标准进行，应无菌生长。
2.4保存制品在-20℃保存，有效期为1年。
3阳性血清的制备及检验
3.1制造动物选用4-6周龄的PRRS阴性猪，在负压隔离舍中饲养。
3.2病原北京必威安泰生物科技有限公司在国内分离的强毒株命名为PRRSV TJ株，后经过细胞传代弱化，已经研制成为PRRSV TJM减毒活疫苗。
3.3效价测定用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBST，pH7.4含0.05％Tween-20)将标准阳性血清和血清作1∶200倍稀释，进行ELISA测定，标准阳性血清的S/P值≥0.785。
3.4分装对血清抗体效价合格的猪进行前腔静脉采血，分离血清，用0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下每瓶分装1ml，保存于-20℃冰箱。
4酶标抗体结合物制备及检验
4.1酶标抗体结合物制备
4.1.1酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG，购自美国的SIGMA公司。
4.1.2酶结合物稀释液0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。
4.1.3酶结合物使用液的制备按照1∶10000倍稀释，用酶结合物稀释液稀释，用0.22μm滤膜过滤。
4.2酶标抗体结合物检验
4.2.1物理性状应为澄清、淡黄色溶液，无臭、无味、无沉淀物。
4.2.2无菌检验按照标准进行，应无菌生长。
4.3保存制品在-20℃保存，有效期为1年。
5底物显色液的制备及检验
5.1底物显色液的制备显色液A液配制：向1ml二甲基亚砜(DMSO)中加入10mg四甲基联苯胺(TMB)，混匀；显色液B液配制：向容器里加入700ml无菌去离子水，然后依次加入10.3g柠檬酸·H2O、35.8g Na2HPO4·12H2O、过氧化氢尿素1.0g、100μL Tween-20，混匀，定容至1升，使用时显色液A液∶B液＝1∶100，现用现配。
5.2物理性状应为澄清、淡黄色溶液，无沉淀物。
5.3无菌检验按标准进行，应无菌生长。
5.4保存4℃避光保存，有效期6个月。
6样品稀释液的制备及检验
6.1样品稀释液的制备在容器内加入总体积90％的灭菌去离子水，依次加入4gNa2HPO4·12H2O，50g NaCl，60g NaH2PO4，6g庆大霉素，在18-25℃下搅拌使各组分充分溶解并均匀混合。测量溶液的酸碱度，用适量0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠溶液调整pH值至7.1-7.3。用灭菌去离子水定容至30L，0.22μm Na2HPO4·12H2O，50g NaCl，60g NaH2PO4滤膜滤过。
6.2样品稀释液的检验
6.2.1物理性状应为澄清的金黄色溶液，无臭、无味、无沉淀物。
6.2.2pH值应为7.1-7.3
6.2.3保存放置在4℃保存，有效期为1年。
7洗液的制备及检验
7.1洗液的制备在容器内加入总体积80％的灭菌去离子水，依次加入300gNa2HPO4·12H2O，100g NaCl，60g NaH2PO4及15mlTween-20，充分搅拌至完全溶解。用灭菌去离子水定容至30L。0.22μm滤膜滤过，无菌保存，每瓶分装120ml。
7.2洗液的检验
7.2.1物理性状应为澄清、无色、无臭、无味的溶液，无沉淀物。
7.2.2pH值应为7.0-7.2。
7.2.3无菌检验按标准进行，应无菌生长。
7.3保存在4℃保存，试用期为1年。
8终止液的配制及检验
8.1终止液的配制用去离子水将硫酸稀释成2M，即为终止液。
8.2终止液的检验
8.2.1物理性状应为澄清、无色溶液。
8.2.2无菌检验按标准进行，应无菌生长。
8.3保存在室温下保存，使用期为2年。
9试剂盒的组装及检验
9.1组装
将检验合格的各试剂盒组份按表1组装成试剂盒。
表1试剂盒组成
| 试剂盒组份 | 规格 | 数量 |
| 抗原包被板 | 96孔/块 | 5块 |
| 样品稀释液 | 120ml/瓶 | 1瓶 |
| 洗液 | 120ml/瓶 | 1瓶 |
| 标准阳性血清 | 1ml/瓶 | 1瓶 |
| 标准阴性血清 | 1ml/瓶 | 1瓶 |
| 酶标抗体结合物 | 70ml/瓶 | 1瓶 |
| 显色液 | 70ml/瓶 | 1瓶 |
| 终止液 | 40ml/瓶 | 1瓶 |
| 使用说明书 | 份 | 1 |
将每支塑料瓶插入泡沫垫各个孔中，将泡沫垫装入纸盒中，在上面放上真空包装的酶标板，阴性血清、阳性血清和抗体稀释液，浓缩的洗液，置于包装盒的相应位置中。放入说明书。
9.2成品检验
9.2.1物理性状逐盒检验，应为洁净，密封良好。盒中各组分应齐全，无破损，无渗漏，各个试剂标签完好、清楚。其中酶标板应为真空密封包装，打开以后为无色透明。阴、阳性血清应为淡黄色或微红色液体。底物液装在棕色瓶中。其他溶液为无色透明的液体，无沉淀，无异物。
9.2.2无菌检验 试剂盒内各组分按标准检验应为无细菌、霉菌污染。
9.2.3特异性检验
9.2.3.1试剂盒内的阴性血清按试剂盒使用说明检测后，结果应为阴性。
9.2.3.2试剂盒内的阳性血清按试剂盒使用说明检测后，结果应为阳性。
9.2.4效价测定抗原包被板的效价测定：用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBST，Ph7.4，含0.5％Tween-20)将标准阳性血清和阴性血清作1∶200倍稀释，进行ELISA测定，标准阳性血清S/P值应≥0.78。
9.2.5稀释液按标准8.3.5.1检测，结果应为阴性。
10本试剂盒使用说明与判定
10.1使用说明
ELISA酶标板加入用样品稀释液稀释的待检血清及标准的阴、阳性血清，37℃孵育1h取出用洗液洗涤，加入酶标结合物，37℃孵育1h后，取出洗涤，然后加入显色液，37℃避光反应10-20min后，加入终止液终止反应。酶标仪上测定OD450nm。
10.2结果判定S/P值≥0.785者判为阳性，S/P值≤0.72者判为阴性，介于两者之间者判为可疑，对可疑的样品进行重测，仍是可疑的样品，判为阳性。S/P的计算公式为：S/P＝(样品OD值-标准阴性OD值)/(标准阳性OD值-标准阴性OD值)。
10.3特异性检验
用本试剂盒分别检验猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)、猪流感(SIV)的阳性血清，检测结果为阴性。
10.4鉴别诊断
本试剂盒配合IDEXX PRRS抗体检测试剂盒，进行间接ELISA试验检测PRRSV TJM疫苗免疫猪的血清，本试剂盒检测结果为阴性，IDEXX PRRS抗体检测试剂盒检测结果为阳性，本试剂盒可以鉴别PRRSV TJM疫苗株和PRRSV强毒株感染产生的抗体。
11试剂盒的贮藏本试剂盒4℃保存，有效期6个月。
实施例3：本发明B细胞表位多肽鉴别诊断试验
1试验材料
1.1检测试剂盒多肽鉴别诊断试剂盒(由实施例1所建立的鉴别诊断程序)；商品化的IDEXX PRRS抗体检测试剂盒(购自北京爱的士元亨生物科技有限公司)
1.2试验用动物及血清：猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV TJM株)疫苗免疫血清由本发明人按照常规方法用PRRS阴性猪制备；阳性血清由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSVTJ株)攻击PRRS阴性猪，在20天采血收集血清。阴性血清使用PRRS阴性猪的血清。试验动物选用4-6周龄的PRRS阴性健康仔猪。
2试验方法
试验方法采用间接ELISA的方法，检测PRRSV TJ株感染猪和PRRSV TJM株免疫猪产生的抗体，以IDEXX PRRS抗体检测试剂盒作为试验的对照。
按常规方法在酶标板上进行(同实施例1)。将本发明的B细胞表位多肽用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释后，包被反应板在4℃过夜，翌日取出用封闭剂在37℃封闭2h，然后加入待检血清，37℃反应45min取出洗涤(同实施例1)，加入适当浓度的酶标二抗结合物，37℃反应60min取出洗涤(同实施例1)，然后加入底物显色液。37℃避光反应15min，用2M H2SO4终止反应(同实施例1)，酶标仪测定OD450nm值。
选取健康的4-5周龄的PRRS阴性仔猪12头，随机分成4组，第一组(攻毒组)用PRRSVTJ株(F3代)105.0TCID50/ml，剂量为1ml/头猪，颈部肌肉注射进行攻击试验，每两天进行前腔静脉采血，采集血清，-20℃冰箱保存；第二组(对照组)用Marc-145细胞液进行注射，剂量为1ml/头猪，每两天进行前腔静脉采血，采集血清，-20℃冰箱保存，对两组采集的血清分别使用IDEXX PRRS抗体检测试剂盒和多肽ELISA的方法进行抗体检测(见图6)；第三组(免疫攻毒组)用PRRSV TJM株的活疫苗进行免疫试验，剂量为1头份，并且在免疫后28天进行PRRSV TJ株(F3代)进行攻击试验，每7天进行前腔静脉采血，采集血清，-20℃冰箱保存；第四组(免疫组)用PRRSV TJM株的活疫苗进行免疫试验，剂量为1头份，每7天进行前腔静脉采血，采集血清，-20℃冰箱保存，对免疫组、免疫攻毒组、对照组采集的血清分别使用IDEXX PRRS抗体检测试剂盒和多肽ELISA的方法进行抗体检测(见图7)，对所得结果进行比对。
结果表明，本发明的ELISA试剂盒能够检测出PRRSV TJ株感染产生的抗体，并且不与PRRSV TJM减毒活疫苗免疫的猪的样品产生反应，具有较好的区分效果，能够作为PRRSVTJM疫苗的配套产品，用于鉴别PRRS TJM减毒活疫苗产生的抗体和PRRSV野毒感染产生的抗体。由于试剂盒使用的是抗原多肽，因此也不存在散毒危险，生物安全性较高。
实施例4：本发明间接ELISA诊断试剂盒的敏感性试验
1实验材料与方法
1.1试验用病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV TJ株)，由中国农业科学院特产研究所鉴定、保存和供应，毒价为105.0TCID50/ml。
1.2试验用猪4-6周龄的PRRS阴性猪，试验期间饲养在中国农业科学院特产研究所的隔离舍中。
1.3检测用试剂盒本发明实施例2制备的诊断试剂盒；IDEXX PRRS抗体检测试剂盒。
2人工感染试验
PRRSV TJ株强毒攻击感染时，每头猪采用105.0TCID50/ml的剂量，颈部肌肉注射，共感染5头仔猪，感染后每隔一天进行前腔静脉采血，直到28天，收集血清，用于间接ELISA试验。
3试验结果
感染后不同时间采血，分离血清，检测ELISA抗体的阳性率，结果见表1
表1PRRSV TJ株强毒攻击后，抗体检出率
从试验结果可以看出：在试验的第十天和第十四天分别死亡一头仔猪，在强毒攻击后的第8天IDEXX试剂盒就可以检测出抗体，而多肽鉴别诊断试剂盒在第10天可以全部检测到抗体，两个试剂盒的检测结果基本一致。具有比较高的敏感性，对于是否感染可以做出比较早的判断。
结果表明，本发明试剂盒可以鉴别出PRRSV强毒株感染猪产生的抗体。本发明试剂盒所用包被抗原是生物安全性很高的B细胞表位多肽，具有全病毒无可比拟的安全性，不存在潜在的病毒逃逸和扩散的威胁，可以在实际临床工作中得到更为广泛的应用。
实施例5：本发明间接ELISA诊断试剂盒的特异性试验
1试验材料和方法
1.1阳性血清猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)、猪流感(SIV)阳性血清均有本实验室制备和保存
1.2使用的试剂盒多肽ELISA鉴别诊断试剂盒：本发明实施例2所制备。
1.3间接ELISA操作步骤：按照实施例1所确定的最佳条件进行。
1.4交叉试验在同一条件下，将猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)、猪流感(SIV)阳性血清以1∶200稀释，进行间接ELISA程序测定。
2试验结果
对于3种其他疾病的阳性血清按间接ELISA程序测定，S/P值均小于0.72，为阴性，即没有交叉反应。试验结果表明，本发明间接ELISA诊断试剂盒具有很高的特异性。
实施例6：本发明间接ELISA诊断试剂盒批间和批内的重复性研究实验
为考察利用本发明B细胞表位多肽制备的间接ELISA诊断试剂盒在使用过程中检测效果的稳定性和可重复性，特进行以下实验。
1材料和方法
1.1B细胞表位多肽间接ELISA鉴别诊断试剂盒分别按照本实施例2的方法制备4批。
1.2PRRS阳性血清共5份，由中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室研制并保存，标准阴性血清为PRRS抗体阴性血清。
1.3批内重复试验用同一批合成的B细胞表位多肽试剂盒，去5份不同抗体水平的PRRS阳性血清，在同一时间，同一条件，同一批试验中按间接ELISA程序测定，每份血清重复两次，结果进行统计学分析
表2批内重复性试验结果
批内重复性试验，按照间接ELISA程序测定不同孔的OD值，结果进行统计学分析，其变异系数位于1.79％-7.21％之间(见表2)，小于10％。说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。
2批间重复性试验
2.1取4批不同批次制备的本发明B细胞表位多肽试剂盒，在相同条件下检测4份不同抗体水平的阳性血清和一份阴性血清，每份血样重复两孔，结果进行统计学分析。
表3批间重复性试验结果
2.2用4批不同的本发明B细胞表位多肽包被的反应板，在相同条件下检测5份阳性血清和一份阴性血清，重复性实验结果经统计学分析，S/P值的变异系数在2.11％-11.32％之间(见表3)，小于15％，说明同一样品在不同批次抗原试验中变异程度很小，具有较好的重复性。
本发明以B细胞表位多肽作为抗原所建立的间接ELISA方法，具有很好的特异性，可以用于鉴别诊断，即用PRRSV TJM疫苗免疫动物后，不会产生Nsp2缺失序列表位的抗体。当用本发明建立的ELISA方法检测为阳性时，可以判断为PRRSV强毒感染。所以，本方法的重要意义之一在于将PRRSV TJM疫苗应用于PRRSV感染的有效预防，有利于猪场的净化，为生产实践提供一种快速有效地鉴别诊断方法，为彻底扑灭PRRS提供技术支持。
本发明所具有的积极效果是，PRRS的鉴别诊断一直都是PRRS疫苗研制的重要课题之一，在国内外的报道中，都是在理论上推测Nsp2基因可以作为PRRS的鉴别诊断的重要位点，本研究从实践的角度证明了该表位确实可以作为PRRS的鉴别诊断位点，丰富了理论基础。
实施例7：PCR反应的检测方法
1、引物
Nsp2-F：5′-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3′
Nsp2-L：5′-CGCCGAGAAGACCCAGA-3′
扩增范围：2756-3975
2、方法
2.1样品制备
2.1.1样品处理：取经典PRRSV，高致病性PRRSV和PRRSV TJM各250μl，置于1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中。
2.1.2阴性对照处理：取灭菌去离子水250μl，置于1.5ml DEPC处理的灭菌离心管中。
2.2病毒RNA的提取
2.2.1取已处理的样品和阴性对照，分别加入750μl Trizol Reagent裂解液，混匀，15～30℃放置5min。
2.2.2在上述离心管中分别加入200μl氯仿，盖好盖子，剧烈摇晃15sec之后，15～30℃放置2～3min，2～8℃，12000rpm离心15min。
2.2.3将水层小心移入一新DEPC处理的1.5ml离心管中，分别加入500μl异丙醇，15～30℃放置10min，2～8℃，12000rpm离心10min。
2.2.4倒掉上清，加入900μlml 75％DEPC乙醇，2～8℃，至少12000rpm离心10min。
2.2.5倒掉75％DEPC乙醇，5～10min空气中干燥，加入20μl DEPC水重新溶解RNA。
2.3反转录(RT)
反转录合成CDNA总反应体系为20μl，混匀，室温放置10min，置于42℃水浴锅中水浴1h，取出再冰浴2～3min。
2.4PCR扩增
总反应体系为20μl。
PCR扩增仪循环过程
2.5电泳称1g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液100ml，置于微波炉中溶解，加入5μl染色液混匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10μl混合2μl上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，110V电压电泳20min后，紫外灯下观察结果。
3结果
电泳结果显示(见图8)，经典PRRSV扩增后能在1220bp位置上有特异性条带，高致病性PRRSV扩增后能在1130bp位置上有特异性条带，PRRSV TJM扩增后能在770bp位置上有特异性条带，阴性对照无扩增带出现(引物带除外)。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与经典毒株相比全基因缺失了90个核苷酸，PRRSV TJM与经典毒株相比全基因缺失了450个核苷酸，PRRSV TJM与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒相比缺失360个核苷酸。
Claims (51)
1.一种分离的多肽，其含有与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段，其中所述免疫原性片段包括至少6个连续的氨基酸。
2.如权利要求2所述的多肽，其中所述免疫原性片段包括至少9个连续的氨基酸。
3.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽能够在体内产生特异性结合所述免疫原性片段的抗体。
4.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽能够检测样品中是否存在特异性结合所述免疫原性片段的抗体。
5.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽含有SEQ ID NO：1中的一个或多个免疫原性片段。
6.如权利要求5所述的多肽，其中所述免疫原性片段选自：SVKITRPKYSAQAI(SEQID NO：2)、GHLQKEKEA(SEQ ID NO：3)和PRTPAPSVSAESDLT(SEQ ID NO：4)。
7.如权利要求6所述的多肽，其中所述免疫原性片段为SVKITRPKYSAQAI(SEQ IDNO：2)。
8.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与载体物质相结合。
9.如权利要求8所述的多肽，其中所述载体物质是载体蛋白。
10.如权利要求8所述的多肽，其中所述载体物质是聚合物。
11.一种检测试剂，其包含如权利要求1所述的分离的多肽。
12.一种检测装置，其包含如权利要求11所述的检测试剂，所述检测试剂附着在固相支持物上。
13.一种检测样品中抗体的方法，所述样品来自被PRRSV感染的猪，该方法包括将所述样品与权利要求1所述的多肽接触，并检测所述多肽与样品中抗体的特异性结合。
14.一种区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪的方法，所述方法包括：
用所述猪的样品接触权利要求1所述的多肽，以及
检测所述样品中是否存在与权利要求1所述多肽特异性结合的抗体。
其中样品中如果存在与权利要求1所述多肽特异性结合的抗体，则表明该样品来自于被所述野生型PRRSV感染的猪。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同源性的多核苷酸分子，该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQID NO：1具有至少80％同源性的多肽。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述野生型PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。
17.如权利要求14所述的方法，其中样品中如果不存在与权利要求1所述多肽特异性结合的抗体，则表明该样品来自于未感染的猪或被减毒PRRSV感染的猪。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述减毒PRRSV是减毒活疫苗。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述减毒PRRSV含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
20.一种分离的抗体，其能够特异性结合权利要求1中所述多肽中的所述免疫原性片段。
21.如权利要求20所述的抗体，其进一步带有标记物。
22.如权利要求21所述的抗体，其中所述标记物是荧光标记物、发光标记物、放射性标记物、酶标记物或有色物质。
23.一种检测试剂，其包含如权利要求20所述的抗体。
24.一种检测装置，其包含如权利要求23所述的检测试剂，所述检测试剂附着在固相支持物上。
25.一种检测样品中PRRSV存在的方法，所述PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段，该方法包括将所述样品与权利要求20所述的抗体接触，并检测所述样品中是否存在与所述抗体特异性结合的抗原。
26.一种区分经减毒PRRSV免疫过的猪和被野生型PRRSV感染的猪的方法，所述方法包括：
用所述猪的样品接触权利要求20所述的抗体，以及
检测所述样品中是否存在与权利要求20所述抗体特异性结合的抗原，其中所述样品中存在与权利要求20所述抗体特异性结合的抗原则表明该样品来自于被所述野生型PRRSV感染的猪。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述减毒PRRSV包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同源性的多核苷酸分子，该多核苷酸分子缺乏一个多核苷酸片段，该片段编码与SEQID NO：1具有至少80％同源性的多肽。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述野生型PRRSV含有一多核苷酸分子，其编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的多肽片段中的一个或多个免疫原性片段。
29.如权利要求26所述的方法，其中样品中如果不存在与权利要求20所述抗体特异性结合的抗原，则表明该样品来自于未感染的猪或被减毒PRRSV感染的猪。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述减毒PRRSV是减毒活疫苗。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述减毒PRRSV含有保藏号为CGMCC No.3121的PRRSV。
32.一种试剂盒，包括如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽附着在固相支持物上。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其进一步包括一种检测抗体。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述检测抗体带有标记物。
35.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述检测抗体是抗猪抗体。
36.一对分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，
其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NOs：8-10，以及与SEQ ID NOs：8-10之一具有至少80％同源性的序列，且
所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：13-19的序列，以及与SEQ IDNOs：13-19之一具有至少80％同源性的序列；
其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且
所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
37.一种检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：
使用如权利要求36所述的一对寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；
使用如权利要求36所述的一对寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及
任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；
其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者存在的PRRSV为减毒PRRSV；
如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约90个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为高致病性的PRRSV；
如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸或450个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且
如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
38.一对分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，
其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：11和与之具有至少80％同源性的序列，且
所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：13-19的序列以及与SEQ IDNOs：13-19之一具有至少80％同源性的序列；
其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且
所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
39.一种检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：
使用如权利要求38所述的一对寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；
使用如权利要求38所述的一对寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及
任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；
其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；
如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且
如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
40.一对分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，
其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NOs：11-13，以及与SEQ ID NOs：11-13之一具有至少80％同源性的序列，且
所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：14-16，以及与SEQ ID NOs：14-16之一具有至少80％同源性的序列；
其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且
所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
41.一种检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：
使用如权利要求40所述的一对寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；
使用如权利要求40所述的一对寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及
任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；
其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；
如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且
如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
42.一对分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，
其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：12和与之具有至少80％同源性的序列，且
所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NOs：17-19，以及与SEQ ID NOs：17-19之一具有至少80％同源性的序列；
其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且
所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
43.一种检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：
使用如权利要求42所述的一对寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；
使用如权利要求42所述的一对寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及
任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；
其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；
如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约360个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为减毒PRRSV；且
如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
44.一对分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，
其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：8-10，以及与SEQ ID NO：8-10之一具有至少80％同源性的序列，且
所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NO：13和与之具有至少80％同源性的序列；
其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且
所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
45.一种检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：
使用如权利要求44所述的一对寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；
使用如权利要求44所述的一对寡核苷酸引物扩增传统型PRRSV的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；以及
任选地，比较待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小；
其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV；
如果检测到的待测样品的扩增产物比传统型PRRSV的扩增产物少约90个核苷酸，则表明待测样品中存在的PRRSV为高致病性PRRSV；且
如果检测到的待测样品的扩增产物与传统型PRRSV的扩增产物的分子量大小接近，则表明待测样品中存在的PRRSV为传统型PRRSV。
46.一对分离的寡核苷酸引物，其含有一条5’引物和一条3’引物，
其中所述5’引物与一序列的反义链互补，该序列选自下组：SEQ ID NO：13和与之具有至少80％同源性的序列，且
所述3’引物与选自下组的序列互补：SEQ ID NO：13和与之具有至少80％同源性的序列；
其中所述5’引物和所述3’引物的长度在10-38个核苷酸之间；且
所述5’引物和所述3’引物能够扩增传统型PRRSV的核苷酸序列，且扩增的序列长度大于等于所述5’引物和所述3’引物的长度之和。
47.一种检测生物样品中的PRRSV的方法，包括：
使用如权利要求46所述的一对寡核苷酸引物扩增待测样品中的RNA的逆转录产物，并检测所述扩增产物的存在和/或分子量大小；
其中，如果检测不到待测样品的扩增产物，则表明待测样品中没有PRRSV或者具有的PRRSV为减毒PRRSV。
48.如权利要求36所述的寡核苷酸引物，其中所述与SEQ ID NO：8互补的5’引物为5′-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3′。
49.如权利要求36所述的寡核苷酸引物，其中所述与SEQ ID NO：15互补的3’引物为5′-CGCCGAGAAGACCCAGA-3′。
50.如权利要求36所述的寡核苷酸引物，其中所述5’引物为5′-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3′，且所述3’引物为5′-CGCCGAGAAGACCCAGA-3′。
51.分离的DNA片段，其含有一扩增产物，其中所述扩增产物是在含有PRRSV的样品和如权利要求36、38、40、42和46任一所述的5’引物和3’引物的存在下，通过聚合酶链式反应获得。
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