CN106540249A - 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明对禽流感(H5N1)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)等抗原开展高效低成本规模化浓缩纯化工艺技术研究，通过对浓缩纯化技术的比较研究，筛选出不同抗原的最佳浓缩纯化方法和路线，进行抗原浓缩纯化工艺的重复性研究及批样品质量稳定性研究，确定病毒原液浓缩倍数，杂蛋白含量测定指标和抗原纯化回收率指标，建立规模化浓缩纯化工艺和适合规模化抗原浓缩纯化的生产线，研制安全高效的疫苗产品，具有工艺简单、成本低、适于大规模生产等优点。此外，本发明建立起一整套动物疫苗多种病毒抗原液的浓缩与纯化工艺，为我国兽用生物制品生产提供了一套关键的实用新技术，将极大地推动我国兽用生物制品的研制与开发。

Description

一种禽流感(H5N1)或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方 法

技术领域

本技术涉及禽流感(H5N1)或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒疫苗的抗原浓缩纯化，属于农业生物技术领域，具体为抗原浓缩纯化领域。

背景技术

自从疫苗之父巴斯德成功研制了减毒炭疽、霍乱及狂犬病疫苗以来，疫苗制备技术得到长足发展，疫苗形式也从灭活疫苗、减毒活疫苗发展到基因工程疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗。就畜禽用疫苗而言，现在全世界仍以常规疫苗为主，我国也是如此。由于重组疫苗研制周期长，免疫效力差，成本高，在今后相当长一段时间内常规疫苗仍然会在市场上占主导地位。鉴于常规动物疫苗存在浓度低、含有大量的宿主蛋白等缺陷，开展抗原浓缩纯化核心共性技术研究将是今后动物疫苗技术开发的重要任务。当前人用疫苗生产多采用离心、过滤和沉淀技术进行初步分离，层析技术进行精制纯化的工艺。虽然能够得到纯度高的疫苗，但是成本高并不适合于动物疫苗的纯化精制。近年发展起来的交叉流过滤技术具有能耗低、产品回收率高和适合规模化生产等优点，将其结合传统的离心、过滤和沉淀等技术，开发出适于动物疫苗分离纯化的生产工艺将是动物疫苗生产工艺改进的趋势。

我国是畜牧业大国，养殖经济动物的数量庞大，2010年，全国畜牧业产值占农业总产值的比重大约为38％。肉类、蛋类和奶类产量分别达到8600万吨、3000万吨和4200万吨，年均分别递增约2％、1％和8％。稳定增长的畜牧业将推动兽用生物制品市场的逐步扩大。随着近年来畜牧业的快速发展，养殖业在农业总产值中比例不断提高，国家越来越意识到建设动物防疫体系的重要性，对于兽药行业的支持力度也进一步加大，这些都为兽药行业的发展提供了良好的政策环境。目前国内的兽药市场以兽用药物制剂为主，生物制品占比小，发展空间大。据估计，2000年中国动物疫苗市场约为10亿元，2004年超过15亿元，2006年超过20亿元。根据中国动物保健品协会的统计，2009年国内兽用生物制品的总消费额为47.56亿元，占兽药市场容量的21.94％。此外，我国畜牧业正向规模化饲养发展。畜牧业规模化养殖，特广东省产学研项目申报书别是高密度养殖，提高了禽畜的疫病传染几率。一旦出现某一只动物感染疫病，其他动物都必须扑杀或者接种疫苗。因此，养殖的规模化程度提高，进一步带来对疫苗产品的需求。从目前情况看，规模养殖的企业均具有较强的免疫意识，不仅能主动达到国家要求的免疫密度，而且由于疫苗在养殖成本中所占比例很小(不到0.2％)，养殖企业还主动采购高效苗、多价苗等价高质优的疫苗。

目前常规动物疫苗生产工艺生产的疫苗存在抗原浓度低、含有大量宿主蛋白质等缺点，而人用疫苗抗原纯化工艺成本高，不适合动物疫苗生产。本项目将常规离心、过滤技术应用于病毒液的初步分离，再利用切向超滤技术、层析技术进行抗原纯化精制，具有工艺简单、成本低、适于大规模生产等优点。此外，本项目开发的抗原浓缩纯化共性技术具有技术平台作用，通过本项目地实施，建立起一整套动物疫苗多种病毒抗原液的浓缩与纯化工艺，为我国兽用生物制品生产提供了一套关键的实用新技术，将极大地推动我国兽用生物制品的研制与开发。

发明内容

本发明旨在克服疫苗抗原浓度低、含有大量宿主蛋白质、抗原纯化工艺成本高等缺点，将离心、过滤技术应用于病毒液的初步分离，再利用切向超滤技术、层析技术进行抗原纯化精制，具有工艺简单、成本低、适于大规模生产等优点。

本发明具有以下有益效果：杂蛋白去除率≥70％，纯化回收率≥70％，疫苗抗原的比活性得到大幅提升。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种禽流感(H5N1)或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法，包括以下步骤：

步骤一：病毒培养和收获

(1)毒种繁殖：

取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，按1％接种量接种禽流感病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株，37℃培养，每日观察细胞病变，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约4天)，冻融2次，分装、取样鉴定；

(2)细胞种子繁殖：

从液氮罐中取出细胞管，置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10mL无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO₂培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3传代增殖培养；

(3)制备病毒液：

将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时；将细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养，直至CPE达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融2次，经3000g离心20分钟，作为病毒液备用；或者取无免疫母源抗体的9日龄鸡胚，经尿囊腔途径接种H5N1禽流感病毒，接种后，置于37℃孵化36-72h，收取尿囊液；

步骤二：病毒的灭活：

将病毒液按0.1％(V/V)比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育8h取出，置室温16h后转入4℃保存备用，保存期为7天；或者用1/4000β-丙内酯4℃灭活12-36h，然后37℃水解；

步骤三：病毒液初步分离：

含有灭活的病毒细胞培养液或鸡胚尿囊液，经0.65μm滤膜过滤，除去细胞碎片及微粒体，澄清液体；

步骤四：滤膜过滤灭活病毒液：

以0.45μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备过滤病毒液，以去除细胞碎片和沉淀；

步骤五：病毒液超滤浓缩：

分别使用中空纤维750k和500k超滤柱、300k和500k超滤膜包进行病毒液的浓缩洗滤；使用中空纤维和膜包进行浓缩，均采用先浓缩后洗滤的策略，先浓缩20倍即开始滤洗5倍，然后继续浓缩至50倍左右；最后以处理速度、病毒收率、总蛋白和浓缩液澄清度等作为指标，比较不同孔径的中空纤维膜和超滤膜包的浓缩性能，选出浓缩性能最好的中空纤维膜和超滤膜包；

步骤六：将精制纯化病毒液按照固定工艺制成疫苗产品；

步骤七：进行病毒毒力滴定、效力测定、蛋白含量测定，其中蛋白含量测定采用Lowry法；采用SDS-PAGE法，使用5％浓缩胶，12％分离胶，对分离纯化的病毒抗原进行纯度检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例一：一种猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法，包括以下步骤：

步骤一：病毒培养和收获

(1)毒种繁殖：

取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，按1％接种量接种猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株，37℃培养，每日观察细胞病变，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约4天)，冻融2次，分装、取样鉴定；

(2)细胞种子繁殖：

从液氮罐中取出细胞管，置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO₂培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3传代增殖培养；

(3)制备病毒液：

将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时；将细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按l％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养，直至CPE达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融2次，经3000g离心20分钟，作为病毒液备用；

步骤二：病毒的灭活：

将病毒液按0.1％(V/V)比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育8h取出，置室温16h后转入4℃保存备用，保存期为7天；或者用1/4000β-丙内酯4℃灭活12-36h，然后37℃水解；

步骤三：病毒液初步分离：

含有灭活的病毒细胞培养液，经0.65μm滤膜过滤，除去细胞碎片及微粒体，澄清液体；

步骤四：滤膜过滤灭活病毒液：

以0.45μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备过滤病毒液，以去除细胞碎片和沉淀；

步骤五：病毒液超滤浓缩：

分别使用中空纤维750k和500k超滤柱、300k和500k超滤膜包进行病毒液的浓缩洗滤；使用中空纤维和膜包进行浓缩，均采用先浓缩后洗滤的策略，先浓缩20倍即开始滤洗5倍，然后继续浓缩至50倍左右；最后以处理速度、病毒收率、总蛋白和浓缩液澄清度等作为指标，比较不同孔径的中空纤维膜和超滤膜包的浓缩性能，选出浓缩性能最好的中空纤维膜和超滤膜包；

步骤六：将精制纯化病毒液按照固定工艺制成疫苗产品；

步骤七：进行病毒毒力滴定、效力测定、蛋白含量测定，其中蛋白含量测定采用Lowry法；采用SDS-PAGE法，使用5％浓缩胶，12％分离胶，对分离纯化的病毒抗原进行纯度检测。

实施例二：一种禽流感(H5N1)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法，包括以下步骤：

步骤一：病毒培养和收获

取无免疫母源抗体的9日龄鸡胚，经尿囊腔途径接种H5N1禽流感病毒，接种后，置于37℃孵化36-72h，收取尿囊液；

步骤二：病毒的灭活：

将病毒液按0.1％(V/V)比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育8h取出，置室温16h后转入4℃保存备用，保存期为7天；或者用1/4000β-丙内酯4℃灭活12-36h，然后37℃水解；

步骤三：病毒液初步分离：

含有灭活的病毒鸡胚尿囊液，经0.65μm滤膜过滤，除去细胞碎片及微粒体，澄清液体；

步骤四：滤膜过滤灭活病毒液：

以0.45μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备过滤病毒液，以去除细胞碎片和沉淀；

步骤五：病毒液超滤浓缩：

分别使用中空纤维750k和500k超滤柱、300k和500k超滤膜包进行病毒液的浓缩洗滤；使用中空纤维和膜包进行浓缩，均采用先浓缩后洗滤的策略，先浓缩20倍即开始滤洗5倍，然后继续浓缩至50倍左右；最后以处理速度、病毒收率、总蛋白和浓缩液澄清度等作为指标，比较不同孔径的中空纤维膜和超滤膜包的浓缩性能，选出浓缩性能最好的中空纤维膜和超滤膜包；

步骤六：将精制纯化病毒液按照固定工艺制成疫苗产品；

步骤七：进行病毒毒力滴定、效力测定、蛋白含量测定，其中蛋白含量测定采用Lowry法；采用SDS-PAGE法，使用5％浓缩胶，12％分离胶，对分离纯化的病毒抗原进行纯度检测。

Claims (1)

1.一种禽流感(H5N1)或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法，包括以下步骤：

步骤一：病毒培养和收获

(1)毒种繁殖：

取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，按1％接种量接种猪禽流感病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株，37℃培养，每日观察细胞病变，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约4天)，冻融2次，分装、取样鉴定；

(2)细胞种子繁殖：

从液氮罐中取出细胞管，置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10mL无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO₂培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3传代增殖培养；

(3)制备病毒液：

将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时；将细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养，直至CPE达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融2次，经3000g离心20分钟，作为病毒液备用；或者取无免疫母源抗体的9日龄鸡胚，经尿囊腔途径接种H5N1禽流感病毒，接种后，置于37℃孵化36-72h，收取尿囊液；

步骤二：病毒的灭活：

将病毒液按0.1％(V/V)比例加入甲醛，混匀，置37℃振荡培养箱中孵育8h取出，置室温16h后转入4℃保存备用，保存期为7天；或者用1/4000β-丙内酯4℃灭活12-36h，然后37℃水解；

步骤三：病毒液初步分离：

含有灭活的病毒细胞培养液或鸡胚尿囊液，经0.65μm滤膜过滤，除去细胞碎片及微粒体，澄清液体；

步骤四：滤膜过滤灭活病毒液：

以0.45μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备过滤病毒液，以去除细胞碎片和沉淀；

步骤五：病毒液超滤浓缩：

分别使用中空纤维750k和500k超滤柱、300k和500k超滤膜包进行病毒液的浓缩洗滤；使用中空纤维和膜包进行浓缩，均采用先浓缩后洗滤的策略，先浓缩20倍即开始滤洗5倍，然后继续浓缩至50倍左右；最后以处理速度、病毒收率、总蛋白和浓缩液澄清度等作为指标，比较不同孔径的中空纤维膜和超滤膜包的浓缩性能，选出浓缩性能最好的中空纤维膜和超滤膜包；

步骤六：将精制纯化病毒液按照固定工艺制成疫苗产品；

步骤七：进行病毒毒力滴定、效力测定、蛋白含量测定，其中蛋白含量测定采用Lowry法；采用SDS-PAGE法，使用5％浓缩胶，12％分离胶，对分离纯化的病毒抗原进行纯度检测。