TW201300421A - 用於偵測豬繁殖及呼吸道綜合症病毒（ｐｒｒｓｖ）之試劑及方法 - Google Patents
用於偵測豬繁殖及呼吸道綜合症病毒（ｐｒｒｓｖ）之試劑及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申請案係關於豬繁殖及呼吸道病毒之偵測試劑及偵測方法。在一個態樣中，本發明提供編碼非結構蛋白2(Nsp2)之免疫原性片段。特定言之，本文所提供之免疫原性片段不存在於減毒PRRSV之Nsp2蛋白中但存在於野生型PRRSV之Nsp2蛋白中。本發明亦提供適用於區分減毒PRRSV與野生型PRRSV之寡核苷酸引子。本申請案進一步提供PRRSV之偵測方法及偵測試劑，以及區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法。
Description
本發明係關於獸醫領域，尤其係關於用於偵測豬繁殖及呼吸道綜合症病毒(PRRSV)之試劑及方法。
本申請案主張2011年5月27日申請之題為「Reagents and Methods for PRRSV Detection」之中國專利申請案第201110143363.7號的優先權，該案以全文引用的方式併入本文中。
豬繁殖及呼吸道綜合症(PRRS)為一種傳染性疾病，其特徵為高感染率、急性疾病發作及高致死率。2006年，中國發生豬瘟流行病，期間大量懷孕母豬受嚴重症狀(諸如流產、胎兒死亡、木乃伊胎兒、高熱、厭食及甚至死亡)的影響。該流行病對中國豬肉行業造成嚴重經濟損失。在分離病原體且隨後對其基因組測序後發現豬瘟流行病由豬繁殖及呼吸道綜合症病毒(PRRSV)引起。
在PRRSV流行病期間，需要在早期鑑別出感染病原性病毒之動物且使其與群體分離，從而避免廣泛病毒傳播且降低經濟損失。然而，用於偵測PRRSV之現有方法具有諸多限制。舉例而言，其通常需要分離且鑑別病毒，但使用活病原性病毒可造成進一步病毒傳播之威脅。另外，偵測方法很複雜且通常需要高水準實驗條件。此外，難以區分天然感染動物與接種疫苗之動物。
在獸醫實踐中，通常需要有效偵測大量血清樣品，從而預防可能的疾病爆發。因此，非常需要可提供反應快速、操作便利、結果準確且生物安全性仍較高之新穎偵測試劑及方法。
在一個態樣中，本發明提供經分離多肽，其包含與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段。在某些實施例中，免疫原性片段包含至少6個、至少7個、至少8個或至少9個連續胺基酸。
在某些實施例中，多肽適用於產生特異性結合於免疫原性片段之抗體。在某些實施例中，多肽適用於偵測樣品中特異性結合於免疫原性片段之抗體的存在。
在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之一或多個免疫原性片段。在某些實施例中，免疫原性片段係選自由以下組成之群：SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)、GHLQKEKEA(SEQ ID NO：3)及PRTPAPSVSAESDLT(SEQ ID NO：4)。
在某些實施例中，多肽結合於載體分子。在某些實施例中，載體分子為載體蛋白或聚合物。
在另一態樣中，本發明提供偵測試劑，其包含本文所提供之經分離多肽。在另一態樣中，本發明亦提供偵測裝置，其包含含有多肽之偵測試劑，其中該偵測試劑連接於固體支撐物。
在另一態樣中，本發明亦提供偵測自懷疑感染PRRSV之
豬獲得的樣品中之抗體的方法，其包含使該樣品與本文所提供之經分離多肽接觸及偵測多肽與樣品中之抗體的特異性結合。
在另一態樣中，本發明亦提供使用本文所提供之多肽區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法。在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒活疫苗。在某些實施例中，減毒PRRSV包含寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV。
在另一態樣中，本發明亦提供能夠特異性結合於本文所提供之多肽之免疫原性片段的經分離抗體。在某些實施例中，本文所提供之抗體進一步包含標記物。在某些實施例中，標記物為螢光標記物、發光標記物、放射性標記物、酶標記物或染色物質。
在另一態樣中，本發明亦提供偵測試劑，其包含本文所提供之經分離抗體。在另一態樣中，本發明亦提供偵測裝置，其包含含有多肽之偵測試劑，其中該偵測試劑連接於固體支撐物。
在另一態樣中，本發明亦提供偵測樣品中PRRSV之存在的方法，其包含使該樣品與本文所提供之經分離抗體接觸及偵測該抗體與樣品中PRRSV之抗原的特異性結合。
在另一態樣中，本發明亦提供使用本文所提供之抗體區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法。在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒活疫苗。在某些實施例中，減毒PRRSV含有寄存編號為CGMCC第3121號
之PRRSV。
在另一態樣中，本發明亦提供套組，其包含本文所提供之經分離多肽，其中該多肽連接於固體支撐物。在某些實施例中，該套組進一步包含偵測抗體。在某些實施例中，偵測抗體結合於標記物。在某些實施例中，偵測抗體為抗豬抗體。
在另一態樣中，本發明亦提供寡核苷酸引子，其適用於偵測生物樣品中PRRSV之存在。
在另一態樣中，本發明亦提供偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含使用本文所提供之寡核苷酸引子對擴增測試樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測擴增產物之存在及/或分子量。
以下描述僅欲說明本發明之各種實施例。因此，所述特定修改不欲具有限制性。對於熟習此項技術者顯而易見，可在不背離本文所呈現之標的物之精神或範疇的情況下進行各種等效變換、變化及修改，且應瞭解該等等效實施例包括在本文內。本文所引用之所有公開案、專利或專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。
在一個態樣中，本發明提供由PRRSV基因組編碼之Nsp2蛋白序列中的一或多個免疫原性片段。
PRRSV為正股RNA病毒，已鑑別其中兩種基因型：美洲型及歐洲型。PRRSV基因組包含數個開放閱讀框架。第一開放閱讀框架(ORF 1a及ORF 1b)含有PRRSV基因組之80%
序列，且編碼PRRSV複製所需之RNA複製酶(Straw等人，Diseases of Swine，第9版，第24章(2006))。ORF 1a及ORF 1b轉譯為聚合蛋白質，其由內部蛋白酶結構域加工成多個非結構蛋白，包括Nsp1-Nsp12(參見例如Vries等人，Seminars in Virology,8：33-47(1997)；Allende等人，Journal of General Virology,80：307-315(1999))。
Nsp2為該等非結構蛋白之一。Nsp2蛋白含有蛋白酶結構域且咸信介導由ORF1編碼之聚合蛋白質的拼接及加工。亦咸信Nsp2蛋白有利於形成RNA複製酶複合物且在PRRSV之複製中起重要作用。
Nsp2蛋白可為PRRSV之病原性所必需。據報導PRRSV基因組中Nsp2編碼序列中之某些序列之缺失使得PRRSV失活或具有顯著降低之傳染性(參見例如Han等人，Journal of Virology,81(18)：9878-9890(2007)；Kim等人，Virus Genes,38：118-128(2008))。前述報導提供減毒PRRSV，其Nsp2編碼序列含有咸信可削弱病原性但保留病毒複製之某些缺失(參見例如中國專利申請案CN101633909A)。該等減毒PRRSV尤其適用於製備保護豬免於感染野生型及病原性PRRSV的PRRSV疫苗。
在一個態樣中，本發明提供包含Nsp2蛋白序列之一或多個免疫原性片段的經分離多肽。該等免疫原性片段不存在於減毒PRRSV之Nsp2蛋白序列中，但存在於野生型或病原性PRRSV之Nsp2蛋白序列中。
如本文所用之「減毒PRRSV」係指一種PRRSV，在其
Nsp2蛋白中缺失部分胺基酸序列，且其能夠感染宿主而不會誘發豬繁殖及呼吸道綜合症或誘發較少及/或較輕微症狀。減毒PRRSV可為活減毒PRRSV以及其不活化產物。
如本文所用之「豬繁殖及呼吸道綜合症」或「PRRS」係指由天然存在之病原性PRRSV感染豬後引起的一系列生理及病理症狀。該等症狀可包括(但不限於)發熱、嗜睡、厭食、倦怠、呼吸困難、咳嗽、母豬繁殖失敗、小豬生長緩慢及死亡等。
如本文所用之「野生型PRRSV」係指能夠感染宿主且在宿主中引起PRRS之一或多個症狀的PRRSV。野生型PRRSV可為野外分離株(field isolated strain)或實驗株，只要其可感染宿主且引起PRRS即可。在某些實施例中，由野生型PRRSV引起之PRRS症狀與由野外分離之病原性PRRSV株或標準PRRSV株引起之PRRS症狀相當或可能甚至更嚴重。標準PRRSV株可為例如(但不限於)美洲型標準株VR-2332(全長基因組序列之GenBank寄存編號：AY 150564)及歐洲型標準株Lelystad(參見例如WO 92/21375)。
如本文所用之「PRRSV」包括PRRSV病毒及可用於產生PRRSV病毒之遺傳物質，例如(但不限於)含有PRRSV之全基因組的RNA分子、含有可組裝成PRRSV之全基因組之物質的多個RNA分子、編碼PRRSV之全基因組的DNA分子及編碼可組裝成PRRSV之全基因組的PRRSV基因組片段的多個DNA分子。
在某些實施例中，減毒PRRSV與野生型PRRSV之不同之
處為Nsp2蛋白序列，其中減毒PRRSV之Nsp2蛋白在與野生型PRRSV之Nsp2蛋白比較時缺乏一多肽片段。
PRRSV之Nsp2蛋白的序列可由此項技術中已知之方法測定。舉例而言，可將PRRSV之基因組序列與已知PRRSV對準，且可基於已知PRRSV基因組中所報導之Nsp2編碼序列確定Nsp2編碼序列。已鑑別不同PRRSV株之基因組中Nsp2蛋白之編碼序列(參見例如Allende等人，Journal of General Virology,80：307-315(1999)；美國專利申請案US20100215694)。或者，PRRSV中Nsp2蛋白之編碼序列可藉由鑑別PRRSV基因組之ORF1a中Nsp2之N端及C端裂解位點來測定。已報導Nsp2蛋白之N端裂解位點與C端裂解位點(參見例如Nielsen等人，Journal of General Virology,82：1263-1272(2001)；Ziebuhr等人，Journal of General Virology,81：853-879(2000))。Nsp2蛋白序列可根據遺傳密碼子自編碼序列輕易轉譯。
在某些實施例中，野生型PRRSV中含有但減毒PRRSV中不含之多肽片段包含一或多個免疫原性片段。如本文所用之「免疫原性片段」係指可由抗體特異性識別之多肽片段。多肽之免疫原性片段可使用此項技術中已知之各種方法鑑別，例如(但不限於)藉由使用適合序列預測軟體或藉由使用分析方法鑑別。
在某些實施例中，免疫原性片段可使用此項技術中已知之軟體預測，例如(但不限於)DNAStar之Lasergene軟體(參見例如T.Burland等人，DNASTAR’s Lasergene Sequence
Analysis Software,Methods in Molecular Biology，第132卷，71-91(1999))、PEOPLE軟體(Alix等人，Vaccine,18(324)：311-314,1999),BEPITOPE軟體(Odorico M等人，J.Mol.Recognit,16：20-22,2003)、Bcepred、ABCpred軟體(Saha S等人，Proteins,65(1)：40-48,2006)、CEP軟體(Kulkarni-Kale U等人，Nucleic Acids Res,33：W168-W171(2005))、DiscTope軟體(Haste A P等人，Protein Science,15：2558-2567(2006))、MEPS軟體(Castrignano T等人，BMC Bioinformatics,8(增刊1)：S6-S10,2007)等。熟習此項技術者可根據多肽序列選擇適當軟體且在軟體開發者之指導或說明的導引下提供序列資訊及參數，從而獲得所預測之免疫原性片段。
在某些實施例中，多肽片段之免疫原性片段亦可藉由適合分析方法用適合裝置及技術(例如(但不限於)X射線晶體繞射技術、核磁共振、質譜等)預測(關於詳細評述，請參見例如Methods in Molecular Biology，第66卷：Epitope Mapping Protocols,Humana Press,Glenn E.Morris編，1996)。
可製備或合成預測之免疫原性片段以供隨後測定其與抗體之特異性結合或其引發抗體產生之能力，從而證實所預測之免疫原性片段實際上具有免疫原性。
本文所提供之免疫原性片段不存在於減毒PRRSV之Nsp2蛋白序列中，但存在於野生型PRRSV之Nsp2蛋白序列中。該等免疫原性片段可經由序列對準鑑別。舉例而言，可將
減毒PRRSV之Nsp2蛋白序列或核苷酸序列與野生型PRRSV之Nsp2蛋白序列或核苷酸序列對準，從而可鑑別存在於野生型PRRSV之Nsp2蛋白中但不存在於減毒PRRSV之Nsp2蛋白中的多肽片段，且可藉由此項技術中已知之方法預測該多肽片段中所含有之免疫原性片段。視情況，可進一步驗證免疫原性片段之免疫原性。
在某些實施例中，本文所提供之免疫原性片段不存在於PRRSV TJM株之Nsp2蛋白序列中但存在於野生型PRRSV之Nsp2蛋白序列中。
「PRRSV TJM株」係指寄存編號為CGMCC第3121號且具有以下寄存資訊之PRRSV：微生物寄存編號：CGMCC第3121號；分類名稱：豬繁殖及呼吸道綜合症病毒；寄存地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號中國科學院微生物研究所(Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,No.1 West Beichen Road,Chaoyang District,Beijing,China)；寄存中心：中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center)；及寄存日期：2009年6月15日。已對PRRSV TJM株之全基因組序列進行測序且該基因組序列展示於SEQ ID NO：6中。該基因組序列中編碼之Nsp2蛋白的胺基酸序列展示於SEQ ID NO：7中。
在某些實施例中，本發明提供經分離多肽，其包含不存在於PRRSV TJM株之Nsp2蛋白序列(例如SEQ ID NO：7)中但存在於野生型PRRSV之Nsp2蛋白序列中的多肽片段之一
或多個免疫原性片段。
在某些實施例中，野生型PRRSV為高病原性PRRSV。術語「高病原性PRRSV」係指包含由如下DNA序列編碼之Nsp2核苷酸的PRRSV，該DNA序列在與SEQ ID NO：20比較時，SEQ ID NO：21之部分中缺乏90個不連續核苷酸(亦即SEQ ID NO：20之第1440個至第1680個核苷酸之片段)。發現缺乏該90個不連續核苷酸之PRRSV分離株(參見圖1(a))的病原性高於PRRSV VR-2332株(參見例如Tian等人，PLoS ONE 2(6)：e526,(2007)，數位物件識別號：10.1371)。在某些實施例中，90個不連續核苷酸包括來自SEQ ID NO：20之第1440個至第1442個核苷酸的「TTT」及如SEQ ID NO：22中所示之序列(參見例如圖2)。
在某些實施例中，高病原性PRRSV包含如SEQ ID NO：23中所示之Nsp2蛋白序列或其同源序列。在某些實施例中，高病原性PRRSV為PRRSV TJ株，其基因組由GenBank寄存編號為EU860248之序列(本文以SEQ ID NO：5提供)編碼。PRRSV TJ株為美洲型PRRSV株，其可在感染豬宿主後引起豬繁殖及呼吸道綜合症(參見中國專利ZL200710121202.1)。
在某些實施例中，本文所提供之經分離多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少75%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段。SEQ ID NO：1為PRRSV TJ株(野生型高病原性株)之Nsp2蛋白的部分序列，且不存在於PRRSV TJM株(減毒PRRSV株)之Nsp2蛋白中。PRRSV TJ株之Nsp2蛋白序列
與許多美洲型PRRSV株同源，例如，其與VR-2332(美洲型PRRSV之標準株)之Nsp2蛋白序列具有77.9%同源性。
如本文所用之術語「同源性百分比(%)」係指兩個胺基酸序列或兩個聚核苷酸序列之間在將候選序列與參考序列對準且必要時引入間隙以達成最大數目之一致胺基酸或核苷酸後的一致性百分比。比較胺基酸(或核苷酸)序列及計算同源性可由此項技術中熟知之軟體達成，例如(但不限於)BLAST軟體(購自國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之網站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，亦參見例如Altschul S.F.等人，J.Mol.Biol.,215：403-410(1990)；Stephen F.等人，Nucleic Acids Res.,25：3389-3402(1997))、ClustalW2軟體(購自歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute)之網站http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，亦參見例如Higgins D.G.等人，Methods in Enzymology,266：383-402(1996)；Larkin M.A.等人，Bioinformatics(Oxford,England),23(21)：2947-8(2007))及TCoffee軟體(購自瑞典生物資訊研究所(Sweden Bioinformatics Institute)之網站http：//tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，亦參見例如Poirot O.等人，Nucleic Acids Res.,31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.等人，J.Mol.Boil.,302(1)：205-17(2000))。若使用軟體執行序列對準，則可使用軟體中可獲得之預設參數或可定製參數以適合對準目的。所有此等方法均在一般技術人士之學識範疇內。
在某些實施例中，本文所提供之經分離多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段。在某些實施例中，經分離多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段。在某些實施例中，經分離多肽不包涵野生型PRRSV之全長Nsp2蛋白。
在某些實施例中，經分離多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽片段的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個免疫原性片段。在某些實施例中，免疫原性片段包含至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個、至少十三個或至少十四個連續胺基酸。
在某些實施例中，經分離多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段，其中該等免疫原性片段包含至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個、至少十三個或至少十四個連續胺基酸。
在某些實施例中，本文所提供之經分離多肽可用於產生特異性結合於免疫原性片段之抗體。舉例而言，經分離多肽可由免疫系統識別，從而誘導免疫系統產生一或多種可特異性結合於多肽之一或多個免疫原性片段的抗體。
在某些實施例中，本文所提供之多肽可特異性結合於識別免疫原性片段上之多肽的抗體。在某些實施例中，本文所提供之多肽可用於偵測樣品中特異性結合於免疫原性片段之抗體的不存在或存在。舉例而言，樣品可含有一或多種可特異性結合於多肽之一或多個免疫原性片段的抗體，且當多肽與樣品接觸時，多肽可特異性結合於抗體且用於樣品中抗體之偵測。
在某些實施例中，本文所提供之經分離多肽包含SEQ ID NO：1之一或多個免疫原性片段。在某些實施例中，免疫原性片段係選自由以下組成之群：SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)、GHLQKEKEA(SEQ ID NO：3)及PRTPAPSVSAESDLT(SEQ ID NO：4)。在某些實施例中，免疫原性片段為SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)。
本文所提供之經分離多肽可藉由此項技術中熟知之任何適合方法(例如(但不限於)藉由化學合成或生物學重組表現等)製備。
可使用此項技術中熟知之任何適合化學方法，例如(但不限於)基於液相之多肽合成及基於固相之多肽合成等(參見例如Michael W.Pennington,Peptide synthesis protocols,Methods in molecular biology，第35卷，由Humana Press出版，1994；John M.Waler等人，Molecular biomethods handbook，第32章，由Springer出版，2008)。
本文所提供之多肽亦可藉由生物學重組表現來製備。舉
例而言，可將編碼多肽之聚核苷酸序列引入適合表現宿主(例如原核細胞(諸如大腸桿菌(Escherichia coli))或真核細胞(諸如酵母或哺乳動物細胞)等)中，在允許表現多肽之條件下培養。在某些實施例中，可將含有多肽之編碼序列的表現載體引入適合表現宿主中以進行表現。重組表現之多肽宜例如(但不限於)藉由自重組宿主細胞之細胞溶解物或細胞培養物之上清液回收而回收。視情況，多肽可藉由此項技術中已知之任何適合方法(例如(但不限於)藉由分子排阻層析、親和管柱層析或離子交換層析等)進一步分離及/或純化(參見例如Deutscher,Methods in enzymology,182(1990)；Scopes,Protein purification：Principles and Practices,Springer-Verlag,New York(1982))。
在某些實施例中，本文所提供之經分離多肽可結合於載體分子。熟習此項技術者可例如藉由使適合載體分子與多肽結合、偶合或融合而使多肽與該載體分子結合。在某些實施例中，載體分子可用於提高多肽之免疫原性。舉例而言，與載體分子結合之多肽可對免疫系統具有增強之刺激，從而促進產生對該多肽有特異性之抗體。在某些實施例中，載體分子可用於提高多肽之分子量，從而可改良免疫系統之識別，或提供與固體支撐物之較佳連接或適用於樣品偵測。在某些實施例中，載體分子可促進多肽之分離及純化。舉例而言，載體分子可為可使用市售抗體或套組去除之純化標記物(purification tag)。在某些實施例中，載體分子可適用於重組表現及/或分泌本文之多肽。舉例而
言，載體分子可為分泌標記物，其使得多肽可分泌於重組宿主細胞之細胞外或胞外質中，從而適於表現及回收多肽。在某些實施例中，載體分子可用於提高或降低多肽之溶解性。適用於上述目的之任何載體分子均屬於本發明之範疇內。
在某些實施例中，載體分子為載體蛋白。例示性載體蛋白包括(但不限於)白蛋白、匙孔螺血氰蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、甲狀腺球蛋白、麩胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白及甲殼素結合蛋白等。
在某些實施例中，載體分子為聚合物。例示性載體聚合物包括(但不限於)聚胺基酸(諸如聚組胺酸、聚離胺酸、聚麩胺酸(polyglutamate))、聚乙二醇、Ficoll、聚葡萄糖及樹狀體等。
熟習此項技術者可使用此項技術中已知之任何適合方法使本文所提供之多肽與適合載體分子結合，例如(但不限於)藉由化學方法(例如使用二官能偶合劑，參見例如Susan Hockfield,Selected methods for antibody and nucleic acid probes，由CSHL Press出版，1993，第72-75頁；John D.Pound,Immunochemical Protocols，由Humana Press出版，1998，第74-78頁；J.Mark Carter,The protein protocols handbook，第VII部分，1996，第679-687頁；Francesco M.Veronese,Biomaterials,22：405-417(2001)；Greg T.Hermanson,Bioconjugate techniques，由Academic Press出
版，2008，第754-757頁)或藉由生物學重組表現(例如，使多肽與載體分子表現為融合蛋白，參見例如S.J.Higgins等人，Protein expression：a practical approach，由Oxford University Press出版，1999，第174-199頁)。
在某些實施例中，本文所提供之多肽可與佐劑組合以提供免疫原性組合物。佐劑可保護抗原以免活體內降解及/或可非特異性刺激免疫系統，從而適用於提高針對多肽之免疫反應。例示性佐劑包括(但不限於)無機鹽(諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鈣)、油包水乳液(諸如傅氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、傅氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant))、皂素佐劑(諸如StimulonTM等)、細菌或微生物衍生物(諸如脂多醣、脂質A衍生物等)及微粒(諸如聚α羥基酸等)。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之經分離多肽的偵測試劑。偵測試劑可包含適合純度及/或適合濃度之適量經分離多肽，以便偵測試劑中之多肽適用於偵測目的。在某些實施例中，偵測試劑中之多肽為冷凍乾燥形式或溶解於適合媒劑中。在某些實施例中，偵測試劑可進一步包含適合賦形劑，例如(但不限於)適合緩衝劑、防腐劑、蛋白質等。
在另一態樣中，本發明提供偵測裝置，其包含含有本文所提供之多肽的偵測試劑，其中該偵測試劑連接於固體支撐物。固體支撐物可為適用於偵測目的及連接偵測試劑之
任何物質。實例包括(但不限於)塑膠盤、塑膠板、硝化纖維素濾膜、玻璃纖維膜、玻璃板、珠粒等。
偵測試劑可使用任何適合方法(例如(但不限於)藉由固定、塗佈、吸附、噴塗、印刷等)連接於固體支撐物。在某些實施例中，可使固體支撐物與含有偵測試劑之溶液接觸一段時間，隨後移除溶液。在某些實施例中，可將含有偵測試劑之溶液、懸浮液或乳液噴灑或塗佈於固體支撐物上，隨後可適當地例如藉由乾燥移除溶劑組分。在某些實施例中，亦可將偵測試劑印刷或壓製於固體支撐物上。
在另一態樣中，本發明提供偵測樣品中之抗體的方法，其中樣品來自懷疑感染PRRSV之豬，該等方法包含使樣品與本文所提供之經分離多肽接觸及偵測樣品中特異性結合於多肽之抗體的存在。
多肽與樣品中之抗體的特異性結合可藉由此項技術中已知之任何適合偵測方法偵測。
在某些實施例中，偵測係基於夾心法。簡言之，可將未標記之捕捉分子(諸如本文所提供之多肽)固定於固體支撐物上，隨後與含有測試抗體之樣品接觸足夠時間以使抗體與捕捉分子充分結合，繼而與特異性結合於測試抗體之偵測抗體反應，從而形成捕捉分子-測試抗體-偵測抗體之三重複合物。樣品中之測試抗體可藉由偵測此三重複合物中偵測抗體所產生之信號而間接偵測。
偵測抗體可為抗豬抗體。本文所用之術語「抗豬抗體」係指可特異性結合於豬抗體之Fc區的任何結合搭配物。舉
例而言，抗豬抗體可為由除豬以外之物種產生且特異性結合於豬抗體之Fc區的全長抗體或其抗原結合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、dsFv、scFv、scFv二聚體、BsFv、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體或結構域抗體等)。適用作偵測抗體之抗豬抗體包括例如(但不限於)小鼠抗豬抗體、大鼠抗豬抗體、兔抗豬抗體、山羊抗豬抗體、雞抗豬抗體及驢抗豬抗體等。抗豬抗體可為單株抗體或多株抗體或其任何抗原結合片段。抗豬抗體可購得或可藉由習知抗體製備方法(參見例如Harlow等人，Antibodies：A laboratory manual,Cold Spring Harbor,1988)獲得。
偵測抗體可與標記物結合。如本文所用之術語「標記物」係指可直接或間接偵測之分子。標記物可直接產生可偵測信號，諸如顏色、發光、螢光、放射能等；或可藉由與特異性分子反應(諸如酶與受質之間的反應)產生可偵測信號(諸如顏色變化、螢光、發光等)而間接偵測。標記物可為酶、螢光分子、化學發光物質、放射性分子或染色物質等。
在某些實施例中，偵測係基於直接偵測方法。本文所提供之多肽可經標記。經標記多肽可特異性結合於測試抗體且形成複合物，從而可藉由偵測複合物中之標記物來偵測樣品中之測試抗體。
在某些實施例中，偵測係基於競爭性結合。可與測試抗體或多肽形成複合物之經標記競爭性結合分子可用於干擾多肽與樣品中之測試抗體之間的特異性結合。可偵測競爭
性結合以提供樣品中測試抗體之資訊。
在某些實施例中，多肽與樣品中之測試抗體之間的特異性結合可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)、基於免疫螢光之方法、基於化學免疫發光之方法、基於免疫放射能之方法、基於免疫層析之方法或基於免疫過濾之方法偵測。
在某些實施例中，樣品中之測試抗體藉由ELISA偵測。舉例而言，可將本文所提供之多肽或偵測試劑固定於固體支撐物上，隨後與樣品(諸如懷疑感染PRRSV之豬的血液或血清)接觸以便充分形成捕捉分子-測試抗體複合物。隨後添加經酶標記之偵測抗體(例如山羊抗豬抗體)以便充分形成捕捉分子-測試抗體-偵測抗體之三重複合物。添加酶受質且在適合條件下轉化為可偵測產物。添加受質後可偵測信號之變化間接表明樣品中測試抗體之存在及/或量。
在某些實施例中，偵測抗體上標記之酶可催化受質且使受質之顏色產生變化。顏色變化可藉由分光光度計或微盤讀取器等偵測。偵測抗體上標記之酶可經由化學反應改變受質之螢光或產生發光，螢光變化或發光可由發光偵測器或螢光偵測器偵測。例示性適用酶包括(但不限於)螢光素酶(諸如螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶、細菌螢光素酶)、過氧化酶(諸如辣根過氧化酶)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、蘋果酸去氫酶、脲酶、醣化酶、溶菌酶、醣氧化酶(諸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶等)、雜環加氧酶等。酶可藉由此項技術中已知之任何適合技術標記於偵測抗體上，例如參見Tijssen,Practice and theory of enzyme
immunoassays，第15卷，第11章，由Elsevier出版，1985；O'Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods in Enzym.(J.Langone及H.Van Vunakis編)，由Academic press出版，New York,73：147-166(1981)。
在某些實施例中，可使用基於免疫螢光之方法偵測樣品中之測試抗體。舉例而言，偵測可基於夾心ELISA，其可形成捕捉分子-測試抗體-偵測抗體之三重複合物，其中偵測抗體經螢光分子標記。由三重複合物發射之螢光信號可間接表明樣品中測試抗體之存在及/或量。螢光信號可藉由此項技術中已知之任何適合方法偵測，例如(但不限於)藉由使用螢光顯微鏡或螢光偵測器等。例示性適用螢光分子包括(但不限於)異硫氰酸螢光素(FITC)、若丹明(rhodamine，TRITC)、螢光素、二氯三嗪基胺基螢光素(DATF)、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、LRSC(麗斯胺(lissamine)-若丹明磺醯氯)、丹磺醯氯、德克薩斯紅(Texas red)、R-藻紅素等。螢光分子可藉由任何適合方法標記於偵測抗體上，例如參見Wulf Storch,Immunofluorescence in clinical immunology：a primer and atlas，由Birkhauser出版，第2章及第3章(2000)。
在某些實施例中，可使用基於化學免疫發光之方法偵測樣品中之測試抗體。舉例而言，可使用夾心ELISA形成捕捉分子-測試抗體-偵測抗體之三重複合物，其中偵測抗體經化學發光分子標記。由三重複合物中之化學發光分子發
射的光信號可間接表明樣品中測試抗體之存在及/或量。化學發光信號可例如藉由引入催化劑及/或氧化劑以誘導化學發光分子氧化及產生發光來偵測，發光可由化學發光偵測器偵測。例示性化學發光分子包括(但不限於)魯米諾(luminol)及其衍生物、異魯米諾、吖啶鎓酯及其衍生物及三聯吡啶釕等。化學發光分子可藉由此項技術中已知之任何適合方法標記於偵測抗體上，例如參見J.Stuart Woodhead等人，Pure & Appl.Chem.,57(3)：523-529(1985)；D.M.Kemeny,ELISA and other solid phase immunoassays：theoretical and practical aspects，由John Wiley and Sons出版，1988；Aldo Roda,Chemiluminescence and Bioluminescence：Past,Present and Future，由Royal Society of Chemistry出版，2010。
在某些實施例中，可使用基於免疫放射能之方法偵測樣品中之測試抗體。舉例而言，本文所提供之多肽可經放射性物質標記，隨後與樣品接觸，以使多肽與測試抗體之間充分形成複合物。分離複合物以供偵測及/或量測放射能，從而表明樣品中測試抗體之存在及/或量。放射能可藉由此項技術中已知之任何適合方法偵測，例如(但不限於)藉由使用放射能計數器、閃爍計數器及γ計數器等。例示性放射性物質包括(但不限於)122I、123I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu及86Y等。放射性物質可藉由此項技術中已知之適合方法標記於本文所提供之多肽上，例如參見M.Holtzhauer,Basic methods for the
biochemical lab,Springer Lab Manuals，第6章，2006。
在某些實施例中，可使用基於免疫層析之方法偵測樣品中之測試抗體。舉例而言，可將本文所提供之多肽固定在免疫層析裝置之固體支撐物上，其中含有測試抗體之樣品沿固體支撐物且朝向固定於分離區域上之標記試劑及多肽流動。測試抗體在與標記試劑接觸後變成經標記測試抗體，隨後經由特異性結合由經固定多肽捕捉，從而在捕捉區域形成可見墨點或線。適用於免疫層析方法之例示性標記試劑包括(但不限於)經膠體金或膠體銀標記之偵測抗體等。標記試劑可藉由此項技術中已知之任何適合方法製備，例如可將偵測抗體與金屬膠體溶液在適合條件下混合，繼而分離經金屬膠體標記之抗體(參見例如G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques，由Academic Press出版，第919-936頁，2008)。
在某些實施例中，可使用基於免疫過濾之方法偵測樣品中之測試抗體。舉例而言，可將本文所提供之多肽固定於固體濾膜上且添加含有測試抗體之樣品以便形成多肽-抗體複合物，隨後與標記試劑接觸。用緩衝液洗滌複合物以移除在多肽-抗體-標記物之複合物捕獲於固體濾膜上時未結合之物質。偵測複合物中之標記物可間接表明樣品中測試抗體之存在及/或量。例示性標記試劑包括(但不限於)經金屬膠體標記之蛋白質或抗體、放射性配體及經酶標記之蛋白質或抗體等。標記物可藉由適合方法偵測，例如當標記試劑為經膠體金標記之抗體時藉由直接目測來偵測，或
當標記試劑為放射性配體時藉由放射能量測來偵測。
在另一態樣中，本發明提供一種區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法，其包含：使豬之樣品與本文所提供之多肽接觸，偵測樣品中特異性結合於多肽之抗體的存在，其中樣品中存在該抗體表明該樣品來自感染野生型PRRSV之豬。樣品中不存在抗體可表明該樣品來自未受感染之豬或用減毒PRRSV免疫之豬。
在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒美洲型PRRSV。在某些實施例中，減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源之多肽的聚核苷酸片段。在某些實施例中，減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1至少80%同源之多肽的聚核苷酸片段。
在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒PRRSV活疫苗。在某些實施例中，減毒PRRSV活疫苗包含寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV。
在某些實施例中，野生型PRRSV為美洲型PRRSV。在某些實施例中，野生型PRRSV包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。在某些實施例中，野生型PRRSV含有編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。
在某些實施例中，樣品可為懷疑含有測試抗體之任何豬樣品，包括(但不限於)血液、血漿、血清及體液等。在某些實施例中，樣品為豬之血液或血漿。
在另一態樣中，本發明進一步提供本文所提供之多肽在製備偵測試劑中之用途。
在某些實施例中，可使用偵測試劑偵測來自懷疑感染PRRSV之豬之樣品中的抗體。可使用任何適合方法進行偵測，例如該等方法可包括使樣品與本文所提供之經分離多肽接觸及偵測多肽與樣品中之抗體的特異性結合。
在某些實施例中，可使用偵測試劑區分感染減毒PRRSV之豬與感染野生型PRRSV之豬。任何適合方法可用於該等方法。舉例而言，可使豬之樣品與本文所提供之多肽接觸且可偵測特異性結合於多肽之抗體的存在，其中特異性結合於本文所提供之多肽的抗體之存在表明該樣品來自感染野生型PRRSV之豬。
在另一態樣中，本發明進一步提供經分離抗體，其可特異性結合於本文所提供之多肽的免疫原性片段。
如本文所用之術語「抗體」包涵單株抗體、多株抗體、
多價抗體、雙特異性(二價)抗體以及抗原結合片段，例如(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、用二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、單鏈抗體(scFv)、scFv二聚體(二價二官能抗體)、二價單鏈抗體(BsFv)、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體或能夠特異性結合於抗原但無完整抗體結構之任何其他抗體片段。
經分離抗體可由熟習此項技術者使用此項技術中已知之任何適合方法製備。
舉例而言，為製備多株抗體，可以適合給藥頻率或時間間隔向動物(例如小鼠、兔、山羊、豬及牛等)接種(例如藉由注射)含有本文所提供之多肽的抗原組合物。可自由免疫動物收集之血清分離多株抗體。可對多株抗體進一步分離並純化(例如藉由免疫親和層析)以鑑別特異性結合於多肽或具有所要純度之抗體。製備及純化多株抗體之方法為此項技術所熟知，關於詳情，請參見：Harlow等人，Antibodies：A laboratory manual,Cold Spring Harbor,1988。
關於另一實例，為製備單株抗體，可以適當給藥頻率或時間間隔向動物(例如小鼠、兔、山羊、豬及牛等)接種(例如藉由注射)含有本文所提供之多肽的抗原組合物。收集經免疫動物之脾細胞且與骨髓瘤細胞融合以製備產生單株抗體之融合瘤細胞(參見例如Harlow等人，Antibodies：A laboratory manual,Cold Spring Harbor,1988；Monoclonal Antibody production，由National academies Press出版，
1999；J.Eryl Liddell等人，A practical guide to monoclonal antibodies，由John Wiley and Sons出版，1991)。可使用此項技術中已知之方法(諸如藉由ELISA方法、西方墨點法及免疫組織化學法等)就適宜特徵(例如高親和性及良好特異性等)篩選單株抗體(參見例如J.Eryl Liddell等人，A practical guide to monoclonal antibodies，由John Wiley and Sons出版，1991)。可特異性結合於本文所提供之多肽的單株抗體可藉由例如噬菌體呈現技術篩選並鑑別，參見例如Philippa M.O'Brien等人，Antibody phage display：methods and protocols，由Humana Press出版，2002；Kay等人，Phage display of peptides and proteins：A laboratory manual,San Diego：Academic Press,1996。
關於另一實例，抗原結合片段可藉由此項技術中已知之適合方法製備，例如(但不限於)藉由用蛋白酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)消化全長抗體或藉由在適合宿主中重組表現編碼抗原結合片段之聚核苷酸。
抗體可使用此項技術中已知之適合方法純化，例如藉由羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、親和層析、乙醇沈澱、逆相HPLC、矽膠層析、基於陰離子或陽離子交換樹脂之肝素瓊脂糖層析(諸如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦、聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及硫酸銨沈澱等，參見例如James W.Goding,Monoclonal antibodies：principles and practice，由Academic Press出版，1996。初步純化
後，可在低pH值下用疏水性相互作用層析使用pH值為約2.5-4.5且較佳低鹽濃度(例如鹽濃度為約0至0.25 M)之溶離緩衝液進一步處理抗體組合物以移除剩餘雜質。
在某些實施例中，本文所提供之抗體進一步包含結合物(參見例如「Conjugate Vaccines」，Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse及R.E.Lewis,Jr.(編)，Carger Press,New York,(1989))。結合物可藉由任何適合方法連接於本文所提供之抗體，例如(但不限於)藉由共價結合、親和結合、嵌入、配位結合、複合、黏合、混合或締合等。在某些實施例中，本文所提供之抗體上適用於結合但不影響抗原決定基結合之特定位點可進一步進行工程改造。舉例而言，該等位點可含有一或多個可與結合物或標記物形成共價鍵之反應性胺基酸殘基(諸如半胱胺酸殘基、組胺酸殘基)。在某些實施例中，抗體可間接連接於結合物或可經由另一連接子結合。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可與生物素結合，隨後間接結合於連接於抗生物素蛋白之第二結合物。
在某些實施例中，結合物為標記物。在某些實施例中，標記物可為螢光分子、化學發光分子、放射性標記物、酶標記物或染色物質。例示性螢光分子包括(但不限於)異硫氰酸螢光素(FITC)、若丹明(TRITC)、螢光素、二氯三嗪基胺基螢光素(DATF)、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、LRSC(麗斯胺-若丹明磺醯氯)、丹磺醯氯、德克薩斯紅、R-藻紅素。例示性化學發光分子包括例如(但不限於)魯米
諾及其衍生物、異魯米諾、吖啶鎓酯及其衍生物及三聯吡啶釕等。例示性放射性標記物包括(但不限於)122I、123I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y等。例示性酶標記物包括(但不限於)螢光素酶(諸如螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶、細菌螢光素酶等)、過氧化酶(諸如辣根過氧化酶)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、蘋果酸去氫酶、脲酶、醣化酶、溶菌酶、醣氧化酶(諸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶等)、及雜環加氧酶等。例示性染色物質包括(但不限於)膠體金及膠體銀等。
在另一態樣中，本發明亦提供包含本文所提供之經分離抗體的偵測試劑。偵測試劑可包含適合純度及/或適合濃度之適量經分離抗體，以便偵測試劑中之抗體適用於偵測目的。在某些實施例中，偵測試劑中之抗體為冷凍乾燥形式或溶解於適合媒劑中。
在另一態樣中，本發明亦提供偵測裝置，其包含含有抗體之偵測試劑，其中該偵測試劑連接於固體支撐物。固體支撐物可為適用於偵測目的及連接偵測試劑之任何物質。偵測試劑可使用任何適合方法(例如(但不限於)藉由固定、塗佈、吸附、噴塗、印刷等)以任何適當方式連接於固體支撐物。
在另一態樣中，本發明亦提供偵測樣品中PRRSV之存在的方法，其中該樣品來自懷疑感染PRRSV之豬，該方法包含使樣品與本文所提供之經分離抗體接觸及偵測樣品中特
異性結合於抗體之抗原的存在。
在某些實施例中，PRRSV包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。在某些實施例中，PRRSV包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。
抗體與樣品中PRRSV之抗原的特異性結合可藉由此項技術中已知之任何適合偵測方法偵測，例如(但不限於)基於夾心法、直接偵測法及競爭性結合法之方法。舉例而言，熟習此項技術者可藉由使用上述ELISA、基於免疫螢光之方法、基於化學免疫發光之方法、基於免疫放射能之方法、基於免疫層析之方法、基於免疫過濾之方法及免疫組織化學方法偵測本文之抗體與樣品中之PRRSV抗原的特異性結合(參見例如Frederick A.Murphy等人，Veterinary virology，由Elsevier出版，1999)。
在某些實施例中，樣品中PRRSV之存在藉由基於夾心法之ELISA方法偵測。舉例而言，可使用本文所提供之未標記抗體捕捉樣品中之PRRSV抗原。隨後添加經酶標記之偵測抗體以便充分形成捕捉分子-抗原-偵測抗體之三重複合物。添加酶受質且在適合條件下轉化為可偵測產物。添加受質後可偵測信號之變化間接表明樣品中PRRSV抗原之存在及/或量。樣品中PRRSV之存在亦可藉由直接偵測法偵測。舉例而言，可使與標記物結合之本文所提供抗體與樣
品接觸以便充分形成抗原-抗體複合物，且隨後可測定標記物所產生之信號。關於另一實例，可使與生物素結合之本文抗體與樣品接觸以便在結合生物素之抗體與樣品中之PRRSV抗原之間形成複合物。可進一步添加經抗生物素蛋白標記之酶以使其可特異性結合於經生物素標記之抗體，繼而添加受質。受質在與酶反應後所產生之信號可表明樣品中PRRSV抗原之存在。
在某些實施例中，樣品中PRRSV抗原之存在可藉由基、於免疫螢光之方法、基於化學免疫發光之方法及基於免疫放射能之方法偵測。其以類似於ELISA之方式起作用，但例外為其使用不同標記物，例如螢光分子、化學發光物質或放射性物質，從而又需要不同偵測方法及裝置，諸如螢光顯微鏡、螢光偵測器、化學發光偵測器或γ計數器。
在某些實施例中，可使用基於免疫層析之方法偵測樣品中PRRSV抗原之存在。舉例而言，可將本文所提供之抗體固定在免疫層析裝置之固體支撐物上，其中含有PRRSV抗原之樣品沿固體支撐物且朝向固定在分離區域上之標記試劑及抗體流動。PRRSV抗原在與標記試劑接觸後經標記，隨後經由特異性結合由經固定抗體捕捉，從而在捕捉區域形成可見墨點或線。可在基於免疫層析之方法中使用陽性對照。亦可使用基於免疫過濾之方法，其以類似於免疫層析方法之方式起作用，但例外為藉由過濾而非層析分離抗原-抗體複合物。
在某些實施例中，樣品中PRRSV抗原之存在可藉由基於
免疫組織化學之方法偵測。舉例而言，可固定測試樣品(參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，」第3版，(1960)Lee G.Luna,HT(ASCP)編，The Blakston Division McGraw-Hill Book Company,New York)，隨後與本文所提供之抗體接觸以便其特異性結合。若使用經標記抗體，則樣品中PRRSV抗原之存在可經由標記物直接偵測。若使用未標記抗體，則可添加特異性結合於未標記抗體之經標記偵測抗體以形成抗原-抗體-偵測抗體之三重複合物。樣品中PRRSV抗原之存在可藉由偵測三重複合物來確定。
在另一態樣中，本發明亦提供一種區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法，其包含：使豬之樣品與本文所提供之抗體接觸，偵測樣品中特異性結合於抗體之抗原的存在，其中樣品中存在該抗原表明該樣品來自感染野生型PRRSV之豬。樣品中不存在抗體可表明該樣品來自未受感染之豬或感染減毒PRRSV之豬。
在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒美洲型PRRSV。在某些實施例中，減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽的聚核苷酸片段。在某些實施例中，
減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1具有至少80%同源性之多肽的聚核苷酸片段。
在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒PRRSV活疫苗。在某些實施例中，減毒PRRSV活疫苗含有寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV。
在某些實施例中，野生型PRRSV為美洲型PRRSV。在某些實施例中，野生型PRRSV包含一個編碼與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。在某些實施例中，野生型PRRSV包含一個編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。
在某些實施例中，樣品可為懷疑含有PRRSV抗原之任何豬樣品，包括(但不限於)血液、血漿、體液、分泌物、排泄物、組織樣品等。在某些實施例中，豬之樣品為豬之血液、血漿、呼吸分泌物及排泄物。
在另一態樣中，本發明進一步提供本文之抗體在製備偵測試劑中之用途。
在某些實施例中，可使用偵測試劑偵測來自懷疑感染PRRSV之豬之樣品中的PRRSV抗原。可使用任何適合方法偵測，例如該等方法可包括使樣品與本文所提供之經分離抗體接觸及偵測抗體與樣品中之抗原的特異性結合。
在某些實施例中，可使用偵測試劑區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬。任何適合方法可用於該等方法。舉例而言，可使豬之樣品與本文所提供之抗體接觸且可偵測特異性結合於抗體之PRRSV抗原的存在，其中特異性結合於抗體之PRRSV抗原的存在表明該樣品來自感染野生型PRRSV之豬。
在另一態樣中，本發明進一步提供套組，其包含本文所提供之經分離多肽，其中該多肽連接於固體支撐物。
在某些實施例中，套組包含一種多肽，該多肽包含Nsp2蛋白序列之一或多個免疫原性片段，其中該免疫原性片段不存在於減毒PRRSV之Nsp2蛋白序列中但存在於野生型PRRSV之Nsp2蛋白序列中。在某些實施例中，野生型PRRSV為高病原性PRRSV。在某些實施例中，套組包含一種多肽，該多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段。在某些實施例中，免疫原性片段包含至少六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個或十五個胺基酸。
固體支撐物可為適用於偵測及連接偵測試劑之任何物質。實例包括(但不限於)塑膠盤、塑膠板、硝化纖維素濾膜、玻璃纖維膜、玻璃板及珠粒等。多肽可藉由任何適合方法(例如(但不限於)藉由固定、塗佈、吸附、噴塗及印刷
等)連接於適當固體支撐物。連接於固體支撐物之多肽適用於偵測目的，例如，該連接足夠強且連接量足以滿足偵測等。熟習此項技術者可視需要根據欲使用之偵測方法選擇適合連接方法。
在某些實施例中，套組進一步包含偵測抗體。偵測抗體可以適合形式(例如冷凍乾燥粉末或溶液形式等)提供。在某些實施例中，偵測抗體為抗豬抗體，例如(但不限於)小鼠抗豬抗體、大鼠抗豬抗體、兔抗豬抗體、山羊抗豬抗體、雞抗豬抗體及驢抗豬抗體等。
偵測抗體可進一步用例如(但不限於)酶、螢光分子、化學發光分子、放射性物質、染色劑等標記。舉例而言，經標記偵測抗體可為經酶標記之抗體、經螢光標記之偵測抗體、經化學發光物質標記之偵測抗體、經放射性物質標記之偵測抗體、經膠體金標記之抗體等。視情況，在某些實施例中，套組可進一步包含標記物之偵測試劑，例如酶之受質、受質顯色溶液及反應終止緩衝劑等。
視情況，套組可進一步包含一或多種適用於偵測之試劑，例如(但不限於)樣品稀釋劑、洗滌緩衝劑、陽性對照血清及陰性對照血清等。視情況，套組可進一步包含一或多種適用於儲存之試劑，例如(但不限於)乾燥劑等。套組亦可包含規定套組之使用、儲存條件或預防措施之說明書。
在某些實施例中，套組亦可進一步包含減毒PRRSV之製劑。減毒PRRSV可為減毒美洲型PRRSV。在某些實施例
中，減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽的聚核苷酸片段。在某些實施例中，減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1具有至少80%同源性之多肽的聚核苷酸片段。
在某些實施例中，減毒PRRSV為減毒PRRSV活疫苗。在某些實施例中，減毒PRRSV自高病原性PRRSV減毒。在某些實施例中，PRRSV減毒活疫苗含有寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV。
減毒PRRSV可以適用於動物免疫之形式提供。在某些實施例中，減毒PRRSV以無菌組合物形式提供。在某些實施例中，減毒PRRSV以冷凍乾燥無菌組合物形式提供。在某些實施例中，減毒PRRSV進一步包含低溫保護劑。低溫保護劑可在凍乾處理期間使減毒PRRSV保持良好穩定性且降低對減毒PRRSV之生物活性的損傷。例示性低溫保護劑包括(但不限於)蔗糖、L-麩胺酸鈉或乳白蛋白水解物及明膠等。
套組中之減毒PRRSV可藉由此項技術中已知之方法製備。舉例而言，減毒PRRSV可在支持其生長之細胞(諸如
Marc-15細胞)中繁殖，且在培養細胞展示預定程度之細胞病變效應時可收集病毒溶液。視情況，可將所收集之減毒PRRSV與適當賦形劑(例如(但不限於)低溫保護劑及抗生素等)進一步混合。賦形劑可為無菌的。
在另一態樣中，本發明進一步提供寡核苷酸引子，其適用於偵測樣品中PRRSV之存在。可使用寡核苷酸引子擴增源自樣品之聚核苷酸模板(諸如cDNA模板)，且可分析擴增產物以確定樣品中PRRSV之存在或確定樣品中所存在之PRRSV的某些缺失。
如本文所用之「引子」係指長度為10-38個核苷酸、較佳15-30個核苷酸或15-25個核苷酸或17-25個核苷酸之寡核苷酸分子。舉例而言，引子可為長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸之寡核苷酸。引子通常用於藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA序列。對於欲擴增之DNA模板序列，可在其5'上游及其3'下游序列設計引子對，亦即5'引子及3'引子，其各自可與DNA雙股模板之各別股特異性雜交。5'引子與DNA雙股模板之反義股互補；且3'引子與DNA模板之有義股互補。如此項技術中已知，雙股DNA模板之「有義股」為序列與自DNA模板轉錄之mRNA序列一致(但例外為RNA中之「U」對應於DNA中之「T」)的股且編碼蛋白質產物。在本發明中，SEQ ID NO：5-6、8-19均為有義股DNA。有義股之互補序列為「反義
股」，由此與SEQ ID NO：5-6、8-19互補之序列為DNA模板之反義股。
如本文所用之「雜交」係指引子與模板DNA之間經由鹼基配對形成氫鍵之過程。如本文所用之「特異性雜交」意謂引子與模板DNA之間形成足量氫鍵以便模板DNA可藉由PCR擴增。在某些實施例中，引子之至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%核苷酸與模板DNA形成氫鍵。在某些實施例中，引子與模板DNA互補。如本文所用之術語「互補」與術語「特異性雜交」可互換使用。
可使用引子經由PCR反應擴增DNA模板序列。PCR通常包括多個反應循環，其各包括變性步驟、退火步驟及延伸步驟等。在變性期間，將反應物加熱至高溫且使DNA雙股熔融成單股DNA分子。將溫度降至退火溫度，此時5'引子及3'引子分別與DNA模板之各單股上其目標序列特異性雜交。與5'引子雜交之DNA模板序列稱作5'上游序列，且與3'引子雜交之DNA模板序列稱作3'下游序列。在延伸步驟期間，DNA聚合酶藉由沿5'至3'方向添加與DNA模板互補之核苷酸在3'端延長引子，從而合成與DNA模板股互補之新DNA股。新合成之DNA鏈可充當後續反應循環中之DNA模板。以此方式，5'上游序列與3'下游序列之間的DNA模板序列(亦即欲擴增序列)可經由PCR以指數形式擴增，且其所得DNA產物通常稱作擴增產物。通常，擴增產物之長度長於或至少等於5'引子與3'引子之長度的總和。擴增產
物之有義股的5'端序列為5'引子之序列，且反義股的5'端序列為3'引子之序列。
在某些實施例中，欲使用本文所提供之寡核苷酸引子擴增之序列包含Nsp2蛋白之至少部分編碼序列，其中該編碼序列不存在於減毒PRRSV之Nsp2編碼序列中但存在於野生型PRRSV之Nsp2編碼序列中。
在某些實施例中，本文所提供之寡核苷酸引子可擴增經典型PRRSV之核苷酸序列。如本文所用之「經典型PRRSV」係指在與VR-2332(美洲型PRRSV之標準株)比較時，Nsp2編碼序列實質上不含缺失之PRRSV。如本文所用之「實質上不含缺失」意謂不存在之核苷酸數小於或等於10、9、8、7、6、5、4或3個。經典型PRRSV可為序列已知之PRRSV，例如(但不限於)PRRSV VR-2332株及16244B株(Genbank寄存編號：AF046869)。
在某些實施例中，可使用本文所提供之寡核苷酸引子鑑別高病原性PRRSV。高病原性PRRSV包含在與VR-2332比較時缺乏90個不連續核苷酸之Nsp2編碼序列(參見例如圖1、圖2，Tian等人，PLoS ONE2(6)：e526,(2007)數位物件識別號：10.1371)。高病原性PRRSV之Nsp2編碼序列中實質上無其他缺失。在某些實施例中，可使用本文所提供之寡核苷酸引子鑑別樣品中PRRSV中之90個不連續核苷酸的存在，從而可適用於測定樣品中所存在之PRRSV的病原性。
在某些實施例中，可使用本文所提供之寡核苷酸引子鑑
別減毒PRRSV。如上所述，減毒PRRSV之Nsp2編碼序列中含有序列缺失，從而降低其病原性。在某些實施例中，減毒PRRSV之Nsp2編碼序列缺乏360個核苷酸之片段，其編碼與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之多肽。在某些實施例中，減毒PRRSV之Nsp2編碼序列實質上不含其他序列缺失。在某些其他實施例中，減毒PRRSV之Nsp2編碼序列進一步缺乏其他核苷酸序列，例如進一步缺乏上文所揭示之90個不連續核苷酸。在某些實施例中，減毒PRRSV為寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV(亦即PRRSV TJM株)。
在某些實施例中，本申請案提供第一對經分離寡核苷酸引子，其包含5'引子及3'引子，其中5'引子與同選自由SEQ ID NO：8-10及與SEQ ID NO：8-10中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；3'引子與選自由SEQ ID NO：13-19及與SEQ ID NO：13-19中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；5'引子及3'引子各自之長度為10個核苷酸至38個核苷酸；5'引子及3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且擴增序列之長度超過或至少等於5'引子與3'引子之組合長度。引子在Nsp2編碼序列上之相對位置展示於圖1(b)中。
在某些實施例中，本申請案提供使用第一對經分離寡核苷酸引子偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用第一對經分離寡核苷酸引子擴增測試樣品及對照樣品中之
RNA的逆轉錄產物，及偵測兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定測試樣品與對照樣品之擴增產物之間的差異，其中該差異表明樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。若擴增產物不存在於測試樣品中但存在於對照樣品中，則表明測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
在某些實施例中，測定該差異包含比較測試樣品之擴增產物與對照樣品之擴增產物的分子量，其中藉由使用相同引子對，對照樣品之擴增產物的分子量與經典型PRRSV之擴增產物的分子量相當。若測試樣品中所偵測之擴增產物比對照樣品短約90個核苷酸，則表明測試樣品含有高病原性PRRSV。若測試樣品中所偵測之擴增產物比對照樣品短約360或450個核苷酸，則表明測試樣品含有減毒PRRSV。若測試樣品中所偵測之擴增產物的分子量類似於對照樣品的分子量，則表明測試樣品含有經典型PRRSV。
「對照樣品」在關於本文之PCR偵測方法使用時，可為使用本文所提供之引子獲得的經典型PRRSV之擴增產物(亦即使用自經典型PRRSV逆轉錄之cDNA獲得的擴增產物)，或可為與經典型PRRSV之擴增產物具有相同或相當分子量的任何聚核苷酸片段。
熟習此項技術者應瞭解，若樣品中不存在PRRSV，則引子對不能藉由PCR產生擴增產物，這是因為不存在引子對之DNA模板。若樣品中所存在之PRRSV缺乏SEQ ID NO：13，則與SEQ ID NO：13互補之3'引子不會與DNA模板特異性雜交，從而不能合成相應DNA單股，因此不會產生雙股
擴增產物。若樣品中所存在之PRRSV缺乏SEQ ID NO：13，則擴增產物可經由PCR擴增使用與SEQ ID NO：13之3'下游區互補之3'引子及上述5'引子中之一者獲得。因為此擴增產物不含SEQ ID NO：13，所以理論上比經典型PRRSV之擴增產物短約360 bp。類似地，若樣品中所存在之PRRSV缺乏90個不連續核苷酸與SEQ ID NO：13，則理論上藉由該引子對獲得之擴增產物應比經典型PRRSV之擴增產物短約450 bp。若樣品中所存在之PRRSV僅缺乏90個不連續核苷酸，則理論上擴增產物應比經典型PRRSV之擴增產物短約90 bp。藉由偵測擴增產物之存在及/或分析擴增產物之分子量，熟習此項技術者將知曉樣品中PRRSV之Nsp2核苷酸序列中任何缺失的不存在或存在及/或大小。樣品中PRRSV之病原性可基於此等缺失之相應生物學含義而確定。舉例而言，相對於陽性對照(例如經典型PRRSV之擴增產物)，擴增產物僅缺乏90 bp之PRRSV很可能為高病原性PRRSV，擴增產物僅缺乏360 bp之PRRSV很可能為減毒PRRSV且擴增產物缺乏450 bp之PRRSV亦很可能為減毒PRRSV。測試豬可根據豬樣品中PRRSV之病原性適當分組，以便感染高病原性PRRSV或野生型PRRSV之豬可與未感染或已免疫之豬分離，從而預防病原性病毒之進一步傳播且降低可能的經濟損失。
在某些實施例中，本發明提供第二對經分離寡核苷酸引子，其含有5'引子及3'引子，其中5'引子與同選自由SEQ ID NO：11及與SEQ ID NO：11具有至少80%同源性之序列
組成之群的序列反義的序列互補，且3'引子與選自由SEQ ID NO：13-19及與SEQ ID NO：13-19中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；5'引子及3'引子各自之長度為10個核苷酸至38個核苷酸；5'引子及3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且擴增序列之長度超過或至少等於5'引子與3'引子之組合長度。
在某些實施例中，本申請案提供使用第二對經分離寡核苷酸引子偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用第二對經分離寡核苷酸引子擴增測試樣品及對照樣品中之RNA的逆轉錄產物，及偵測兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定測試樣品與對照樣品之擴增產物之間的差異，其中該差異表明樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。若擴增產物不存在於測試樣品中但存在於對照樣品中，則表明測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
在某些實施例中，測定該差異包含比較測試樣品之擴增產物與對照樣品之擴增產物的分子量，其中藉由使用相同引子對，對照樣品之擴增產物的分子量與經典型PRRSV之擴增產物的分子量相當。若測試樣品中所偵測之擴增產物比對照樣品短約360個核苷酸，則表明測試樣品含有減毒PRRSV。若測試樣品中所偵測之擴增產物的分子量類似於對照樣品的分子量，則表明測試樣品含有經典型PRRSV。
在某些實施例中，本申請案提供第三對經分離寡核苷酸引子，其包含5'引子及3'引子，其中5'引子與同選自由SEQ ID NO：11-13及與SEQ ID NO：11-13中之任一者具有至少
80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補，且3'引子與選自由SEQ ID NO：14-16及與SEQ ID NO：14-16中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；5'引子及3'引子各自之長度為10個核苷酸至38個核苷酸；5'引子及3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且擴增序列之長度超過或至少等於5'引子與3'引子之組合長度。
在某些實施例中，本申請案提供使用第三對經分離寡核苷酸引子偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用第三對經分離寡核苷酸引子擴增測試樣品及對照樣品中之RNA的逆轉錄產物，及偵測兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定測試樣品與對照樣品之擴增產物之間的差異，其中該差異表明樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。若擴增產物不存在於測試樣品中但存在於對照樣品中，則表明測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
在某些實施例中，測定該差異包含比較測試樣品之擴增產物與對照樣品之擴增產物的分子量，其中藉由使用相同引子對，對照樣品之擴增產物的分子量與經典型PRRSV之擴增產物的分子量相當。若測試樣品中所偵測之擴增產物比對照樣品短約360個核苷酸，則表明測試樣品含有減毒PRRSV。若測試樣品中所偵測之擴增產物的分子量類似於對照樣品的分子量，則表明測試樣品含有經典型PRRSV。
在某些實施例中，本申請案提供第四對經分離寡核苷酸引子，其包含5'引子及3'引子，其中5'引子與同選自由SEQ
ID NO：12及與SEQ ID NO：12具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；3'引子與選自由SEQ ID NO：17-19及與SEQ ID NO：17-19中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；5'引子及3'引子各自之長度為10個核苷酸至38個核苷酸；5'引子及3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且擴增序列之長度超過或至少等於5'引子與3'引子之組合長度。
在某些實施例中，本申請案提供使用第四對經分離寡核苷酸引子偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用第四對經分離寡核苷酸引子擴增測試樣品及對照樣品中之RNA的逆轉錄產物，及偵測兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定測試樣品與對照樣品之擴增產物之間的差異，其中該差異表明樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。若擴增產物不存在於測試樣品中但存在於對照樣品中，則表明測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
在某些實施例中，測定該差異包含比較測試樣品之擴增產物與對照樣品之擴增產物的分子量，其中藉由使用相同引子對，對照樣品之擴增產物的分子量與經典型PRRSV之擴增產物的分子量相當。若測試樣品中所偵測之擴增產物比對照樣品短約360個核苷酸，則表明測試樣品含有減毒PRRSV。若測試樣品中所偵測之擴增產物的分子量類似於對照樣品的分子量，則表明測試樣品含有經典型PRRSV。
在某些實施例中，本申請案提供第五組經分離寡核苷酸引子，其包含5'引子及3'引子，其中5'引子與同選自由SEQ
ID NO：8-10及與SEQ ID NO：8-10中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；3'引子與選自由SEQ ID NO：13及與SEQ ID NO：13中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中5'引子及3'引子之長度分別為10個核苷酸至38個核苷酸；5'引子及3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且擴增序列之長度超過或等於5'引子與3'引子之組合長度。
在某些實施例中，本申請案提供使用第五對經分離寡核苷酸引子偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用第五對經分離寡核苷酸引子擴增測試樣品及對照樣品中之RNA的逆轉錄產物，及偵測兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定測試樣品與對照樣品之擴增產物之間的差異，其中該差異表明樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。若擴增產物不存在於測試樣品中但存在於對照樣品中，則表明測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
在某些實施例中，測定該差異包含比較測試樣品之擴增產物與對照樣品之擴增產物的分子量，其中藉由使用相同引子對，對照樣品之擴增產物的分子量與經典型PRRSV之擴增產物的分子量相當。若測試樣品中所偵測之擴增產物比對照樣品短約90個核苷酸，則表明測試樣品含有高病原性PRRSV。若測試樣品中所偵測之擴增產物的分子量類似於對照樣品的分子量，則表明測試樣品含有經典型PRRSV。
在某些實施例中，本申請案提供第六組經分離寡核苷酸
引子，其包含5'引子及3'引子，其中5'引子與同選自由SEQ ID NO：13及與SEQ ID NO：13具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；3'引子與選自由SEQ ID NO：13及與SEQ ID NO：13中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中5'引子及3'引子之長度分別為10個核苷酸至38個核苷酸；5'引子及3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且擴增序列之長度超過或等於5'引子與3'引子之組合長度。
在某些實施例中，本申請案提供使用第六對經分離寡核苷酸引子偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用第六對經分離寡核苷酸引子擴增測試樣品及對照樣品中之RNA的逆轉錄產物，及偵測兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定測試樣品與對照樣品之擴增產物之間的差異，其中該差異表明樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。若擴增產物不存在於測試樣品中但存在於對照樣品中，則表明測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
在另一態樣中，本發明另外提供包含擴增產物之經分離DNA片段，其中該擴增產物經由在含有PRRSV之樣品及本文所提供之5'引子及3'引子對存在下進行聚合酶鏈反應獲得。在某些實施例中，5'引子及3'引子為第一對經分離寡核苷酸引子、第二對經分離寡核苷酸引子、第三對經分離寡核苷酸引子、第四對經分離寡核苷酸引子、第五對經分離寡核苷酸引子或第六對經分離寡核苷酸引子。
如此項技術中已知，適合引子雜交位置及引子序列可根
據熟習此項技術者之常識來選擇。舉例而言，引子雜交之位置可根據欲擴增序列之長度來選擇。舉例而言，若5'引子之位置確定，則3'引子之雜交位置可基於擴增產物之預期大小及5'引子之雜交位置來選擇，且反之亦然。
熟習此項技術者可根據此項技術之常識確定擴增產物之適合長度。在某些實施例中，擴增產物之長度小於或等於6000個鹼基對(6000 bp)、5500 bp、5000 bp、4500 bp、4000 bp、3500 bp或3000 bp。在某些實施例中，擴增產物之長度可在以下範圍內，例如約100 bp至約3000 bp、約100 bp至約2500 bp、約100 bp至約2000 bp、約100 bp至約1900 bp、約100 bp至約1800 bp、約100 bp至約1700 bp、約100 bp至約1600 bp、約100 bp至約1500 bp、約100 bp至約1400 bp、約100 bp至約1300 bp、約100 bp至約1200 bp、約100 bp至約1100 bp、約100 bp至約1000 bp或約100 bp至約800 bp等。在某些實施例中，擴增片段之適合長度可基於相關缺失片段之長度選擇。舉例而言，擴增產物之長度可經選擇以使得可藉由電泳揭示擴增產物中相關缺失之存在或不存在。舉例而言，若相關缺失片段為360 bp，則相應擴增產物可小於或等於6000 bp、5500 bp、5000 bp、4500 bp、4000 bp、3500 bp或3000 bp，且若相關缺失片段為90 bp，則相應擴增產物可小於或等於3000 bp、2500 bp、2000 bp。
一旦選擇引子雜交之位置及/或確定擴增片段之長度及序列，即可使用此項技術中已知之方法容易地設計引子序
列及PCR方案，參見例如J.Bartlett等人，PCR Protocols，由Humana Press出版，2003；A.Yuryev,PCR primer design，由Humana Press出版，2007。
在某些實施例中，與SEQ ID NO：8互補之5'引子為5'-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3'。在某些實施例中，與SEQ ID NO：15互補之3'引子為5'-CGCCGAGAAGACCCAGA-3'。
在某些實施例中，本發明提供一對引子，其中5'引子為5'-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3'，且3'引子為5'-CGCCGAGAAGACCCAGA-3'。
在某些實施例中，本文所提供之生物樣品來自懷疑感染PRRSV之豬。生物樣品可為例如(但不限於)血液、血漿、體液、分泌物(諸如呼吸道分泌物)、排泄物(諸如尿、糞便等)、組織樣品(諸如淋巴組織、肺組織及肌肉組織)等。
在某些實施例中，逆轉錄產物可經由逆轉錄PCR(RT-PCR)獲得。舉例而言，可常規處理懷疑感染PRRSV之豬的樣品以進行RNA分離(例如使用Trizol)，隨後使用RT-PCR使RNA逆轉錄，獲得RNA之逆轉錄產物(例如藉由使用無規六聚物引子及逆轉錄聚合酶，或藉由使用特別針對PRRSV序列設計之引子及逆轉錄聚合酶，亦參見例如J.O'Connell,RT-PCR protocols,Methods in Molecular Biology，第193卷，由Humana Press出版，2002)。
可使用逆轉錄產物作為DNA模板且使用本文所提供之引子對進行擴增。在某些實施例中，逆轉錄產物藉由PCR擴
增。熟習此項技術者可基於此項技術中已知之方法選擇及最佳化PCR反應條件，例如聚合酶類型、溫度、反應循環數及PCR中所用之反應體積等(參見例如J.Bartlett等人，PCR Protocols，由Humana Press出版，2003)。
可藉由此項技術中已知之任何適合方法(例如(但不限於)藉由瓊脂糖凝膠電泳)偵測擴增產物之存在。適合偵測分子可選用於偵測，例如(但不限於)DNA雙股嵌入染料(諸如溴化乙錠、結合於DNA雙股之螢光染色劑等)。
視情況，可進一步量測擴增產物之分子量。舉例而言，可在電泳中使用DNA分子量標記，且將擴增產物之電泳條帶與DNA分子量標記的電泳條帶比較。關於另一實例，可使用經典型PRRSV之擴增產物作為陽性對照，這是因為其擴增產物之長度可基於其已知序列預測。
在以下實例中描述本發明，闡述該等實例以幫助理解本發明且其不應視為以任何方式限制本發明之範疇，本發明之範疇由其後申請專利範圍界定。
在本發明者之實驗室中分離PRRSV TJ株。當使該病毒株繼代至第92代時，在Nsp2基因中發現序列缺失，且發現其毒性減弱。製備減毒株PRRSV TJM-F92(亦即PRRSV TJM株)且開發作為PRRS減毒活疫苗，其特徵在於其Nsp2核苷酸序列全長為2490 bp。該Nsp2核苷酸在與PRRSV TJ株之Nsp2核苷酸比較時缺乏編碼PRRSV TJ株之Nsp2蛋白
的第598個至第717個胺基酸(參見圖4，SEQ ID NO：1)的360個連續核苷酸(參見圖3)。PPRSV TJM株之Nsp2蛋白在與PRRSV VR-2332株之Nsp2蛋白比較時總共缺乏150個胺基酸，包括PRRSV VR-2332之Nsp2蛋白的第481個胺基酸、第537個至第565個胺基酸及第628個至第747個胺基酸。
藉由分析PRRSV TJM株之Nsp2蛋白中缺失的120個胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：1)鑑別出較佳B細胞抗原決定基，且建立區別PRRSV毒性株與PRRSV TJM疫苗株之ELISA方法。本發明者之實驗室中鑑別並合成出對SEQ ID NO：1有特異性之較佳B細胞抗原抗原決定基(圖5所示之胺基酸序列)。其可用於大規模偵測PRRSV抗體，從而促進PRRSV疫苗(例如TJM株)之廣泛使用且提供根除PRRS之便利方法。
1.實驗材料
1.1塗佈抗原：合成圖5所示之合成B細胞抗原決定基多肽。
1.2測試血清及測試動物：由本發明者藉由習知方法使用對PRRS抗體呈陰性之豬製備PRRSV(TJ株)陽性血清與PRRSV(TJM株)免疫血清。標準陰性血清為由IDEXX PRRS抗體套組(購自Beijing IDEXX Yuanheng Biotech.Co.,Ltd.)偵測為陰性之血清。
2.通用實驗方法及條件之最佳化
將間接ELISA方法用於實驗，且根據習知方法在微量滴
定盤上執行偵測。一般而言，用0.05 M pH 9.6碳酸氫鹽緩衝液稀釋本文所提供之合成B細胞抗原決定基，隨後塗佈於微量滴定盤上且置放在4℃下隔夜。次日，洗滌微量滴定盤且用阻斷緩衝液阻斷2小時。洗滌滴定盤後，添加測試血清且將滴定盤置於37℃培育箱中反應45分鐘。洗滌滴定盤，隨後添加適合濃度之酶結合抗體，隨後置放於37℃培育箱中反應1小時。洗滌滴定盤且添加受質顯色溶液。在37℃下反應10-15分鐘後，添加2 M H2SO4以終止反應。由微盤讀取器測定OD450 nm值。實驗包括陽性血清、陰性血清及免疫血清作為對照。
執行一系列實驗以關於以下條件最佳化間接ELISA診斷方法：抗原濃度及血清之稀釋倍數；阻斷試劑及阻斷時間；一次抗體之稀釋倍數及反應時間；經酶標記之二次抗體的稀釋倍數及反應時間；及受質反應時間。確立ELISA方法之最佳條件，詳情如下。
2.1測定及合成B細胞抗原決定基
由生物學軟體DNAStar將PRRSV TJ株之Nsp2蛋白的全長序列與PRRSV TJM-F92疫苗株的Nsp2蛋白之全長序列對準，鑑別丟失之核苷酸序列(參見圖3)，由此產生丟失之胺基酸序列(參見圖4)。
使用DNAStar中之凱蒂-杜利特爾程式(Kyte-Doolittle program)分析PRRSV TJM株中丟失之胺基酸序列以預測其親水性，使用愛米麗程式(Emini program)分析來預測蛋白質之表面可及性，且使用詹姆士-沃夫程式(Jameson-Wolf
program)分析來預測抗原性指數。基於所預測抗原決定基之綜合分析及評定根據20個胺基酸殘基之抗原性指數選擇適合B細胞抗原決定基(參見圖5)。由Beijing SBS Genetech Co.,Ltd.合成該等抗原決定基。
2.2較佳B細胞抗原決定基之表徵
將B抗原決定基多肽溶解且用0.05 M pH 9.6碳酸氫鹽緩衝液(CBS)1：100稀釋，隨後在4℃下以每孔100 μL塗佈於微盤上隔夜。移除溶液且用0.02 mol/L含有0.05% Tween-20之PBS(PBST，pH 7.2)洗滌微盤5分鐘×4次。以每孔100 μL添加含有10%胎牛血清之PBST且在37℃下反應1小時。洗滌微盤且在37℃下與以1：10000稀釋之每孔100 μL兔抗豬二次抗體反應1小時。洗滌微盤且在37℃下與每孔100 μL新鮮製備之TMB受質溶液反應15分鐘。每孔添加50 μL 2 M H2SO4溶液以終止反應，且在微盤讀取器上量測OD450值。各樣品重複測試兩次，且求出平均值。選擇提供相對較高OD值且對於PRRSV TJM疫苗之免疫血清及陰性血清產生類似結果的多肽。圖5所示之三種抗原決定基多肽均展示適用於產生ELISA套組之OD值。結果展示於表1中。
2.3確定B細胞抗原決定基多肽之最佳塗佈量及最佳血清稀釋度
將所選多肽分別連續稀釋至50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125及0.390625 μg/mL，隨後將其塗佈於微盤上且置放在4℃下隔夜。洗滌微盤且阻斷，之後添加分別以50、100、200及400倍稀釋之陽性血清。使用棋盤滴定確定最佳抗原濃度及最佳血清稀釋度。為提供最大OD值且經濟地使用抗原，最佳抗原塗佈濃度經測定為12.5 μg/mL，且最佳血清稀釋度經測定為1：200，以提供測試血清對反應之最佳濃度。
為選擇適合阻斷緩衝液，在ELISA分析中在37℃下以每孔100 μL測試10%胎牛血清、5%去脂奶及1%牛血清白蛋白2小時。結果展示含有10%胎牛血清之阻斷緩衝液以高特異性有效阻斷表面上殘餘活性位點且提供最佳及滿意的阻斷作用。因此，使用含有10%胎牛血清之PBS緩衝液作為本文所提供之實例中的阻斷緩衝液且阻斷時間為2小時。藉由將8 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO4．12HO及0.5 g KH2PO4溶解於1 L水中製備PBS緩衝液(0.01 M pH 7.4)。
2.5確定測試血清之最佳反應時間
用多肽塗佈微盤，且根據間接ELISA程序分別與經最佳稀釋之PRRS陰性血清及陽性血清在37℃下分別反應30、45、60及90分鐘。45分鐘之反應時間提供最高OD值以及最大P/N比。因此，測試血清之最佳反應時間設定為45分鐘。
2.6確定經酶標記之二次抗體的最佳稀釋度及反應時間
用多肽塗佈微盤，且分別與經最佳稀釋之PRRS陰性血清及陽性血清在37℃下反應最佳反應時間。分別以1：5000、1：10000、1：20000及1：40000稀釋經酶標記之二次抗體。各稀釋度重複執行四次，且各重複樣反應30、45、60或90分鐘。洗滌微盤，隨後添加新鮮製備之受質溶液。二次抗體之1：10000稀釋度及60分鐘之反應時間提供最大P/N比，從而鑑別為最佳稀釋度及最佳反應時間。
2.7確定受質作用時間
在以上確定之最佳條件下執行ELISA分析。將新鮮製備之受質溶液添加至各分析孔中，且在8、10、12、15、18或20分鐘後，向各別分析孔中添加2 M H2SO4 50 μL，且在微盤讀取器上量測OD450值。15分鐘之反應時間提供最大P/N比，因此，最佳受質反應時間經測定為15分鐘。
2.8分析分析結果
在上述最佳反應條件下分析50份已由IDEXX PRRS抗體測試套組測試為PRRS陰性之豬血清，且使用下式計算S/P值：S/P值=(樣品OD值-陰性對照OD值)/(陽性對照OD值-陰性對照OD值)。根據統計分析結果，陰性樣品之平均S/P為X=0.593，且標準偏差SD=0.064。將信賴區間之上限定義為陽性血清之下限，亦即X+3SD=0.785。懷疑病例定義為X+2SD=0.721。根據統計方法，若樣品之S/P值X+3SD，則以99.7%可靠度預測樣品為PRRS陽性樣品。相應地確定分析標準，亦即S/P值0.785意謂陽性，S/P值0.721意謂陰性，且其間某處之值意謂懷疑樣品。
1製備塗佈抗原之微盤
1.1塗佈：組合三種較佳抗原(亦即SEQ ID NO：2-4)且用於塗佈ELISA微盤。用100 μL抗原組合塗佈微盤之各測試孔，其中各抗原之最終濃度為12.5 μg/mL。遮蓋微盤且在4℃冰箱中培育隔夜。
1.2洗滌：培育隔夜後，移除微盤中之塗佈溶液，且用洗滌緩衝液(0.01 M pH 7.4含有0.05% Tween20之PBS)洗滌微盤3次。
1.3阻斷：使用阻斷緩衝液(含有10%胎牛血清之PBS)阻斷微盤，遮蓋且在37℃培育箱中培育2小時。
1.4洗滌：移除微盤中之阻斷緩衝液且洗滌3次。
1.5儲存：將經塗佈微盤儲存在4℃下，且儲存期限經確定為6個月。
2製備陰性血清
2.1動物：使用4-6週齡之PRRS陰性豬。
2.2陰性對照血清製備：自PRRS陰性豬收集血液，分離血清且經由0.22 μm濾膜過濾，隨後在無菌條件下每小瓶分配0.2 ml且儲存在-20℃下。在液體狀態下，血清應呈現淺黃色或微紅色澄清液體，且應無菌。
3製備感染陽性血清
3.1動物：使用4-6週齡之PRRS陰性豬且在負壓隔離室中飼養。
3.2病原體：使用PRRSV TJ株感染動物。
3.3滴定：用0.01 M PBST緩衝液(pH 7.4含有0.05% Tween-20之PBS)1：200稀釋標準陽性血清及獲自感染動物之血清且藉由ELISA分析。標準陽性血清之S/P值0.785。
3.4感染陽性血清製備：自具有合格血清抗體力價之豬的前腔靜脈收集血液，分離血清且經由0.22 μm濾膜過濾，隨後在無菌條件下每小瓶分配0.2 ml且儲存在-20℃下。
4製備免疫陽性血清
4.1動物：使用4-6週齡之PRRS陰性豬且在負壓隔離室中飼養。
4.2病原體：使用PRRSV TJM株使動物免疫。
4.3滴定：稀釋獲自免疫動物之血清且藉由ELISA使用IDEXX套組與實例1中所提供之B細胞抗原決定基多肽進行分析。免疫血清在IDEXX套組中展示陽性結果且在使用實例1之多肽的情況下展示陰性結果。
4.4免疫陽性血清製備：自具有合格血清抗體力價之豬的前腔靜脈收集血液，分離血清且經由0.22 μm濾膜過濾，隨後在無菌條件下每小瓶分配0.2 ml且儲存在-20℃下。
5.製備經酶標記之抗體
經辣根過氧化酶(HRP)標記之山羊抗豬IgG購自Sigma-Aldrich(US)。使用0.01 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)1：10000稀釋經HRP標記之抗體，且經由0.22 μm濾膜過濾。
6.製備受質顯色溶液
藉由將10 mg四甲基聯苯胺(TMB)溶解於1 ml二甲亞碸(DMSO)中繼而混合來製備顯色溶液A。藉由向700 ml無菌去離子水中依序添加10.3 g檸檬酸．H2O、35.8 g Na2HPO4．12H2O、1.0 g過氧化氫脲(hydrogen peroxide urea)及100 μL Tween-20製備顯色溶液B。混合溶液且計量至1 L之體積。臨用前以1：100之比率混合顯色溶液A與B。
7.製備樣品稀釋緩衝液
製備90%總體積之無菌去離子水，依序添加4 g Na2HPO4．12H2O、50 g NaCl、60 g NaH2PO4及6 g慶大黴素(gentamicin)且在18-25℃下攪拌，得到均質溶液。量測溶液之pH值且用0.1 M HCl或0.1 M NaOH調節至7.1至7.3。用無菌去離子水使體積經計量至30 L且經由0.22 μm濾膜過濾。
8.製備洗滌緩衝液
製備80%總體積之無菌去離子水，依序添加300 g Na2HPO4．12H2O、100 g NaCl、60 g NaH2PO4及15 ml Tween-20且有力攪拌以使得完全溶解。用無菌去離子水使體積經計量至30 L且經由0.22 μm濾膜過濾。
9.製備終止緩衝液
藉由用去離子水將硫酸稀釋至2 M來製備終止緩衝液。
10.製備套組
根據下表將合格個別組分組裝成套組。
11.套組之用途
使抗原塗佈微盤分別與經稀釋之測試血清、感染陽性血清、免疫陽性血清及標準陰性血清接觸，該等血清各自用樣品稀釋緩衝液稀釋。在37℃下培育微盤1小時，隨後用洗滌緩衝液洗滌。添加經酶標記之結合抗體且在37℃下培育1小時。洗滌微盤，隨後添加顯色溶液A及B，繼而在37℃下反應10-20分鐘(避光)。添加終止緩衝液以終止反應。在微盤讀取器上量測OD450 nm。
S/P比0.785之樣品判定為陽性，且S/P比0.72之樣品判定為陰性。S/P比在此之間的樣品為懷疑樣品且再次進行測試。若再次測試之S/P比仍在懷疑範圍內，則該樣品應判定為陽性。
根據實例2中所述之方法製備ELISA套組。根據習知方
法藉由用PRRSV TJM株接種PRRS陰性豬來製備免疫血清。藉由用PRRSV TJ株攻擊PRRS陰性豬來製備陽性血清，且在第20天收集血液以進行血清製備。由PRRS陰性豬之血清製備陰性血清。研究所用之PRRSV陰性豬為4至6週齡之健康小豬。實例中使用商業化套組IDEXX PRRS抗體測試套組(購自Beijing IDEXX Yuanheng Biotech.Co.,Ltd.)以提供比較。
將12隻4至6週齡PRRSV陰性小豬隨機分成4組。第一組(病毒攻擊組)經由於頸部肌肉中肌肉內注射而接受PRRSV TJ株(F3，第三代)，且用1 ml病毒以105.0TCID50/ml之劑量接種各豬。每兩天自前腔靜脈收集血液以進行血清分離。用Marc-145細胞之無病毒細胞培養基注射第二組(對照組)，且用1 ml培養基接種各豬。每兩天自前腔靜脈收集血液以進行血清分離。使用所製備之ELISA套組或使用IDEXX PRRS抗體偵測套組根據實例1及實例2中所述之程序測試兩組之血清樣品。結果展示於圖6中。
用PRRSV TJM株對第三組(疫苗/攻擊組)首次免疫，隨後在免疫後第28天用PRRSV TJ株攻擊。每7天自前腔靜脈收集血液以進行血清分離。用PRRSV TJM株使第四組(疫苗組)免疫。每7天自前腔靜脈收集血液以進行血清分離。使用本文所製備之ELISA套組以及使用IDEXX PRRS抗體偵測套組根據實例2中所述之程序測試自疫苗組、疫苗/攻擊組及對照組收集的血清樣品。結果展示於圖7中。
如圖6及圖7所示，本文所製備之ELISA套組偵測針對樣
品中之PRRSV TJ株的抗體，且不與接種PRRSV TJM株疫苗之豬的樣品展示任何交叉反應。因此，ELISA套組可區分感染減毒PRRSV株之豬與感染野生型PRRSV株之豬。該套組使用抗原肽替代病毒，從而將具有良好生物安全性，這是因為其不會造成任何病毒傳播之威脅。
根據實例2中所述之方法製備ELISA套組。實例中使用商用套組IDEXX PRRS抗體測試套組(購自Beijing IDEXX Yuanheng Biotech.Co.,Ltd.)以提供比較。研究所用之PRRSV陰性豬為4至6週齡之健康小豬。
5隻PRRS陰性豬各自用105.0TCID50/ml之劑量的PRRSV TJ株經由於頸部肌肉中肌肉內注射來接種。每隔一天自前腔靜脈收集血液直至第28天。收集血清樣品以進行間接ELISA分析，間接ELISA分析根據實例2中所述之程序執行。
藉由本文所提供之ELISA套組或藉由商用IDEXX套組分析血清樣品。結果展示於下表3中。
如表3所示，第10天及第14天分別有一隻豬死亡。IDEXX套組偵測病毒攻擊後第8天之PRRSV抗體，且多肽ELISA套組偵測病毒感染後第10天之所有測試豬中的抗體。自兩個套組獲得之結果一致且相當。此證明多肽ELISA套組高度靈敏，且可提供PRRSV感染之早期診斷。
結果表明本文所提供之ELISA套組可鑑別由感染PRRSV毒性株之豬產生的抗體。套組中所用之塗佈抗原為B細胞抗原決定基多肽，其比可能造成病毒逸出及傳播之威脅的全病毒安全得多。因此，本文所提供之ELISA套組可廣泛用於臨床實踐。
將根據實例2製備之ELISA套組用於研究中。由感染經典型豬瘟病毒(CSFV)、假性狂犬病病毒(PRV)或豬流行性感冒病毒(SIV)之豬製備血清樣品。1：200稀釋血清樣品且使用ELISA套組根據實例1及實例2中所提供之程序及最佳條件來測試。
結果展示CSFV陽性血清樣品、PRV陽性血清樣品及SIV陽性血清樣品均展示小於0.72之S/P比，表明其對於PRRSV呈陰性。該研究展示本文所提供之ELISA套組對PRRSV偵測有高度特異性且不與其他豬病毒抗原交叉反應。
製備不同批次之ELISA套組且使用不同PRRS陽性血清樣品測試，以便測試測試結果之再現性。
根據實例2製備四批ELISA套組。由感染PRRSV之豬製備5個血清樣品。亦使用標準PRRSV陽性血清。
使用一批中製備之三個ELISA套組根據實例2中所提供之程序及條件測試5個血清樣品。各樣品重複測試兩次且結果展示於表4中。
根據結果，使用ELISA套組，各樣品展示可再現測試結果，且S/P值之常數方差為1.79-7.21%(小於10%)，表明具有高再現性。
使用四個不同批次之抗原製備ELISA套組，且用具有不同抗體含量之四個陽性血清樣品以及一個陰性血清樣品進一步測試。重複兩次測試各樣品。OD值結果展示於表5中。
根據結果，對於含有不同批次抗原之ELISA套組，各血清樣品展示可再現測試結果，且S/P值之常數方差為2.11-11.32%(小於15%)，表明不同批次之ELISA套組具有高再現性。
本文中所揭示之ELISA套組具有多個優點。舉例而言，該ELISA套組對於偵測及診斷PRRSV高毒性株具有極高特異性，豬中感染該PRRSV高毒性株會產生特異性結合於存在於毒性株(例如PRRSV TJ株)中但不存在於減毒株(例如PRRSV TJM株)中之抗原性片段的抗體。若樣品使用ELISA套組測試為陽性，則樣品可鑑別為來自感染PRRSV高毒性株之宿主。ELISA套組為可區別接種減毒株疫苗之豬與感染毒性株之豬的重要工具，因此有利於提供根除PRRS之快速且有效之診斷方法。
開發一種PCR方法來偵測PRRSV及區別野生型PRRSV與減毒PRRSV。
將以下引子用於研究中：Nsp2-F：5'-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3'；及Nsp2-L：5'-CGCCGAGAAGACCCAGA-3'。設計引子對以由PRRSV基因組之第2756個至第3975個核苷酸開始擴增片段。
將經典PRRSV VR2332株、高病原性PRRSV TJ株及PRRSV TJM株作為樣品進行測試。將各病毒株溶解於DEPC預處理小瓶中之250 μl無菌去離子水中。使用250 μl無菌去離子水作為陰性對照。
由曲佐試劑(Trizol Reagent)自各樣品提取RNA。簡言之，將750 μl曲佐試劑溶解緩衝液添加至各樣品中，且充分混合，隨後在15-30℃下培育5分鐘。隨後添加200 μl氯仿，繼而劇烈震盪且在15-30℃下培育2-3分鐘，隨後在2-8℃下在12000 rpm下離心15分鐘。將混合物中之水相轉移至新的DEPC預處理小瓶中，且添加500 μl異丙醇，繼而在15-30℃下培育10分鐘且在2-8℃下在12000 rpm下離心10分鐘。去除上清液，向沈澱物中添加900 μl 75% DEPC乙醇，隨後在2-8℃下在12000 rpm下離心10分鐘。乾燥沈澱物且溶解於20 μl DEPC水中，獲得各病毒樣品之經提取RNA溶液。
使用以下反應條件逆轉錄RNA樣品。
充分混合反應混合物，置於室溫下10分鐘，且在42℃水浴中培育1小時，隨後於冰浴中進一步培育2-3分鐘。
根據以下條件使用逆轉錄樣品作為PCR反應之cDNA模板。
使反應混合物根據以下擴增程序在PCR循環器中反應。
使用瓊脂糖電泳分析PCR產物。結果展示於圖8中。根據圖8，經典PRRSV VR2332株之PCR擴增產物在1220 bp處展示特異性條帶，且PRRSV TJ株之PCR擴增產物展示1130 bp條帶，而PRRSV TJM株之PCR擴增產物展示770 bp條帶。未發現陰性對照之擴增產物。PCR正確區分三種不同PRRSV株，這是因為PRRSV TJ株相對於PRRSV VR2332株缺乏90個核苷酸，且PRRSV TJM株相對於PRRSV VR2332株缺乏450個核苷酸。
圖1(a)為展示在與PRRSV標準株VR-2332比較時，豬繁殖及呼吸道綜合症病毒疫苗株TJM(PRRSV TJM)及高病原性PRRSV TJ株之Nsp2序列中之基因缺失的示意圖。
圖1(b)展示寡核苷酸引子於PRRSV之Nsp2編碼序列上雜
交之區域。
圖2展示在PRRSV TJ株及TJM株之Nsp2編碼序列中缺失但存在於PRRSV VR-2332株之Nsp2編碼序列中的90個不連續核苷酸。
圖3展示PRRSV TJM株之Nsp2編碼序列中缺失的360個核苷酸序列。
圖4展示PRRSV TJM株之Nsp2蛋白序列中缺失的120個胺基酸序列。
圖5展示在不存在於PRRSV TJM株之Nsp2蛋白中的120個胺基酸序列中鑑別的合成B細胞抗原決定基。
圖6展示在由PRRSV TJ毒性株病毒攻擊後之豬中測定的抗體偵測結果。
圖7展示在用PRRSV TJM疫苗免疫且視情況由PRRSV TJ株攻擊後之豬中測定的抗體偵測結果。
圖8展示使用寡核苷酸作為引子且使用源自各別樣品之cDNA作為模板之PCR結果的電泳影像。泳道1為陰性對照組，泳道2為源自經典PRRSV株之PCR產物，泳道3為DL2000 DNA標記，泳道4為源自PRRSV TJ株之PCR產物，且泳道5為源自PRRSV TJM株之PCR產物。
<110> 大陸商華威特(北京)生物科技有限公司
<120> 用於偵測豬繁殖及呼吸道綜合症病毒(PRRSV)之試劑及方法
<130> 038229-8001W001
<140> 101118904
<141> 2012-05-25
<150> CN 201110143363.7
<151> 2011-05-27
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
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<213> 豬繁殖及呼吸道綜合症病毒
<400> 23
Claims (56)
- 一種經分離多肽，其包含與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段，其中該免疫原性片段包含至少6個連續胺基酸。
- 如請求項1之多肽，其中該免疫原性片段包含至少9個連續胺基酸。
- 如請求項1之多肽，其中該多肽適用於產生特異性結合於該免疫原性片段之抗體。
- 如請求項1之多肽，其中該多肽適用於偵測樣品中特異性結合於該免疫原性片段之抗體的存在。
- 如請求項1之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：1之一或多個免疫原性片段。
- 如請求項5之多肽，其中該免疫原性片段係選自由以下組成之群：SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)、GHLQKEKEA(SEQ ID NO：3)及PRTPAPSVSAESDLT(SEQ ID NO：4)。
- 如請求項6之多肽，其中該免疫原性片段為SVKITRPKYSAQAI(SEQ ID NO：2)。
- 如請求項1之多肽，其中該多肽結合於載體分子。
- 如請求項8之多肽，其中該載體分子為載體蛋白。
- 如請求項8之多肽，其中該載體分子為聚合物。
- 一種偵測試劑，其包含如請求項1至10中任一項之經分離多肽。
- 一種偵測裝置，其包含如請求項11之偵測試劑，其中該偵測試劑連接於固體支撐物。
- 一種偵測自懷疑感染PRRSV之豬獲得之樣品中之抗體的方法，其包含使該樣品與如請求項1至10中任一項之多肽接觸及偵測該多肽與該樣品中之抗體的特異性結合。
- 一種區分由減毒PRRSV免疫之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法，其包含：使該豬之樣品與如請求項1至10中任一項之多肽接觸，及偵測該樣品中特異性結合於該多肽之抗體的存在，其中該樣品中存在該抗體表明該樣品來自感染該野生型PRRSV之豬。
- 如請求項14之方法，其中該減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%同源性之聚核苷酸分子，其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1至少80%同源之多肽的聚核苷酸片段。
- 如請求項15之方法，其中該野生型PRRSV包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。
- 如請求項14之方法，其中該樣品中不存在該抗體表明該樣品來自未受感染之豬或用減毒PRRSV免疫之豬。
- 如請求項14之方法，其中該減毒PRRSV為減毒活PRRSV疫苗。
- 如請求項18之方法，其中該減毒PRRSV為寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV。
- 一種經分離抗體，其能夠特異性結合於如請求項1至10 中任一項之多肽的免疫原性片段。
- 如請求項20之抗體，其進一步包含標記物。
- 如請求項21之抗體，其中該標記物為螢光標記物、發光標記物、放射性標記物、酶標記物或染色物質。
- 一種偵測試劑，其包含如請求項20至22中任一項之抗體。
- 一種偵測裝置，其包含如請求項23之偵測試劑，其中該偵測試劑連接於固體支撐物。
- 一種偵測樣品中PRRSV之存在的方法，其中該PRRSV含有編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子，該方法包含使該樣品與如請求項20至22中任一項之抗體接觸及偵測該樣品中特異性結合於該抗體之抗原的存在。
- 一種區分感染減毒PRRSV之豬與感染野生型PRRSV之豬的方法，其包含：使該豬之樣品與如請求項20至22中任一項之抗體接觸，及偵測該樣品中特異性結合於該抗體之抗原的存在，其中該樣品中存在該抗原表明該樣品來自感染該野生型PRRSV之豬。
- 如請求項26之方法，其中該減毒PRRSV包含與SEQ ID NO：5具有至少80%同源性之聚核苷酸分子，且其中該聚核苷酸分子缺乏編碼與SEQ ID NO：1具有至少80%同源性之多肽的聚核苷酸片段。
- 如請求項26之方法，其中該野生型PRRSV包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少95%同源性之多肽片段的一或多個免疫原性片段的聚核苷酸分子。
- 如請求項26之方法，其中該樣品中不存在該抗原表明該樣品來自未受感染之豬或感染減毒PRRSV之豬。
- 如請求項26之方法，其中該減毒PRRSV為減毒活PRRSV疫苗。
- 如請求項30之方法，其中該減毒PRRSV為寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV。
- 一種包含如請求項1至10中任一項之經分離多肽的套組，其中該多肽連接於固體支撐物。
- 如請求項32之套組，其進一步包含偵測抗體。
- 如請求項33之套組，其中該偵測抗體結合於標記物。
- 如請求項33之套組，其中該偵測抗體為抗豬抗體。
- 一種經分離寡核苷酸引子對，其包含5'引子及3'引子，其中該5'引子與同選自由SEQ ID NO：8-10及與SEQ ID NO：8-10中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；其中該3'引子與選自由SEQ ID NO：13-19及與SEQ ID NO：13-19中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中該5'引子及該3'引子之長度均為10個核苷酸至38個核苷酸；且其中該5'引子及該3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核 苷酸序列，且該擴增序列之長度超過或等於該5'引子與該3'引子之組合長度。
- 一種偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用如請求項36之寡核苷酸引子對擴增測試樣品及對照樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測該兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定該測試樣品與該對照樣品之該等擴增產物之間的差異，其中該差異表明該樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。
- 如請求項37之方法，其中若該擴增產物不存在於該測試樣品中但存在於該對照樣品中，則表明該測試樣品不含PRRSV或含有減毒PRRSV。
- 如請求項37之方法，其中測定該差異包含比較該測試樣品之該擴增產物與該對照樣品之該擴增產物的分子量，其中藉由使用該相同引子對，該對照樣品之該擴增產物的分子量與經典型PRRSV之擴增產物的分子量相當。
- 如請求項39之方法，其中若該測試樣品中偵測之該擴增產物比該對照樣品之該擴增產物短約90個核苷酸，則表明該測試樣品含有高病原性PRRSV。
- 如請求項39之方法，其中若該測試樣品中偵測之該擴增產物比該對照樣品之該擴增產物短約360或450個核苷酸，則表明該測試樣品含有減毒PRRSV。
- 如請求項39之方法，其中若該測試樣品中偵測之該擴增產物的分子量類似於該對照樣品之分子量，則表明該測 試樣品含有經典型PRRSV。
- 一種經分離寡核苷酸引子對，其包含5'引子及3'引子，其中該5'引子與同選自由SEQ ID NO：11及與SEQ ID NO：11具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；其中該3'引子與選自由SEQ ID NO：13-19及與SEQ ID NO：13-19中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中該5'引子或該3'引子之長度均為10個核苷酸至38個核苷酸；且其中該5'引子及該3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且該擴增序列之長度超過或等於該5'引子與該3'引子之組合長度。
- 一種偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用如請求項43之寡核苷酸引子對擴增測試樣品及對照樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測該兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定該測試樣品與該對照樣品之該等擴增產物之間的差異，其中該差異表明該樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。
- 一種經分離寡核苷酸引子對，其包含5'引子及3'引子，其中該5'引子與同選自由SEQ ID NO：11-13及與SEQ ID NO：11-13中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補； 其中該3'引子與選自由SEQ ID NO：14-16及與SEQ ID NO：14-16中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中該5'引子或該3'引子之長度均為10個核苷酸至38個核苷酸；且其中該5'引子及該3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且該擴增序列之長度超過或等於該5'引子與該3'引子之組合長度。
- 一種偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用如請求項45之寡核苷酸引子對擴增測試樣品及對照樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測該兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定該測試樣品與該對照樣品之該等擴增產物之間的差異，其中該差異表明該樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。
- 一種經分離寡核苷酸引子對，其包含5'引子及3'引子，其中該5'引子與同選自由SEQ ID NO：12及與SEQ ID NO：12具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；其中該3'引子與選自由SEQ ID NO：17-19及與SEQ ID NO：17-19中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中該5'引子或該3'引子之長度均為10個核苷酸至38個核苷酸；且 其中該5'引子及該3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且該擴增序列之長度超過或等於該5'引子與該3'引子之組合長度。
- 一種偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用如請求項47之寡核苷酸引子對擴增測試樣品及對照樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測該兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定該測試樣品與該對照樣品之該等擴增產物之間的差異，其中該差異表明該樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。
- 一種經分離寡核苷酸引子對，其包含5'引子及3'引子，其中該5'引子與同選自由SEQ ID NO：8-10及與SEQ ID NO：8-10中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；其中該3'引子與選自由SEQ ID NO：13及與SEQ ID NO：13中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中該5'引子或該3'引子之長度均為10個核苷酸至38個核苷酸；且其中該5'引子及該3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且該擴增序列之長度超過或等於該5'引子與該3'引子之組合長度。
- 一種偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用如請求項49之寡核苷酸引子對擴增測試樣品及對 照樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測該兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定該測試樣品與該對照樣品之該等擴增產物之間的差異，其中該差異表明該樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。
- 一種經分離寡核苷酸引子對，其包含5'引子及3'引子，其中該5'引子與同選自由SEQ ID NO：13及與SEQ ID NO：13具有至少80%同源性之序列組成之群的序列反義的序列互補；其中該3'引子與選自由SEQ ID NO：13及與SEQ ID NO：13中之任一者具有至少80%同源性之序列組成之群的序列互補；其中該5'引子或該3'引子之長度均為10個核苷酸至38個核苷酸；且其中該5'引子及該3'引子能夠擴增經典型PRRSV之核苷酸序列，且該擴增序列之長度超過或等於該5'引子與該3'引子之組合長度。
- 一種偵測生物樣品中之PRRSV的方法，其包含：使用如請求項51之寡核苷酸引子對擴增測試樣品及對照樣品中RNA之逆轉錄產物及偵測該兩個樣品中擴增產物之存在及/或分子量；及測定該測試樣品與該對照樣品之該等擴增產物之間的差異，其中該差異表明該樣品中PRRSV之存在或不存在或類型。
- 如請求項36之寡核苷酸引子，其中與SEQ ID NO：8互補之該5'引子為5'-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3'。
- 如請求項36之寡核苷酸引子，其中與SEQ ID NO：15互補之該3'引子為5'-CGCCGAGAAGACCCAGA-3'。
- 如請求項36之寡核苷酸引子，其中該5'引子為5'-ATGTCCCTAACAGTTGGAA-3'，且該3'引子為5'-CGCCGAGAAGACCCAGA-3'。
- 一種經分離DNA片段，其包含藉由使用含有PRRSV之樣品在如請求項36、43、45、47及51中任一項之5'引子及3'引子存在下進行聚合酶鏈反應而獲得的擴增產物。
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