CN109260468A - 一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法和应用 - Google Patents

一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明将猪脾脏、鸡法氏囊和水混合后匀浆，得到的匀浆液反复冻融5～7次后与乙酸混合后依次进行搅拌、离心、灭活和水解，将得到的灭活水解液超滤、除菌，得到无菌液浓缩至无菌调节液体积的19～21％，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。本发明提供的制备方法制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中核糖多肽含量高，且本发明制备的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液配合猪瘟活疫苗使用可以大大提高猪只的抗体水平。

Description

一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法和应用。
背景技术
转移因子是由动物蛋白细胞中具有免疫获悉的T淋巴细胞所释放的一类小分子可透析物质，可溶于水，能诱导机体免疫细胞活化，增强机体免疫力，能转移包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫。由于转移因子使用安全、作用迅速、无抗原性同时作为免疫激发剂和辅助制剂可显著提高对动物疾病的预防和控制效果。
法氏囊(Bursa offabricius，BF)是禽类特有的体液免疫的中枢淋巴器，是B淋巴细胞增殖分化的场所，在免疫系统中发挥重要作用。从法氏囊中新分离的数十种生物活性肽，表现出不同的生物学功能，奠定了法氏囊在免疫系统中的地位。将法氏囊素作为免疫增效剂用作动物疫苗佐剂可以大大提高疫苗效果，增强动物的免疫力。但市面上的转移因子制剂和法氏囊素制剂有效成分浓度都相对较低，使用后达不到理想的效果。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法，使制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液核糖和多肽含量高，能够有效提高抗体水平。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法和应用，包括如下步骤：
1)将猪脾脏、鸡法氏囊和水混合后匀浆，得到匀浆液；
2)将所述步骤1)的匀浆液反复冻融5～7次，得到冻融液；
3)将所述步骤2)的冻融液离心，将得到的上清液采用β-丙内酯灭活，得到灭活液；
4)将所述步骤3)的灭活液在35～42℃条件下进行水解1～3h后离心，得到水解上清液；
5)将所述步骤4)的水解上清液进行超滤、除菌，将得到的无菌液浓缩，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液；所述浓缩后的混合液的体积为无菌液体积的19％～21％。
优选的，所述步骤1)中猪脾脏的质量、鸡法氏囊的质量与水的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(1～4)。
优选的，所述步骤1)中匀浆的转速为15000～18000r/min，匀浆的时间为9～11min。
优选的，所述步骤2)中反复冻融时，冷冻的温度独立为-22～-18℃；融解的温度独立为20～30℃。
优选的，按体积百分比计，所述步骤3)灭活液中β-丙内酯的终浓度为0.014～0.016％；所述灭活的温度为5～15℃，所述灭活的时间为20～30h。
优选的，所述步骤5)超滤使用的超滤膜的截留分子量为5～8kD。
优选的，所述步骤5)中除菌的方式为采用除菌过滤器进行过滤除菌，所述除菌过滤器的滤膜孔径为0.1μm。
优选的，所述步骤5)中浓缩的温度为9～11℃。
本发明提供了一种上述方案所述方法制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。
本发明提供了一种上述方法所述猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液在制备疫苗中的应用。
本发明提供了一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液及其制备方法和应用，采用本发明制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中核糖和多肽含量高。本发明实施例结果表明：本发明制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中核糖含量在148.3～174.8μg/mL之间，多肽含量在9.7～10.5mg/mL之间，对照组核糖含量为60.2μg/mL，多肽含量在9.7～10.5mg/mL。本发明的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液相较于对照组，核糖和多肽含量高出2倍多。本发明制备的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液配合猪瘟活疫苗使用可以大大提高猪只的抗体水平。
具体实施方式
本发明提供了一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法，包括如下步骤：
1)将猪脾脏、鸡法氏囊和水混合后匀浆，得到匀浆液；
2)将所述步骤1)的匀浆液反复冻融5～7次，得到冻融液；
3)将所述步骤2)的冻融液离心，将得到的上清液采用β-丙内酯灭活，得到灭活液；
4)将所述步骤3)的灭活液在35～42℃条件下进行水解1～3h后离心，得到水解上清液；
5)将所述步骤4)的水解上清液进行超滤、除菌，将得到的无菌液浓缩，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液；所述浓缩后的混合液的体积为无菌液体积的19％～21％。
本发明将猪脾脏、鸡法氏囊和水混合后匀浆，得到匀浆液。本发明中，所述鸡法氏囊和猪脾脏均来自新鲜的健康动物物体；所述猪脾脏、鸡法氏囊在与水混合前优选的还包括预处理过程；本发明中所述预处理包括洗净、去皮去脂去筋、再次洗净和绞碎。本发明中，所述洗净优选为采用注射用水；本发明对所述去皮去脂去筋的方式没有特殊限定，采用本领域常规去皮去脂去筋的方法即可；所述绞碎优选的采用绞肉机进行。在本发明中，所述猪脾脏的质量、鸡法氏囊的质量与水的体积比优选为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(1～4)，更优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.5～2.5)，最优选为1:1:2。在本发明中，所述水优选为注射用水。本发明中，所述匀浆的转速优选为15000～18000r/min，更优选为16000r/min；所述匀浆的时间优选为9～11min，更优选为10min。在本发明具体实施过程中，所述匀浆通过采用捣碎机进行。
得到匀浆液后，本发明将所述匀浆液反复冻融5～7次，得到冻融液。本发明中，优选反复冻融6次。在本发明中，所述反复冻融时，冷冻的温度独立优选为-22～-18℃，更优选为-20℃；冷冻的时间独立优选为48～60h，更优选为52h；融解的温度独立优选为20～30℃，更优选为25℃。在本发明中，所述反复冻融是为了使细胞破碎。
得到冻融液后，本发明将所述冻融液离心，将得到的上清液采用β-丙内酯灭活，得到灭活液。在本发明中，所述离心后优选将得到的废渣与水混合再次离心，收集两次离心液为上清液。在本发明中，所述废渣的质量与水的体积比优选为1:0.9～1.1，更优选为1:1。在本发明中，离心的转速独立优选为6000～8000r/min，更优选为7000r/min；离心的温度独立优选为0～4℃，更优选为2℃；第一次离心的时间优选为10～20min，更优选为15min；第二次离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。在本发明中，按体积百分比计，所述β-丙内酯的终浓度优选为0.014～0.016％，更优选为0.015％。在本发明中，所述β-丙内酯对离心清液进行灭活。在本发明中，所述灭活的温度优选为5～15℃，更优选为10℃；所述灭活的时间优选为20～30h，更优选为25h。
得到灭活液后，本发明将所述灭活液在35～42℃条件下进行水解1～3h后离心，得到水解上清液。在本发明中，所述水解的温度优选为37℃。所述水解的时间优选为2h。在本发明中，所述β-丙内酯经35～42℃可自动水解为无毒的β羟基丙酸。在本发明中，所述离心的转速优选为7500～9000r/min，更优选为8000r/min；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。
得到水解上清液后，本发明将所述水解上清液进行超滤、除菌，将得到的无菌液浓缩至无菌液体积的19％～21％，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。在本发明中，所述切向流超滤使用的超滤膜的截留分子量优选为5～8kD。更优选为7kD。在本发明中，所述除菌优选使用除菌过滤器进行除菌，所述除菌过滤器的滤膜孔径优选为0.1μm。本发明对所述超滤的条件参数无特殊限定，采用常规超滤的条件参数即可。在本发明中，所述浓缩的方式优选为旋转蒸发浓缩。所述旋转蒸发浓缩的温度优选为9～11℃，更优选为10℃。
本发明提供了一种上述方法制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。本发明中，所述猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中本发明制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中核糖含量在148.3～174.8μg/mL，多肽含量在9.7～10.5mg/mL。
本发明提供了一种上述方案所述的猪皮转移因子与鸡法氏囊素混合液在制备疫苗中的应用。本发明中，所述混合液优选的配合疫苗使用，提供辅助作用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)将猪脾脏与鸡法氏囊清洗干净，去皮去脂去筋，用注射用水洗净备用，所述的猪脾脏和鸡法氏囊都均来自新鲜的健康动动物体；
(2)将处理好的猪脾脏5Kg和鸡法氏囊5Kg放入绞肉机绞碎，然后将得到的绞碎物按体积比1:1加注射用水，置于捣碎机在转速为15000rpm下匀浆11min，得匀浆液；
(3)将匀浆液反复冻融5次(冻融时冷冻的温度为-22℃，时间为48h，融化解冻时用离心管密封后放入水解冻)，得到冻融液；
(4)将冻融液置于4℃，以8000rpm离心10min，取离心清液于无菌罐中，将离心后的废渣按1:1的比例加入注射用水放入捣碎机以8000rpm再次匀浆4min。将两次离心清液混合加入终浓度为0.014％的β-丙内酯，于10℃以内灭活20h，将得到的灭活液置于37℃水解2h，得到水解液，将水解液8500rpm离心10min，得到水解上清液；
(5)将水解上清液经8kD超滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液，再用0.1μm除菌过滤器除菌，收集滤液，将无菌液置于旋转蒸发仪中，将温度控制在11℃进行浓缩，当体积浓缩蒸发至无菌调节液体积的1/5时，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。
实施例2
(1)将猪脾脏与鸡法氏囊清洗干净，去皮去脂去筋，用注射用水洗净备用，所述的猪脾脏和鸡法氏囊都均来自新鲜的健康动动物体；
(2)将处理好的猪脾脏5Kg和鸡法氏囊5Kg放入绞肉机绞碎，然后将得到的绞碎物按体积比1:1加注射用水，置于捣碎机在转速为18000rpm下匀浆9min，得匀浆液；
(3)将匀浆液反复冻融7次(冻融时冷冻的温度为-18℃，时间为60h，融化解冻时用离心管密封后放入水解冻)，得到冻融液；
(4)将冻融液置于4℃，以6000rpm离心20min，取离心清液于无菌罐中，将离心后的废渣按1:1的比例加入注射用水放入捣碎机以6000rpm再次匀浆6min。将两次离心清液混合加入终浓度为0.016％的β-丙内酯，于10℃以内灭活30h，将得到的灭活液置于37℃水解3h，得到水解液，将水解液7500rpm离心20min，得到水解上清液；
(5)将水解上清液经5kD超滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液，再用0.1μm除菌过滤器除菌，收集滤液，将无菌液置于旋转蒸发仪中，将温度控制在11℃进行浓缩，当体积浓缩蒸发至无菌调节液体积的1/5时，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。
实施例3
(1)将猪脾脏与鸡法氏囊清洗干净，去皮去脂去筋，用注射用水洗净备用，所述的猪脾脏和鸡法氏囊都均来自新鲜的健康动动物体；
(2)将处理好的猪脾脏5Kg和鸡法氏囊5Kg放入绞肉机绞碎，然后将得到的绞碎物按体积比1:1加注射用水，置于捣碎机在转速为16000rpm下匀浆10min，得匀浆液；
(3)将匀浆液反复冻融7次(冻融时冷冻的温度为-20℃，时间为52h，融化解冻时用离心管密封后放入水解冻)，得到冻融液；
(4)将冻融液置于4℃，以7000rpm离心15min，取离心清液于无菌罐中，将离心后的废渣按1:1的比例加入注射用水放入捣碎机以7000rpm再次匀浆5min。将两次离心清液混合加入终浓度为0.015％的β-丙内酯，于10℃以内灭活30h，将得到的灭活液置于37℃水解2h，得到水解液，将水解液8000rpm离心15min，得到水解上清液；
(5)将水解上清液经7kD超滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液，再用0.1μm除菌过滤器除菌，收集滤液，将无菌液置于旋转蒸发仪中，将温度控制在10℃进行浓缩，当体积浓缩蒸发至无菌调节液体积的1/5时，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。
实施例4
核糖含量检测
将实施例1～3制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液作为实验组将3个批次(依次编号为：H001-1、H001-2、H001-3、H002-1、H002-2、H002-3、和H003-1、H003-2、H003-3)的半成品(浓缩前的混合液)和成品进行核糖检测，选择由山东信得科技股份有限公司所生产的转移因子产品作为对照组。参照国家食品药品监督管理局发布的《转移因子溶液国家药品标准》中的核糖测定方法进行检测，具体如下：
1溶液配制
1.15％三氯醋酸称取三氯醋酸5.0g，加蒸馏水溶解成100mL。
1.20.1％三氯化铁-盐酸溶液称取三氯化铁0.5g，加浓盐酸溶解成500mL，可长期使用。
1.31％3,5-二羟基甲苯(苔黑酚)称取3,5-二羟基甲苯1.0g，溶于100mL的0.1％三氯化铁-盐酸溶液中。
1.4对照品溶液精密称取D-核糖对照品适量，用5％三氯醋酸制成每毫升含核糖20μg的溶液，摇匀。
1.5待检样品溶液分别取猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液半成品或成品适量适量，用5％三氯醋酸进行适当稀释作为待检样品溶液(待检样品溶液核糖浓度应与对照品溶液基本一致)。
2操作方法
精密量取对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置带塞试管中，各加入5％三氯醋酸溶液至2.0mL，再分别加入1％3,5-二羟基甲苯溶液2.0mL，摇匀，置沸水浴中准确加热30min，迅速冷却至室温，以0号管为空白，按照紫外-可见分光光度法(现行《中国兽药典》附录)在650nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算线性回归方程，相关系数不低于0.995。精密量取待检样品溶液2.0mL，自“再分别加入1％3,5-二羟基甲苯溶液2.0mL”起，同法测定吸光度，根据吸光度从线性回归方程中求得待检样品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求核糖含量。具体检测结果如表1所示。
表1不同猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中核糖含量
由表1可以看出，本发明制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液成品中核糖含量在148.3～174.8μg/mL，半成品和成品的平均核糖含量为68.5μg/mL和172.2μg/mL，而对照组核糖含量为60.2μg/mL，本发明的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液相比市面上转移因子口服液，核糖含量高出2倍多。实验结果表明：本发明确实可以有效提高核糖含量。
实施例5
多肽含量检测
将实施例1～3制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液作为实验组将3个批次(依次编号为：H001-1、H001-2、H001-3、H002-1、H002-2、H002-3、和H003-1、H003-2、H003-3)的半成品和成品进行多肽检测，由于市面上还没猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的售卖，选择由山东信得科技股份有限公司所生产的转移因子产品作为对照组。步骤参照现行《中国药典》通则进行测定，具体如下：
1溶液配制
1.1碱性铜试液取氢氧化钠10.0g，碳酸钠50.0g，加水400mL使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50mL使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30mL使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，并加水至500mL。
1.2福林酚试液取适量福林酚试液贮备液(1mol/L酸浓度)用水进行8倍稀释。
1.3对照品溶液取牛血清白蛋白对照品，加水制成每毫升中含0.2mg牛血清白蛋白的溶液。
1.4待检样品溶液分别取猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液半成品或成品适量，用水进行适当稀释作为待检样品溶液(待检样品溶液蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。
2操作方法
精密量取对照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置具塞试管中，各加水至1.0mL，再分别加入碱性铜试液1.0mL，摇匀，各加入福林酚试液4.0mL，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5min，置冷水浴10min，按照紫外-可见分光光度法(现行《中国药典》通则)，在650nm波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程，相关系数不低于0.995。另精密量取待检样品溶液1.0mL，自“再分别加入碱性铜试液1.0mL”起，同法测定吸光度，根据吸光度从线性回归方程中求得待检样品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求出猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液半成品或成品多肽含量。具体结果如表2所示。
表2不同猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液中多肽含量
批次 半成品多肽含量 成品多肽含量
H001-1 3.21mg/mL 6.3mg/mL
H001-2 3.36mg/mL 6.3mg/mL
H001-3 3.31mg/mL 6.3mg/mL
H002-1 3.52mg/mL 6.91mg/mL
H002-2 3.51mg/mL 6.92mg/mL
H002-3 3.48mg/mL 6.95mg/mL
H003-1 3.49mg/mL 6.83mg/mL
H003-2 3.50mg/mL 6.93mg/mL
H003-3 3.41mg/mL 6.89mg/mL
对照 3.3mg/mL
由表2可以看出，本发明制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液成品中多肽含量在多肽含量在16.3～6.95mg/mL，半成品和成品的平均多肽含量为3.50mg/mL和6.93mg/mL，而对照组多肽含量为3.3mg/mL，本发明的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液相比市面上转移因子口服液，多肽含量高出2倍多。实验结果表明:本发明确实可以有效提高多肽含量。
实施例6
猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液增强猪瘟活疫苗效果的试验
本实验采用猪瘟简介血凝抗体检测方法，检测不同浓度的注射液对猪瘟活疫苗免疫效果的影响。
1动物4-5周龄猪瘟抗体阴性的健康杜大长仔猪，有福州大北农生物科技有限公司提供。
2试剂猪瘟简介血凝抗体检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医科研所。
3制品：采用本发明制备的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液批号为H001-1、H002-1、H003-1。对照组为山东信得科技股份有限公司所生产的转移因子注射液。
试验方法
实验组为采用本发明制备的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液批号为H001-1、H002-1、H003-1分别以2mL稀释1头份猪瘟活疫苗进行联合免疫，对照组为山东东信得科技股份有限公司所生产的转移因子注射液2mL稀释1头份猪瘟活疫苗进行联合免疫，空白组仅注射生理盐水。采用颈部肌肉注射，每个批次分别注射10投注，注射剂量均为2mL/头，各组于免疫后第7d、14d、28d踩血分离血清，检测各组猪的猪瘟简介血凝抗体效价平均值。具体结果如表3所示。
表3猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液增强猪瘟活疫苗效果
由表3可以看出，采用本发明制备的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液配合猪瘟活疫苗使用，比市面上的猪脾转因子注射液效果更显著，实验结果表明：本发明制备的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液配合猪瘟活疫苗使用可以大大提高猪只的抗体水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液的制备方法，包括如下步骤：
1)将猪脾脏、鸡法氏囊和水混合后匀浆，得到匀浆液；
2)将所述步骤1)的匀浆液反复冻融5～7次，得到冻融液；
3)将所述步骤2)的冻融液离心，将得到的上清液采用β-丙内酯灭活，得到灭活液；
4)将所述步骤3)的灭活液在35～42℃条件下进行水解1～3h后离心，得到水解上清液；
5)将所述步骤4)的水解上清液进行超滤、除菌，将得到的无菌液浓缩，得到猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液；所述浓缩后的混合液的体积为无菌液体积的19％～21％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中猪脾脏的质量、鸡法氏囊的质量与水的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(1～4)。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中匀浆的转速为15000～18000r/min，匀浆的时间为9～11min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中反复冻融时，冷冻的温度独立为-22～-18℃；融解的温度独立为20～30℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按体积百分比计，所述步骤3)灭活液中β-丙内酯的终浓度为0.014～0.016％；所述灭活的温度为5～15℃，所述灭活的时间为20～30h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)超滤使用的超滤膜的截留分子量为5～8kD。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中除菌的方式为采用除菌过滤器进行过滤除菌，所述除菌过滤器的滤膜孔径为0.1μm。
8.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中浓缩的温度为9～11℃。
9.权利要求1～9任意一项所述方法制备得到的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液。
10.权利要求9所述的猪脾转移因子与鸡法氏囊素混合液在制备疫苗中的应用。
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