CN107129530A - 一种法氏囊素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种法氏囊素的提取方法，将鸡法氏囊前处理后与注射用水混合均匀，然后捣碎、匀浆；接着对匀浆后的法氏囊进行两次提取得到提取液，然后加入β‑丙内酯进行灭活；灭活后的提取液水解得到水解液；所述水解液用0.22‑0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1‑5 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；然后调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液，并用0.1‑0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。本发明提取方法简便，提高了法氏囊的利用率，降低了生产成本，缩短了生产时间，提取的法氏囊素可以作为免疫增强剂，饲料添加剂，辅助治疗剂等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种法氏囊素的提取方法。
背景技术
法氏囊 (Bursa of fabricus，BF) 是禽类独有的中枢体液免疫器官，相当于哺乳动物的骨髓。BF中存在许多生物活性物质，尤其是一些具有免疫调节作用的小肽，能促进禽类及哺乳动物淋巴细胞的分化发育及免疫器官的成熟，一般将这一类小分子生物活性肽称为法氏囊素(bursin , BS)。近年来人们对BS的生物学功能及其作用机制进行了广泛的研究。现已证实，BS大多具有免疫调节功能，如囊素三肽，氨基酸组成顺序是Lys-His-Gly-NH2，其中 Lys：His：Gly：NH2为1：0.9：1：0.8，可诱导哺乳动物和禽类B细胞的分化，还能提高人的Daudi B细胞中cAM P、cGM P的浓度，并认为该物质在禽类和哺乳动物均有相似的生物活性。
法氏囊素作为一种最初从禽类法氏囊中提取出的物质并没有种属的限制性，在多种动物及疾病的研究中不仅证明了它具有提高机体增重和饲料转化率等效果，还能增强机体的免疫调节水平，具有良好的免疫学活性。因此，将BS作为免疫增强剂用作各种动物疫苗佐剂、饲料添加剂或辅助治疗剂等将会大大提高疫苗效果，增强动物的免疫力，保证动物的健康生长，促进养殖业的发展，提高经济效益。
在以往的研究过程中，有的人直接采用法氏囊粗提物作为研究法氏囊活性肽的材料，由于这种粗提物中含有大量非特异的大分子蛋白质等组织成分，给动物机体注射可能会引起不良反应，甚至发生过敏而死亡，干扰或掩盖了BS的作用，得不到一个可靠的实验结果。因此要想进一步研究BS的生物学活性及其应用，首先要改进生产工艺，建立一套正确的制备方法，既保证其生物学活性又有一定的浓度和纯度。
目前已报道有3种制备法氏囊素的方法：①物理提纯法，利用超滤技术从法氏囊中直接提取，回收1 000 D以下的超滤液；②化学合成法，根据法氏囊素的已知化学结构用固相和液相法人工合成；③经基因工程技术构建并克隆出部分BS主要活性多肽基因，经过整合载体转化到受体细胞进行表达。然而不管是化学合成或是克隆的BS肽类药物开发应用有一定的限制性。首先构象不稳定，天然线型肽在体外具有很好的生物活性和稳定性，但是线型肽的分子柔曲造成的构象易变使其与受体结合的强度及选择性受到影响；其次，生物利用度低，较差的膜通透性、易被酶类降解、易清除、在某些情况下难溶解及易聚集的这些特性，致使多肽难以在消化和循环系统中以稳定的药理活性形式存在；化学合成法纯度高，但成本也高，同时也容易造成环境污染；通过基因工程技术表达单一的BS基因无法获得量及种类的需求，并且细菌或其他宿主产生的内毒素难以清除及纯化出目的蛋白，过多的串联重复又难以获得其双链 DNA，且表达产物的免疫学活性还需进一步证实。组织提取法（物理提纯法）属于纯天然提取，安全、无毒、无危害，采用超滤技术截留回收具有生物学活性的法氏囊小分子量组分，用于动物机体不仅不会使其产生过敏反应，还能提高动物机体的免疫功能。
因此，为更好地服务于畜牧业，造福于人类， 对BS的制备方法进行优化，最大限度的对其开发利用，是今后人们深入研究的方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高法氏囊的利用率，缩短生产时间，降低生产成本的法氏囊素的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种法氏囊素的提取方法，其包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗数次，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3混合均匀，然后用捣碎机捣碎，得到捣碎液；
2）将上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融4-6次，然后将冻融结束的匀浆液离心，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存，往沉淀中加入pH值为2.5-3.5等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融2-4次，然后进行离心，得到二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.01-0.02%β-丙内酯，于2-8℃条件下搅拌16-32h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于35-39℃条件水解2-3h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1-5 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
8）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
8）将上述等渗溶液用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
所述步骤1），法氏囊捣碎过程，依次按照转速16000-17000r/min、18000-19000 r/min、21000-22000r/min进行捣碎。
所述步骤3），离心条件为2~8℃条件下，6000-8000 rpm 离心20-30 min。
所述步骤7），等渗溶液的pH值为6.0-7.5。
本发明采用以上技术方案，提取方法更为简便，提高了法氏囊的利用率，降低了生产成本，具有以下有益效果：
本发明所述步骤1），按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3（优选为1∶2）混合进行匀浆，使匀浆环境处于低渗状态，细胞更容易破裂，能够更彻底地释放法氏囊素，同时使更多法氏囊素释放到溶液中，增加了法氏囊的利用率。
本发明所述步骤2），将捣碎后的法氏囊胶体磨匀浆，不仅进一步除去法氏囊中的筋膜和脂肪，而且有利于组织块的破碎和分散，从而减少了反复冻融的次数，避免了反复冻融对多肽的影响，也节约了生产时间。
本发明所述步骤3）进行二次提取，即在一次提取后产生的沉淀中加入等体积，pH值为2.5-3.5的注射用水，增加了多肽的溶解性，提高法氏囊素的提取率和利用率。
本发明所述步骤4）中运用β-丙内酯对提取液进行病毒灭活，保证提取液安全无毒。
本发明所述步骤6）中运用超滤系统进行1-5 KD超滤，不仅能够去除大量非特异的大分子蛋白，而且可以截留更多有活性的小分子多肽。
本发明提取的法氏囊素可以作为免疫增强剂，与动物疫苗同时使用，能够提高疫苗效果, 增强动物的免疫力；作为饲料添加剂，可以提高饲料转化率，促进动物体重的增加从而缩短出栏时间；作为辅助治疗剂，能够预防病毒感染，对免疫抑制剂具有颉颃作用。
具体实施方式
一种法氏囊素的提取方法，包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16000-17000r/min、18000-19000r/min、21000 -22000r/min进行捣碎，得到捣碎液；
2）将上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融4-6次，然后将冻融结束的匀浆液于2~8℃条件下，6000-8000rpm 离心20-30 min，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存；
往沉淀中加入pH值为2.5-3.5等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融2-4次，然后冻融液于2~8℃条件下，6000-8000 rpm 离心20-30 min，得到二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.01-0.02 %β-丙内酯，于2-8℃条件下搅拌16-32h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于35-39℃条件水解2-3h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1-5 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液，得到的等渗溶液的pH值为6.0-7.5；
8）将上述等渗溶液用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
实施例1
一种法氏囊素的提取方法，包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗数次，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶2混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速168008r/min、188008 r/min、21500r/min进行捣碎，得到捣碎液；
2）上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融4次，然后将冻融结束的匀浆液于2℃条件下，7000 rpm 离心25 min，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存；
往沉淀中加入pH值为3.0等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融2次，然后冻融液于2℃条件下，7000 rpm 离心25 min，得到二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.015%β-丙内酯，于6℃条件下搅拌24h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于37℃条件水解2.5h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用5 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液，得到的等渗溶液的pH值为6.5；
8）将上述等渗溶液用0.1μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
实施例2
一种法氏囊素的提取方法，包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗数次，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速17000r/min、19000 r/min、22000r/min进行捣碎，得到捣碎液；
2）上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融6次，然后将冻融结束的匀浆液于4℃， 8000 rpm 离心20min，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存；
往沉淀中加入pH值为3.5等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融3次，然后冻融液于4℃条件下，，8000 rpm 离心20 min，得到二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.02 %β-丙内酯，于8℃条件下搅拌24h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于39℃条件水解2h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液，得到的等渗溶液的pH值为7.0；
8）将上述等渗溶液用0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
实施例3
一种法氏囊素的提取方法，包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗数次，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16000r/min、18000 r/min、21000 r/min进行捣碎，得到捣碎液；
2）上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融6次，然后将冻融结束的匀浆液于6℃ 条件下，6000 rpm 离心30 min，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存；
往沉淀中加入pH值为2.5等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融4次，然后冻融液于6℃条件下，，6000rpm 离心30 min，得到二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.01 %β-丙内酯，于2℃条件下搅拌30h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于35℃条件水解3h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤液并采用3 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液，得到的等渗溶液的pH值为6.0；
8）将上述等渗溶液用0.1μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
实施例4
一种法氏囊素的提取方法，包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗数次，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16500r/min、18500 r/min、21000 r/min进行捣碎，得到捣碎液；
2）上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融4次，然后将冻融结束的匀浆液于4℃ 条件下，7500 rpm 离心20 min，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存；
往沉淀中加入pH值为3.0等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融4次，然后冻融液于8℃条件下，，7500 rpm 离心200 min，取二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.01%β-丙内酯，于5℃条件下搅拌24h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于37℃条件水解2h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤液并采用5 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液，得到的等渗溶液的pH值为6.5；
8）将上述等渗溶液用0.1μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
Claims (4)
1.一种法氏囊素的提取方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗数次，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3混合均匀，然后用捣碎机捣碎，得到捣碎液；
2）将上述捣碎液经胶体磨匀浆，得到匀浆液；
3）将上述匀浆液反复冻融4-6次，然后将冻融结束的匀浆液离心，得到一次上清液和沉淀，将一次上清液于-20℃环境保存，往沉淀中加入pH值为2.5-3.5等体积的注射用水，经胶体磨匀浆，得到二次匀浆液，将二次匀浆液反复冻融2-4次，然后进行离心，得到二次上清液；
4）将一次上清液和二次上清液混合均匀得到提取液，往提取液中加入终浓度为0.01-0.02%β-丙内酯，于2-8℃条件下搅拌16-32h进行灭活；
5）将上述灭活后的提取液于35-39℃条件水解2-3h，得到水解液；
6）将上述水解液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1-5 kD滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
8）将上述等渗溶液用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
2.根据权利要求1所述的一种法氏囊素的提取方法，其特征在于：所述步骤1），法氏囊捣碎过程，依次按照转速16000-17000r/min、18000-19000 r/min、21000-22000r/min进行捣碎。
3.根据权利要求1所述的一种法氏囊素的提取方法，其特征在于：所述步骤3），离心条件为2~8℃条件下，6000-8000 rpm 离心20-30 min。
4.根据权利要求1所述的一种法氏囊素的提取方法，其特征在于：所述步骤7），等渗溶液的pH值为6.0-7.5。
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Application publication date: 20170905 |