CN100439494C - 猪繁殖与呼吸综合征疫苗、制备方法及应用 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征疫苗、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种采用猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp2 1594-1680变异株)研制成灭活疫苗，用于预防超强变异毒株(Nsp2 1594～1680变异株)引起的PRRS，还进一步涉及该疫苗的制备及检验方法和应用。

Description

猪繁殖与呼吸综合征疫苗、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及动物疫病预防控制，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株灭活疫苗。
背景技术
2006年6月份以来，我国多个省份的养猪场、农户爆发猪“高热病”疫情，据不完全统计，在6～9月份，我国共有发病猪约200万头，死亡40余万头，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。申请人研究发现，猪“高热病”疫情的原发病因是猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594～1680变异株)，并分离鉴定了该病毒(分类命名：繁殖与呼吸综合征病毒；拉丁文学名：Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期：2007年3月9日；保藏编号：CGMCC No.1964)。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。目前我国大面积流行猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594-1680变异株)，变异毒株对猪的致病力有显著提高，给养猪业造成了重大损失。
现有PRRSV疫苗均用非变异毒株制备，各种活疫苗和国家批准的灭活疫苗对变异株无保护作用。现阶段正在报批的灭活疫苗在一定程度上是可以抵抗蓝耳病病毒变异株的攻击(均用非超强变异毒株制备，不同厂家的保护效果存在差异)。从理论角度分析，需要研制专门针对超强猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594-1680变异株)的疫苗。
现有PRRSV疫苗效力检验技术存在缺陷：由于所用的毒株(VR2332标准毒株)对猪的致病力不够强，不能引起猪显著发病和死亡，因此，用该标准毒株进行免疫攻毒保护试验，来评价PRRSV疫苗效力，其结果不易判定。
发明内容
本发明采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)超强变异株(Nsp21594-1680变异株)研制成灭活疫苗，用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594-1680变异株)引起的PRRS，初步试验具有良好免疫保护作用。
本申请涉及一种毒株：猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(NSP21594～1680变异株)，保藏信息如下：
分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒
拉丁文学名：Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2007年3月9日
保藏编号：CGMCC No.1964
理化特性该病毒直径40～80nm、为有囊膜的球形或椭圆形病毒粒子。不能凝集恒河猴、猪、犬、家兔、豚鼠、SD大鼠、Balb/c小鼠、鸡、人O型的红细胞。
培养特性病毒可在Marc-145细胞中培养增殖，并产生CPE(细胞聚集、隆起、细胞轮廓模糊、变圆、皱缩、核固缩，呈灶状脱落)，在PK-15、ST、BHK21、VERO、MDCK等其他5种细胞上均不产生CPE。
分离鉴定：
该病毒分离自江西省病死猪脑组织。将病死猪脑组织样品接种在PK-15细胞单层上，37℃温箱静置培养、观察7天，待出现细胞病变时收获培养物，-70℃保存。
负染电镜观察可见直径约50nm、具有囊膜的球形病毒粒子；超薄切片电镜观察结果可见细胞浆内聚集有大量典型的球形、椭圆星病毒粒子，直径40～80nm不等。
经RT-PCR鉴定和单克隆抗体中和试验，鉴定为美洲型PRRSV。全基因测序结果表明，除去Poly A尾，病毒全基因长度为15320bp，与美洲型PRRSV HB-1(sh)毒株的同源性最高，为96.5％。该病毒毒株与美洲型PRRSV标准株(VR-2332株)比较，其NSP2基因缺失第1441～1443位核苷酸和第1594-1680位核苷酸。
致病性病毒接种5头21日龄仔猪，10天内5头全部发病死亡，其临床症状和大体剖检变化与临床发病猪基本相似，用RT-PCR和病毒分离试验可以检测和回收到病毒。接种2月龄猪29头，发病率100％，病死率57％。因此，该病毒与此前常见的PRRSV强毒相比，致病力显著提高，可称为PRRSV超强变异株。
本申请提供一种预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1，保藏号：保藏编号为CGMCC No.1964。
其中病毒含量105.0TCID50/ml以上。病毒是灭活的。进一步的，该疫苗是以液体的形式。该疫苗进一步包括药物上常用的辅料，进一步的该疫苗外观是乳白色乳剂。
另外，本申请还涉及上述疫苗在制备给猪免疫以抵御超强猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594-1680变异株)的药物中的应用。
本申请还提供一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594-1680变异株)灭活疫苗的方法包括：
(1)毒种繁殖：
制苗用毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1，(保藏编号为CGMCC No.1964)。病毒含量1050TCID50/ml以上。
Marc-145细胞株，由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存。取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，将生长良好的MARC-145细胞用消化液消化，接种于细胞瓶内，按1％接种量接种病毒，37℃培养，每日观察细胞病变(CPE)，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约4天)，冻融2次，分装、取样鉴定。
(2)细胞种子繁殖
从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO2培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3传代增殖培养。
(3)制备病毒液
细胞单层培养：将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时。
接种：取所需数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养。
收获：在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，直至CPE达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融2次，经3000g离心20分钟，作为病毒液备用。
灭活：将病毒液按0.1％(V/V)比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育至8小时取出，置室温16小时后转入4℃保存备用，保存期为7天。
(4)灭活效果检查
Marc-145细胞在24孔板上培养至单层，将甲醛灭活处理的抗原液按0.2ml/孔接种于Marc-145细胞单层上，每个样品接种3孔，孵育2小时后弃去样品液，用维持液洗涤后继续维持培养，同时设空白孔做对照。48小时后观察细胞病变。盲传2代，同样观察。
(5)疫苗的制备
①普通矿物油佐剂疫苗
油相制备：将兽用注射白油加热后，加入2％硬脂酸铝，搅拌至溶解，再加入6％(V/V)的司本-80，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，备用。
水相制备：将灭菌的吐温-80按4％(V/V)加入到制苗用的灭活抗原中，搅拌至完全溶解后作为水相。
乳化：将水相按水相∶油佐剂的比例为2∶3(V/V)缓慢加入到油佐剂中，再以10000r/min搅拌4～8分钟，制成灭活油佐剂疫苗。
②206油佐剂疫苗
在低速搅拌的情况下，将灭活病毒抗原液与206佐剂按46∶54缓慢混合，加速至1000r/min搅拌10分钟。
本发明还提供一种由上述方法制备的疫苗。
本申请还提供一种PPRSV疫苗的检验方法，包括：
(1)安全性检验
用3-4周龄健康易感(中和抗体效价≤1∶4)仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4ml，连续观察21日，应无不良反应。
(2)效力检验
按下述方法进行疫苗免疫接种；以血清抗体检测和攻毒保护试验作为免疫效力检验方法，可任择其一。
疫苗免疫接种将疫苗分别按2ml/头的剂量接种4-6周龄仔猪10只，同时设非免疫对照组10只。
血清抗体检测在免疫前和免疫后28天采集猪血清，检测对PRRSV变异株中和抗体效价；对照猪的中和抗体效价均应＜1∶4；免疫猪应至少有8头血清中和抗体效价≥1∶16；
攻毒保护试验免疫后28天，用PRRSV变异毒株(含量为105.5TCID50/ml的病毒液)，1∶10稀释后每头猪经肌肉接种3ml，继续饲养观察21天，扑杀剖检。对照组应有8头以上的猪发病；免疫组猪应有8头以上的猪不发病。
同时符合下列指标判定为发病猪：
①具有下列症状之一：临床出现体温升高，增重趋缓，皮肤出血点、斑、发绀，眼结膜炎，俯跪卧姿、后躯晃动、瘫痪等神经症状；
②大体剖检见下列变化之一：肺从心叶近心端开始的灶性出血、淤血、实变，脾梗死，淋巴结、肾出血点灶，脑膜充血；
③组织病理学见下列病变之一：见肺间质性肺炎、非化脓性脑炎、淋巴系统退行性变；
④病死猪和扑杀猪用RT-PCR方法检测PRRSV超强变异毒株为阳性。
具体实施方式
实施例1
一种制备PRRS病毒变异毒株灭活疫苗的方法，包括：
(1)毒种繁殖：
制苗用毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1，(保藏编号为CGMCC No.1964)。
细胞：Marc-145细胞株，由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存，传代批次为第11代、15代、20代。
取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，将生长良好的MARC-145细胞用消化液消化，接种于细胞瓶内，同时按1％接种量接种病毒，37℃培养，每日观察细胞病变(CPE)，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约4天)，冻融2次，分装、取样鉴定。
(2)细胞种子繁殖
从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO2培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3传代增殖培养。
(3)制备病毒液
细胞单层培养：将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时。
接种：取所需数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养。
收获：在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，直至CPE达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融2次，经3000g离心20分钟，作为病毒液备用。
灭活：将病毒液按0.1％(V/V)比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育至8小时取出，置室温16小时后转入4℃保存备用，保存期为7天。
(4)灭活效果检查
Marc-145细胞在24孔板上培养至单层，将甲醛灭活处理的5批抗原液按0.2ml/孔接种于Marc-145细胞单层上，每个样品接种3孔，孵育2小时后弃去样品液，用维持液洗涤后继续维持培养，同时设空白孔做对照。48小时后观察细胞病变。盲传2代，同样观察。
(5)疫苗的制备
①普通矿物油佐剂疫苗
油相制备：将兽用注射白油加热后，加入2％硬脂酸铝，搅拌至溶解，再加入6％(V/V)的司本-80，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，备用。
水相制备：将灭菌的吐温-80按4％(V/V)加入到制苗用的灭活抗原中，搅拌至完全溶解后作为水相。
乳化：将水相按水相∶油佐剂的比例为2∶3(V/V)缓慢加入到油佐剂中，再以10000r/min搅拌4～8分钟，制成灭活油佐剂疫苗。
②206油佐剂疫苗
在低速搅拌的情况下，将灭活病毒抗原液与206佐剂按46∶54缓慢混合，加速至1000r/min搅拌10分钟。
实施例2
疫苗的安全性试验
(1)疫苗与试验动物
三批PRRSV变异株灭活疫苗，批号为2007001、2007002、2007003。健康猪由内蒙生药厂提供，经检测PRRSV抗体为阴性。
(2)疫苗对最小日龄使用动物一次单剂量接种
每批疫苗分别免疫3周龄健康猪各5头，每头颈部肌肉注射疫苗2ml；注射后继续饲养观察21天，观察免疫后动物的反应，并对部分猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。
(3)疫苗对靶动物单剂量重复接种
每批疫苗分别免疫3-4周龄健康猪各5头，每头颈部肌肉注射疫苗2ml，在第一次免疫后3周，进行二免，每头再次颈部肌肉疫苗2ml，注射后继续饲养观察3周，观察注射后动物的反应，每组对部分猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。
(4)疫苗对靶动物一次超剂量接种
每批疫苗分别免疫3-4周龄健康猪各5头，每头颈部肌肉注射疫苗4ml；注射后继续饲养观察21天，观察免疫后动物的反应，并对部分猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。
(5)试验结果
以上各试验组的猪及对照组的猪均未出现局部和全身不良反应，注苗后动物的精神状态及食欲良好。对部分猪进行解剖表明，疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状、疫苗完全吸收。因此三批疫苗在单剂量、超剂量、多次接种情况下对猪安全。
表1安全性试验结果
Figure C20071008654900111
实施例3
疫苗效力试验
(1)疫苗与试验动物
三批PRRSV变异株灭活疫苗，批号为2007001、2007002、2007003。健康猪由内蒙生药厂提供，经检测PRRSV抗体为阴性。
(2)疫苗免疫接种
将三批疫苗分别按2ml/头的剂量接种40±5日龄仔猪10只。同时设非免疫对照组10只猪。
(3)血清抗体检测
在免疫后28天采集猪血清，用细胞中和试验检测PRRSV抗体效价。
(4)攻毒试验
免疫后28天，用PRRSV超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1攻击。将病毒含量为105.9TCID50/ml的病毒培养液稀释至1∶10，按3ml/头的剂量经颈部肌肉接种。继续饲养观察21天，记录各组动物的反应，包括体温、临床症状、定期血清检测、剖检大体病理变化。对病死猪和21天时扑杀的试验猪，用RT-PCR方法检测PRRSV变异毒株。
(5)血清抗体检测结果
三批疫苗免疫后28天，即攻毒之前，各免疫组对PRRSV超强变异株的中和抗体效价均达到16以上；对照组血清抗体均为阴性。详见下表。
表2血清抗体检测结果
  试验组   疫苗批次   中和抗体效价
  免疫组1   2007001   16，32，32，32，64，128，64，64，32，64
  免疫组2   2007002   64，64，32，32，128，64，128，64，128，16
  免疫组3   2007003   128，16，64，64，64，64，32，128，32，64
  对照组   ＜4，＜4，＜4，＜4，＜4，＜4，＜4，＜4，＜4，＜4
(6)攻毒试验结果
1)对照组猪：
攻毒后10头猪全部发病，死亡4头。
病猪表现为：①临床出现体温升高，皮肤出血点、斑、发绀，眼结膜炎，俯跪卧姿、后躯晃动、瘫痪等神经症状；②大体剖检见肺从心叶近心端开始的灶性出血、淤血、实变，脾梗死，淋巴结、肾出血点灶，脑膜充血等；③组织病理学见肺间质性肺炎、非化脓性脑炎、淋巴系统退行性变。
对病死猪和观察21天后扑杀的对照组试验猪，用RT-PCR方法检测PRRSV变异毒株，均为阳性。详见下表。
表3攻毒试验结果
  动物编   发病时间(DPI)   死亡时间(DPI)   症状   大体病变   组织学  RT-PCR
  Cont.1   3   未死，扑杀   体温升高，皮肤发绀、神经症状   肺实变，淋巴结、肾出血点，脑膜充血等   间质性肺炎、淋巴系统退行性变   +
  Cont.2   3   7   体温升高，皮肤出血点发绀，眼结膜炎，神经症状   肺出血、淤血、实变，肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、非化脓性脑炎   +
  Cont.3   3   8   体温升高，皮肤出血点、神经症状   肺出血、淤血、实变肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、非化脓性脑炎   +
  Cont.4   4   未死，扑杀   体温升高，皮肤出血点发绀，眼结膜炎，神经症状   肺淤血、实变，淋巴结、肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、非化脓性脑炎、淋巴系统退行性变   +
  Cont.5   3   未死，扑杀   体温升高，皮肤出血点、神经症状   肺出血、淤血、实变肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、非化脓性脑炎、淋巴系统退行性变   +
  Cont.6   3   9   体温升高，皮肤出血点、神经症状   肺出血、淤血、实变肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、非化脓性脑炎   +
  Cont.7   3   未死，扑杀   体温升高，皮肤出血点、神经症状   肺出血、淤血、实变肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、非化脓性脑炎、淋巴系统退行性变   +
  Cont.8   4   8   体温升高，皮   肺出血、淤血、实   间质性肺炎、非   +
  肤出血点、神经症状   变，肾出血点灶，脑膜充血等   化脓性脑炎
  Cont.9   4   未死，扑杀   体温升高，皮肤出血点、神经症状   肺淤血、实变肾出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、淋巴系统退行性变  +
  Cont.10   3   未死，扑杀   体温升高，皮肤出血点、神经症状   肺淤血、淋巴结实变，肾、淋巴结出血点灶，脑膜充血等   间质性肺炎、淋巴系统退行性变  +
2)疫苗免疫组
三批PRRSV变异株灭活疫苗免疫的试验组，所有猪均未出现不良反应或发病。观察21天后扑杀的免疫组试验猪用RT-PCR方法检测PRRSV超强变异毒株，均为阴性。此结果说明，PRRSV超强变异株灭活疫苗免疫猪，可对PRRSV超强变异毒株产生良好的免疫力。
表4疫苗免疫结果
  试验组   疫苗批次   动物数量(头)   不良反应   发病数   死亡数   RT-PCR检测   保护动物数(头)
  1   2007001   10   无   0   0   均为阴性   10
  2   2007002   10   无   0   0   均为阴性   10
  3   2007003   10   无   0   0   均为阴性   10
实施例4
检测方法试验
(1)疫苗与试验动物
PRRSV变异株灭活疫苗，批号为2007000。
3-4周龄健康易感(中和抗体效价≤1∶4)仔猪5头，4-6周龄健康易感(中和抗体效价≤1∶4)仔猪20头，由内蒙生药厂提供，经检测PRRSV抗体为阴性。
(2)安全性检验
用每头颈部肌肉注射疫苗4ml，连续观察21日，记录不良反应和剖检变化。
(3)效力检验
①疫苗免疫接种将疫苗分别按2ml/头的剂量接种4-6周龄仔猪10只，同时设非免疫对照组10只。
②血清抗体检测在免疫前和免疫后28天采集猪血清，检测对PRRSV变异株中和抗体效价。
③攻毒保护试验免疫后28天，用PRRSV变异毒株(含量为105.5TCID50/ml的病毒液)，1∶10稀释后每头猪经肌肉接种3ml，继续饲养观察21天，扑杀剖检。
(3)安全性检验结果
接种疫苗后21天，5头试验3-4周龄猪均无不良反应，剖检未见病理性变化，见表5。
表5安全性检验结果
  动物编号   动物周龄   不良反应   剖检变化
  S1   3周   无不良反应   未见病变，疫苗吸收完全
  S2   4周   无不良反应   未见病变，疫苗吸收完全
  S3   3.5周   无不良反应   未见病变，疫苗吸收完全
  S4   3周   无不良反应   未见病变，疫苗吸收完全
  S5   4周   无不良反应   未见病变，疫苗吸收完全
(4)效力检验结果
疫苗接种组10只猪在第28天检测，中和抗体效价均达到16以上，攻毒后观察21天未见发病死亡，RT-PCR检测PRRSV超强变异株均为阴性。
攻毒对照组的10只猪在接种病毒后3～5天全部发病，共病死5头，经RT-PCR检测PRRSV超强变异株均为阳性，详见表6。
(5)确定猪发病的标准
同时符合下列指标判定为发病猪：
①具有下列症状之一：临床出现体温升高，增重趋缓，皮肤出血点、斑、发绀，眼结膜炎，俯跪卧姿、后躯晃动、瘫痪等神经症状；
②大体剖检见下列变化之一：肺从心叶近心端开始的灶性出血、淤血、实变，脾梗死，淋巴结、肾出血点灶，脑膜充血；
③组织病理学见下列病变之一：见肺间质性肺炎、非化脓性脑炎、淋巴系统退行性变；
④病死猪和扑杀猪用RT-PCR方法检测PRRSV超强变异毒株为阳性。
表6效力检结果
Figure C20071008654900161

Claims (8)

1、一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)超强变异株(supper-virulent variant)，其特征在于病毒Nsp2基因缺失第1594-1680位核苷酸；病毒保藏号为：CGMCC No.1964。
2、一种利用权利要求1所述的病毒超强变异株制备的预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗。
3、根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于疫苗中含有Nsp2基因缺失第1594-1680位核苷酸的PRRSV。
4、根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于病毒含量105.0TCID50/ml以上。
5、根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于病毒是灭活的。
6、根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于疫苗是以液体的形式。
7、权利要求2-6任一项所述的疫苗在制备给猪免疫以抵御猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的药物中的应用。
8、根据权利要求2-6任一项所述的疫苗的制备方法，包括：
(1)毒种繁殖：
取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，将生长良好的MARC-145细胞用消化液消化，接种于细胞瓶内，同时按1％接种量接种如权利要求1所述的病毒超强变异株，37℃培养，每日观察细胞病变，当70％以上细胞出现CPE时收毒，冻融2次，分装、取样鉴定；
(2)细胞种子繁殖
从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min；用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO2培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3传代增殖培养；
(3)制备病毒液
细胞单层培养：将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时；
接种：取所需数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％V/V接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养；
收获：在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变，直至其达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融2次，经3000g离心20分钟，作为病毒液备用；
灭活：将病毒液按0.1％V/V比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育至8小时取出，置室温16小时后转入4℃保存备用，保存期为7天；
(4)灭活效果检查
Marc-145细胞在24孔板上培养至单层，将甲醛灭活处理的抗原液按0.2ml/孔接种于Marc-145细胞单层上，每个样品接种3孔，孵育2小时后弃去样品液，用维持液洗涤后继续维持培养，同时设空白孔做对照；48小时后观察细胞病变；盲传2代，同样观察；
(5)疫苗的制备
①普通矿物油佐剂疫苗
油相制备：将兽用注射白油加热后，加入2％硬脂酸铝，搅拌至溶解，再加入6％V/V的司本-80，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，备用；
水相制备：将灭菌的吐温-80按4％V/V加入到制苗用的灭活抗原中，搅拌至完全溶解后作为水相；
乳化：将水相按水相：油佐剂的比例为2∶3V/V缓慢加入到油佐剂中，再以10000r/min搅拌4～8分钟，制成灭活油佐剂疫苗；
②206油佐剂疫苗
在低速搅拌的情况下，将灭活病毒抗原液与206佐剂按46∶54缓慢混合，加速至1000r/min搅拌10分钟。
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