CN101531967B

CN101531967B - 一种生产α干扰素的方法及其专用菌

Info

Publication number: CN101531967B
Application number: CN2009100814954A
Authority: CN
Inventors: 毕清贵; 毕清华
Original assignee: SINO-KINGBIO BIOTECH CO LTD
Current assignee: Zhongkebaike (Tianjin) biopharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: CN101531967A

Abstract

本发明公开了一种生产α干扰素的方法及其专用菌株。该菌株是向宿主菌中导入如下基因得到的：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。该制备α干扰素的方法，包括如下步骤：发酵所述重组菌，得到α干扰素。本发明的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845遗传稳定性好，生产性能稳定，发酵表达的重组α干扰素比活高、得率高、安全性高。用本发明方法制备α干扰素，操作简单、成本低廉、效率高。因此，本发明菌株及制备α干扰素的方法会有广阔的应用前景。

Description

一种生产α干扰素的方法及其专用菌

技术领域

本发明涉及一种生产α干扰素的方法及其专用菌。

背景技术

养猪业是我国农村除种植外的第一大产业，其收入占农民年总收入的三分之一，是农民现金收入的主要来源。在养猪业中，蓝耳病、猪“高热病”、仔猪病毒性腹泻和猪传染性胸膜炎死亡率较高，对养猪业威胁最大，是兽医界难以解决的难题。特别是2006年夏秋之际，我国部分地区发生猪“高热病”疫情，对养猪业造成很大损失。2007年3月，农业部将高致病性猪蓝耳病作为猪病防控重点，防止疫情在猪病高发季节扩散蔓延。然而目前尚未出现有效的免疫治疗试剂。传统疗法是注射“病毒灵”或“病毒唑”，此类化学药物不仅疗效差且易导致畜类食品药残超标。

干扰素是由脊椎动物细胞产生的一类分泌型糖蛋白，具有广谱抗病毒和增强免疫应答的作用，在免疫应答调控中处于中心地位。在医学临床方面，IFN常用于病毒性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病的治疗，并且是惟一个被FDA批准治疗慢性丙型肝炎的药品；在兽医临床应用方面，主要是使用IFN进行预防和治疗病毒和细菌的感染。干扰素在生物体中普遍存在，现已经证明在人及小鼠、羊、兔、犬、鼬等哺乳动物，以及大量野生动物、鱼类、龟类和昆虫等都有干扰素类似物质存在。干扰素是一个大的基因家族，可分为3型，主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备α干扰素的重组菌。

本发明所提供的重组菌，是向宿主菌中导入如下基因得到的：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。

所述基因可以是通过重组载体导入所述宿主菌中的；所述重组载体具体可以是通过向出发载体pBV220的多克隆位点插入所述基因得到的。

所述宿主菌可为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或酵母菌。

所述重组菌具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845。该菌株已于2009年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2845。保藏期限为30年，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli。

本发明的另一个目的是提供一种制备α干扰素的方法。

本发明所提供的制备α干扰素的方法，包括如下步骤：发酵上述任一所述重组菌，得到α干扰素。

其中，所述发酵的条件可包括：温度为25-35℃，溶氧为20-40％(体积百分含量)，以100-300r/min的速度振荡，旋转半径为13mm，pH值为6.5-7.5。

所述温度优选为30℃，所述溶氧优选为30％，所述pH值优选为7.0，所述振荡的速度优选为200r/min。

所述发酵中所用的培养基的组成可为：每升培养基中含有胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L，甘油30g/L，pH7.2，氨苄青霉素100mg/L，溶剂为水。

所述方法中还可包括在所述发酵后进行纯化的步骤；所述纯化的方法为依次进行强阴离子交换层析和阳离子交换层析。

所述方法中，在所述发酵后和所述纯化前，还可包括如下分离的步骤：

1)在所述发酵后，将所述菌破碎，用变性液溶解，得到溶解液；

2)将所述溶解液与0-4℃复性缓冲液混匀，过夜；

所述变性液为含有5-7mol/L盐酸胍、1.5-2.5mmol/L EDTA、40-60mmol/LTris·Cl、9-11mmol/L DTT、pH值为8-9的溶液；

所述复性缓冲液为含有0.4-0.6mol/L L-Arg、1-3mmol/L EDTA、10-30％(体积百分含量)甘油、0.8-1.0mmol/L GSSG，0.05-1.15mol/L Tris·Cl、pH 7-9的溶液。

本发明的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCCNO.2845遗传稳定性好，生产性能稳定；由该菌发酵表达的重组α干扰素抗病毒能力强、抗多种病毒引起的疾病(蓝耳病、猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、细小病毒感染、衣原体感染、水疱病、冠状病毒感染、轮状病毒感染、流感)、比活高、得率高、安全性高，可通过与细胞表面受体结合诱导细胞产生多种抗病毒因子，抑制病毒复制，提高免疫力。用本发明方法制备α干扰素，操作简单、成本低廉、效率高。因此，本发明工程菌及制备α干扰素的方法会有广阔的应用前景。

附图说明

图1为PCR扩增猪α干扰素基因的琼脂糖电泳图。

图2为工程菌质粒酶切结果。

图3为工程菌菌落形态。

图4为光镜下工程菌菌落形态。

图5为工程菌氨苄抗性检验。

图6为工程菌电镜照片。

图7为工程菌乳糖发酵试验。

图8为工程菌乳V-P反应。

图9为工程菌甲基红试验。

图10为工程菌在诱导前后表达的蛋白情况。

图11为工程菌表达产物的稳定性。

图12为猪干扰素重组表达质酶切鉴定琼脂糖电泳图。

图13为纯化后IFN-α原液中目的蛋白的SDS-PAGE。

图14为Westen bloting鉴定蛋白。

图15为Lowry法测定蛋白浓度标准曲线和线性回归方程。

图16为IFN肽图分析结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

PK15细胞株购自上海肯强贸易有限公司，产品目录号为Zs1073；猪α型干扰素多克隆抗体购自上海麦莎生物科技有限案公司，产品目录号为ms37100-1；TritonX-100购自大连宝生物工程有限公司；pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司；原核表达载体pBV220购自大连宝生物工程有限公司；GSSG购自大连宝生物工程有限公司；QIAperp Spin Minipere质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。

培养基所需试剂：Trypton(Oxifod)、Yeast extract(Oxifod)、NaCl(北化)、MgSO₄(北化)、甘油(北化)、氨苄青霉素(华北制药)、氯霉素(思语)、琼脂粉(北京天泰)、盐酸(北化)、NaOH(北化)、磷酸(北化)、硝酸(北化)；

工具酶与试剂：限制性内切酶EcoRI、BamHI、ExTaqPCR试剂盒和T₄DNA连接酶(TaKaRa公司)，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)与5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)(Promega公司)、DNA片段快速回收试剂盒(北京鼎国公司)，辣根过氧化物鼠IgG(北方同正公司)；QIAperp Spin Minipere质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；

检测、定量所需试剂：考马斯亮蓝G-250(思语)、无水乙醇(北化)、磷酸(北化)、1mg/mlBSA(TaKaRa)、包涵体纯化所需试剂：KCL(北化)、NaCl(北化)、Na2HP04(北化)、KH2PO4(北化)、吐温-20(北化)、尿素(北化)、盐酸胍(思语)、EDTA(北化)、Tris(Novon)、1M DTT(Bio sharp)、精氨酸(思语)、甘油(北化)、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸(索莱宝)、甘露醇(思语)、硫柳汞钠(国药)、聚山梨醇酯(海淀会友精细化工厂)；

主要仪器

发酵罐：Biotech电磁搅拌式发酵罐5L(上海保兴生物设备有限公司)，HZQ-QX全温振荡器(哈尔滨东联电子)，SORVALL低温高速离心机(Bio-Rad)，AKTA层析系统(Bio-Rad)，凝胶电泳系统(Bio-Rad)，7200型分光光度计(Unico公司)。

包涵体洗涤液组成：1％(质量百分含量)TritonX-100，50mmol/L Tris·Cl，100mmol/L NaCl，pH 8.0；

变性液：5-7mol/L盐酸胍，1.5-2.5mmol/L EDTA，40-60mmol/L Tris·Cl，9-11mmol/L DTT，pH 8-9；

实施例1、工程菌的构建

一、工程菌的构建

1、猪α干扰素基因的获得

提取猪肝脏的全基因组DNA，以基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：

上游：5’-GCAGAATTCATGTGTGACCTGCCTCAGACCC-3’(序列2)，

下游：5’-CCGGATCCTTA CTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3’(序列3)(引物由北京赛百盛公司合成)；

PCR反应体系：模板1μg，上下游引物各50pmol/L，总体积50μL；反应条件为98℃、8min，94℃、1min，54℃、1min，72℃、1min，30个循环，最后于72℃、10min。

PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图1所示(M为分子量标准；1为PCR样品；2为阴性对照)，表明PCR产物的大小为510bp。

将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选白斑，PCR扩增及测序验证，得到正确的阳性克隆，将阳性重组载体命名为pMD18-T/IFN-α，PCR扩增的干扰素的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2、构建重组表达载体

用限制性内切酶EcoRI/BamHI双酶切上述重组载体pMD18-T/IFN-α，回收目的基因片段；用限制性内切酶EcoRI/BamHI双酶切原核表达载体pBV220，回收目的载体片段；连接，转化大肠杆菌E.Coli.DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达质粒pBV220/SwIFN-α。

3、构建重组工程菌

将上述重组表达载体pBV220/Sw IFN-α转化大肠杆菌E.Coli.DH5α感受态细胞，得到重组菌；将重组菌涂布于含Amp的LB琼脂平板，30℃培养16-18h，长出的单菌落即可初步判断为阳性克隆；对初步筛选得到的阳性克隆进行PCR扩增验证，酶切验证，再进行测序，获得插入正确序列的重组表达载体及阳性克隆。

以EcoR I和BamH I双酶切质粒结果如图2所示(M为分子量标准；1为重组质粒；2为阴性对照)，酶切为3.7kb和0.5kb两个片段，质粒的酶切图谱与原始重组质粒相符。

将其中的一株重组菌命名为DH5α/pBV220/Sw IFN-α，该菌株已于2009年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.2845，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli。

4、重组工程菌的检测

取菌株DH5α/pBV220/Sw IFN-α CGMCC NO.2845，进行如下鉴定，合格后投产：

(1)将菌株DH5α/pBV220/Sw IFN-α CGMCC NO.2845划线接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基中(氨苄青霉素在LB培养基中的浓度为100mg/L)，在30℃恒温箱中温育24h，观察菌落生长情况。结果如图3所示，结果表明，菌落呈典型大肠杆菌菌落形态，无其它杂菌生长，符合要求。

(2)对菌落进行革兰氏染色。结果如图4所示，结果表明，在光学显微镜下，菌落为典型的革兰氏阴性杆菌，符合典型大肠杆菌形态，菌体大小和形状一致，符合要求。

(3)对抗生素的抗性检测。在含有氨苄青霉素的LB培养基中已经生长，表明该菌有氨苄青霉素抗性，符合要求。

备8块固体LB平板，4块含有100μg/ml AMP，4块不含AMP，在平板上接种工程菌DH5α/pBV220/SwIFN-α和不携带质粒的DH5α宿主菌，AMP⁺和AMP^-平板各接种2块，30℃培养过夜。结果如图5所示，接种的8个LB平板中，有6个细菌生长形成集落，2个平板无集落形成，而这两个2个平板均为含有AMP和不含有质粒的DH5α宿主菌的平板。因而证明AMP抗性是由于携带质粒pBV220导致，AMP可作为培养、发酵的选择条件。图5中，A表示工程菌在不含Amp的LB琼脂平板上的生长情况，B表示工程菌在含Amp的LB琼脂平板上的生长情况，C表示宿主菌在不含Amp的LB琼脂平板上的生长情况，D表示宿主菌在含Amp的LB琼脂平板上的生长情况。

(4)电镜检查。结果如图6所示，结果菌落为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其它微生物污染。

(5)生化反应检测。结果符合大肠杆菌生物学性状。

a、乳糖发酵试验：37℃培养工程菌48小时，结果如图7，工程菌发酵乳糖产气(图7B)，即发酵乳糖为(+)；空白对照为不接种任何菌的培养基(图7A1)；阴性对照采用伤寒杆菌(图7A2)，工程菌为图7A3。b、V-P反应：如图8所示结果，工程菌V-P反应呈(-)(图8B)；阳性对照采用产气杆菌(图8A)。c、甲基红试验：如图9所示(A为空白对照，B为产气杆菌，C为宿主菌，D为DH5α/pBV220/SwIFN-αCGMCC NO.2845)，工程菌甲基红反应呈(+)：阳性对照采用产气杆菌。

二、猪α型干扰素的表达及表达产物的鉴定

1、发酵菌：将重组菌DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845接种于含Amp的LB琼脂平板，30℃培养16-18h；挑取单菌落，接种于含Amp的20ml LB液体培养基中，30℃，200rmp振荡(旋转半径13mm)培养过夜。次日，按1％的比例接种菌液于20ml含Amp的LB液体培养基中，30℃，200rmp培养6h，添加IPTG诱导表达4h。

2、凝胶电泳验证：取1ml菌液，10000rmp离心1min，弃上清，加入SDS-PAGE上样缓冲液，振荡混匀，沸水浴5min，高速离心1min。取上清10ul，以15％分离胶SDS-PAGE检测，以宿主茵作为阴性对照，结果如图10(M表示蛋白分子量标准，1表示诱导前全菌蛋白，2表示诱导后全菌蛋白)所示，表明，诱导后菌中蛋白与诱导前的菌中蛋白相比，其在19.2KDa处出现新的条带，与干扰素的分子量相吻合，进一步验证工程菌已经成功构建。经薄层凝胶扫描仪确定目的蛋白占全菌蛋白的70％。

三、工程菌遗传稳定性检测

将100ml含1.5％琼脂的LB培养基灭菌后冷却至60℃，氨苄青霉素在LB培养基中的浓度为100mg/L，均匀倒入10个直径为12cm的平皿中静置冷却，标记为LB(+)；另一组平板的操作方法相同，培养基中不含氨苄青霉素，标记为LB(-)。

将鉴定后的重组工程菌DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC No.2845涂布在LB(-)平板上，于37℃恒温箱中温育24h(称为第1代)。用灭菌牙签挑取100个单菌落，同一菌落分别接种在LB(+)和LB(-)平板上，然后于30℃恒温箱中温育24h(称为第2代)，对两种平板上生长的菌落进行计数，将LB(-)上生长的菌落分别接种于LB(+)和LB(-)平板上，于30℃恒温箱中温育24h(称为第3代)，对两种平板上生长的菌落进行计数。依此进行连续传代50次。以转入空载体pBV220的大肠杆菌为对照。

在传代过程中若出现仅在LB(-)上生长而在LB(+)上不能生长的菌落，对该菌落进行培养，抽提质粒并进行EcoRI和BamHI双酶切电泳鉴定。若无此现象出现，则每隔6天，从当天的平板上任意挑取单菌落接种到LB培养基中，30℃培养至A₆₀₀＝0.6，添加IPTG诱导表达4小时，离心收集湿菌体，利用15％SDS-PAGE检测表达产物，同时进行质粒抽提及双酶切电泳鉴定。从最后一次传代菌落中任意挑取一个，进行目标基因测序。

工程菌连续传代培养后，第1，10，20，30，40和50代在LB(+)和LB(-)培养基上的生长菌落数约100个。

在连续传代过程中，工程菌产生的目的蛋白没有显著差异(图11，M：Marker；1～3：第0，30，50代工程菌；4：转入空载体pBV220的大肠杆菌)。

将重组工程菌DH5α/pBV220/Sw IFN-α CGMCC NO.2845连续传代培养50代，对每代的菌进行质粒抽提，然后用限制性内切酶EcoRI/BamHI进行双酶切，以检测质粒的稳定性。结果如图12所示，在510bp处有特异条带，与预期片段相符(图12，M：DNA marker；1为酶切样品；2为空载体pBV220)。表明，每代抽提的质粒，经酶切后的电泳图均与原始菌株DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845相符，表明传代过程中菌株仍然很稳定。测序结果表明目的基因序列完全正确。

将重组工程菌DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845连续传代培养50代，检测每代的目的蛋白表达量。结果表明，在传代过程中，菌株的遗传表达稳定，所表达的目的蛋白占菌体总蛋白的70％以上，符合原始菌株的表达量。

在连续传50代的过程中，本发明重组工程菌DH5α/PBV220/SwIFN-αCGMCCNo.2845在LB(+)和LB(-)培养基的生长形态、生理特性无明显差异；目的基因的诱导表达结果也表明不同传代次数的工程菌具有相似的表达能力；重组质粒经双酶切电泳鉴定表明工程菌重组质粒稳定，该重组工程菌具有良好的遗传稳定性。这可能与以下几方面因素有关：(1)工程宿主菌DH5α对外源质粒有较好的兼容性；(2)重组质粒本身结构稳定，不易发生缺失、插入或重排，从而保证了构建目的基因的稳定性；(3)重组蛋白分子量较小，这也有利于该质粒在宿主菌中的稳定共存。

菌种的稳定性与保存条件密切相关，本实验室采用冷冻(-80℃)干燥保存法保存该菌种，可以保证该菌种50年内具有良好的遗传稳定性。

实施例2、用工程菌制备α干扰素的生产工艺

一、用工程菌制备α干扰素的生产工艺

(一)发酵生产

发酵用LB培养基的组成：胰蛋白胨(trypton)10g/L，酵母浸膏(yeastextract)5g/L，NaCl 10g/L，甘油30g/L，pH7.2，用蒸馏水配置。

1、种子液的制备

将菌株DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845划线接种于LB琼脂平板，活化过夜，挑选生长良好的单菌落；接种含LB培养基的试管中，于30℃培养过夜；然后转接到1000ml三角瓶中，并按1∶1000比例添加氨苄青霉素(100mg/L)，30℃、200r/min扩大培养10h。

2、发酵

(1)空消：每次发酵前进行一次空罐灭菌。罐体水洗后，连接好各管路，将排气管以外的所有通气管道用铁丝夹子加紧，装五分之二发酵罐体积的蒸馏水，121℃高压灭菌40分钟。(2)实消：将LB培养基装入发酵罐中，培养基占发酵罐体积的2/5，进行实罐灭菌。(3)发酵表达：将种子培养液按1∶100比例接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中(氨苄青霉素在LB液体培养基中的浓度为100mg/L)的5L发酵罐中，30℃，200r/min，培养至OD₆₀₀为0.6(此过程通过调节溶氧和添加酸碱，保证发酵过程中DO为30％、pH值7.0)；添加IPTG诱导表达，期间每隔1h取样检测干扰素表达水平，培养4h后，终止发酵；发酵罐再进行一次灭菌并清洗，供再次发酵使用。

(二)分离纯化

1、提取包涵体：取上述诱导表达后发酵液，10000r/min、离心10min，收集菌体；将菌体反复冻融，加溶菌酶至1mg/mL菌悬液，冰浴30min，再超声破菌(200-300W，每次超声10s，共6次，两次间隔10s)后，4℃、10000r/min、离心20min，收集沉淀，沉淀用包涵体洗涤液(1％TritonX-100，50mmol/L Tris·Cl，100mmol/L NaCl，pH 8.0)洗涤。

2、表达蛋白的分离：用变性液(6mol/L盐酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris·Cl，10mmol/L DTT，pH 8.5)溶解包涵体，得到包涵体溶解液；将包涵体溶解液在4℃加入到预冷复性缓冲液(0.5mol/L L-Arg，2mmol/L EDTA，20％甘油，0.9mmol/LGSSG，0.1mol/L Tris·Cl，pH 8.0)中，磁力搅拌，放置过夜，得到含有目的蛋白的溶液。

3、纯化：将步骤2得到的有目的蛋白的溶液依次进行强阴离子交换层析(QA离子交换层析)和阳离子交换层析(CM离子交换层析)，收集洗脱液，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到的含目的蛋白的液体为IFN-α原液。

共生产8个批次。将IFN-α原液进行如下检测：

二、产物的产率及活性检测

(一)电泳检测纯度：本试验参照《中国生物制品规程(2000年版)》附录“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳”所述。按《分子克隆实验指南》上的方法制备分离胶和浓缩胶。10μL上样，电泳浓缩胶80Vx0.5h；分离胶120Vx1.52h，电泳完毕后，取下凝胶，考马斯亮兰染色4h，脱色液脱色2h。观察照相。扫描分析电泳图计算样品纯度。结果见图13及表1。经非还原型SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳测定，8批干扰素样品分子量均为19.2kDa±1.92kDa。8批供试品纯度都为98％，批间较为一致，亦与对照品迁移率一致。

(二)高效液相色谱检测纯度：色谱柱以适合分离分子量为5~60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液(pH 7.0)，柱温为25℃，流速为0.7ml/min，上样量为20μg，检测波长为280nm。按面积归一化法计算，得到样品纯度。实验设3次重复，结果取平均数。最后测得IFN-α原液中目的蛋白的纯度为98％。

(三)分子量检测：以猪α型干扰素多克隆抗体进行Westen bloting鉴定。实验设3次重复。结果如表1所示。结果在相对分子量19.2KD左右出现单一、清晰的条带(图14)。

(四)生物活性测定、蛋白含量及比活测定

1、生物活性测定

干扰素溶液的生物学活性测定参照2005年《中华人民共和国药典》三部附录XC细胞活性抑制法，用PK15细胞(猪肾传代细胞)-VSV病毒(水泡性口腔炎病毒)系统，采用CPE(细胞致病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检品仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的的最高稀释度的倒数为1个干扰素单位。根据效价测定及蛋白含量计算比活性。具体方法如下：

①复苏：取出保存于-176℃的PK15细胞株，37℃水浴融化后，将冻存管中的溶液全部转移至细胞培养瓶，再加入含8％小牛血清的完全培养液，置于含5％CO₂的37℃培养箱内，待次日出现均匀的单层贴壁细胞，更换完全培养液。使PK15细胞在培养基中贴壁生长，按1∶2～1∶4的比例传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。②传代：取生长状态良好且长至约80％的细胞，弃去培养液，用0.02％EDTA溶液洗1次后再用0.25％胰酶消化1-2min，弃去胰酶，以适量完全培养液吹打收集细胞，按1∶2～1∶4的比例接种至细胞瓶中，补加完全培养液至总体积为8～9ml，每周2～3次。③冻存：取生长状态良好的细胞，长至70～80％，弃去培养液，用0.02％EDTA溶液洗1次后再用0.25％胰酶消化1-2min，弃去胰酶，以完全培养液吹打收集细胞，收集细胞悬液，转移至离心管中，1000转/min，3min。弃去上清，以冻存液吹打悬浮细胞，分装至冻存管中。先置于4℃1小时，然后置于-20℃1.5小时，-70℃过夜，最后置于液氮罐底保存。④铺板：取培养成单层，生长状态良好的细胞，弃去培养液，用0.02％EDTA溶液洗1次后再用0.25％胰酶消化1-2min，弃去胰酶，以完全培养液吹打收集细胞，收集细胞悬液，并以完全培养液调整浓度为2.5×105～3.5×105/ml，用八道微量可调移液器接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5％CO₂培养箱中培养4-6小时，使细胞贴壁为单层。⑤样品稀释与细胞混合：制备重组猪干扰素α参照品溶液：取干扰素α参照品(四川世红生物技术有限公司)，按说明书以测定培养液稀释至1000U/ml，分装后置于-20℃保存。取培养成单层贴壁的PK15细胞的细胞培养板，弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入150μl测定培养液，将干扰素参照品和待检样品溶液移入相对应的孔中，每孔50μl，用八道微量可调移液器4倍系列稀释。每个稀释度应做复孔，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。于37℃、5％CO2培养箱中培养18-24小时。⑥加病毒：制备病毒液：攻毒剂量为100 CCID50(半数细胞感染剂量)，取保存的VSV用攻毒培养液稀释至工作浓度。攻毒：弃去PK15细胞培养板中的上清液，细胞对照孔加入攻毒培养液，每孔100μl。其余孔加入混合有病毒的攻毒培养液，每孔100μl。于37℃、5％CO2条件下培养16-20小时。显微镜下观察细胞病变，若病毒对照组各孔细胞出现75％-100％的明显病变和死亡(变圆、死亡、脱落)，而细胞对照组中的细胞仍生长良好(病变＝0)，则表明对照系统合格，结果成立。

⑦观察结果：染色：弃去细胞培养板中的上清，每孔加入50μl结晶紫染色液，室温放置15～30min。脱色和比色：弃去培养板染色液，流水小心冲洗，吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3～5min.混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。⑧计算利用统计软件或直线回归法处理数据。分别计算各干扰素样品的半效稀释倍数(即从样品溶液至相当于参照品50％最大效应点的稀释倍数)，按Reed-Muench法计算各样品的保护百分比及干扰素单位。以干扰素参照品为参考，校正待测品的生物学活性。制备重组猪干扰素α参照品溶液：取干扰素α参照品(四川世红生物技术有限公司产品)，按说明书以测定培养液稀释至1000U/ml，分装后置于-20℃保存。

按下式计算试验结果：

2、目的蛋白含量检测

取不同批次的半成品用Lowry法测定其中目的蛋白含量。

酚试剂A：4％碳酸钠与0.2N氢氧化钠各25ml混合，1％硫酸铜与2％酒石酸钾各0.5ml混合，再将上述两种混合液混合。酚试剂B：称取100g钨酸钠和25g钼酸钠，加入700ml蒸馏水，50ml 85％磷酸及100ml浓盐酸，上联回流管微沸回流10小时，取下回流管，加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水，2滴溴液，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。冷却后加蒸馏水稀释至1000ml过滤，经氢氧化钠液滴定，测定酸浓度并用蒸馏水稀释至相当于1mol/L盐酸浓度。标准蛋白溶液：准确稀释牛血清白蛋白标准品至0.1mg/ml(含0.02％NaN₃)。参照《中国生物制品规程(2000年版)》附录“蛋白含量测定/第三法微量法(Lowry法)”所述方法进行，取三批供试品用蒸馏水稀释10倍后用于检测。制作标准曲线：精确量取标准蛋白质溶液(浓度为0.1mg/ml)0，200，400，600，800，1000ul置于试管中，加蒸馏水补至1ml，加入5ml碱性铜液，混匀，室温放置10分钟，快速加入0.5ml酚试剂，摇均，室温放置30分钟，测定OD₆₅₀nm，根据测定结果绘制标准曲线，如图15所示(y＝0.3356x-0.0016(R²＝0.999))。样品：每批IFN-α原液按1∶10稀释度稀释，混匀后取1000ul移至试管中。其他操作同标准蛋白溶液，测OD₆₅₀nm，根据标准曲线读出样品蛋白质含量(μg/ml)。根据图15可知，样品浓度在0.02～0.10mg/ml范围内时，曲线很好的线性关系，根据线性回归方程，供试品稀释倍数为10倍，则供试品浓度计算方程为：

C(mg/ml)＝(0.3356×A₆₅₀-0.0016)×10。

3、根据IFN-α原液中目的蛋白的生物活性及浓度计算出目的蛋白的比活。

实验设3次重复。比活结果如表1所示。

(五)等电点聚焦：本试验参照《中国生物制品规程(2000年版)》附录“等电点测定第二法等电聚焦水平板电泳”所述方法进行，取8批供试品及对照品依法测定。实验设3次重复，结果取平均数。结果如表1所示。

表1、连续8批IFN-α原液蛋白含量纯度

批次	1	2	3	4	5	6	7	8
									分子量(KD)	19.2	19.2	19.2	19.2	19.2	19.2	19.2	19.2
HPLC纯度(％)	98	98	98	98	98	98	98	98
									SDS-PAGE纯度(％)	98	98	98	98	98	98	98	98
比活(10⁷U/mg)	6.6	6.7	6.5	6.8	6.6	6.7	6.5	6.6
									PI	7.3	7.3	7.3	7.3	7.3	7.3	7.3	7.3

结果表明，8个批次中，IFN-α原液中蛋白的RP-HPLC纯度达到98％，比活达6×10⁷U/mg，保持较高水平，符合大规模工业化生产要求。重组后的工程菌DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845生产性能稳定，发酵表达的重组猪α型干扰素比活高，得率高。

(六)肽图测定：将纯化的干扰素脱盐后，用胰蛋白酶裂解，然后通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定，结果如图16，干扰素样品肽图的主峰与预测相符。(七)抗生素活性：检测不到残余氨苄青霉素活性。(八)干扰素型别鉴定：干扰素供试品与猪α型干扰素抗血清作中和试验，结果呈阳性反应，证明型别无误。

以上结果表明，目的蛋白相对分子量、等电点均与理论值相

吻合。肽图、氨苄青霉素残留量等其它各项指标也都完全符合质量控制标准。表明该发酵表达工艺稳定，产品质量可以保证，可以投入规模化生产。

实施例3、本发明得到的猪α干扰素稳定性(保存期)检测

将上述制备得到的IFN-α原液进行稀释并加入稳定剂，然后进行如下检测。取3批进行检测。

1、强光照射对IFN-α稳定性的影响：将IFN-α供试品放置在装有日光灯管的光照箱内，于照度为4500lx±500lx条件下放置10天，于第5、10天各取3组进行生物比活性和纯度分析。

2、25℃加速试验：将猪α干扰素供试品置于恒温箱中，25℃和相对湿度60％±10％条件下放置6个月，于第1、3、6个月末取样分析，检测无菌、生物效价、纯度指标。

3、2～8℃长期稳定性考查：将猪α干扰素供试品置冰箱中，2～8℃放置24个月，于第6、12、18、24个月末取样分析。检测无菌、生物效价、纯度指标。

结果如下：

1、无菌检查

供试品在强光照射10天、25℃和相对湿度60％±10％条件下放置6个月和2～8℃放置24个月后，每次抽样检测，供试品在培养基中培养后，培养基均为澄清，培养基均未见菌生长，判供试品符合规定。

2、生物比活性测定

表2、干扰素供试品不同保存期生物比活性试验表

由上表可知：干扰素供试品在强光照射5天后，生物活性无明显变化，但是在强光照射10天后，生物活性明显降低；4℃~8℃存放12个月，25℃存放1个月，生物活性无明显变化。

3、纯度测定

表3、干扰素供试品不同保存期纯度检测结果

由上表可知：干扰素供试品在强光照射10天后，在25℃和相对湿度60％±10％条件下放置3个月和2～8℃放置24个月后，每次抽样检测纯度均无变化。

综上实验表明，1.本发明制得的干扰素在25℃、相对湿度60％±10％条件下保存3个月稳定，6个月的效价略有降低，纯度未受影响。

2.本发明制得的干扰素在2～8℃的长期稳定性考查24个月后质量稳定。因此，建议规程草案确定，本发明制得的干扰素在4℃~8℃存放24个月为宜。

3.本发明制得的干扰素在照度为4500lx±500lx条件下放置10天纯度未受影响，生物活性降低20％左右，外观无明显变化，仍为无色澄清液体，未发现浑浊、沉淀等出现。因此要求本发明制得的干扰素应避光保存。

实施例4、本发明制得的干扰素的安全性检测

实验室安全检测：

试验设置重组猪α干扰素(水针剂)单剂量一次性注射组，单剂量重复注射组和高剂量一次性注射组，按动物体重计算相当于临床使用剂量的1倍和50倍剂量，同时设置PBS注射组作为对照组，观察动物的临床表现和血液学及血生化指标。试验结果表明，所有注射重组猪α干扰素(水针剂)的动物从临床上均没有表现出明显的副反应，仅有高剂量组在用该制品后24h内偶尔出现体温升高现象，但很快恢复正常。血液学和血生化指标检测结果表明，三个试验组中具有基本相似的血液生化指标和血常规指标的变化。除了ALP和PLT比正常值偏高，WBC和RBC稍高或稍低于正常值，偶见AST或ALT稍高或稍低于正常值，其它血生化指标和血液常规指标均在正常范围之内，与PBS注射组之间没有显著差异。指标的变化与该制品的使用剂量高低无关，且在PBS注射组的个别猪也表现出相似的指标变化，因此，这些指标的变化可能与采血应激有关，而与重组猪α干扰素的使用无直接相关性。可见重组猪α干扰素对猪具有很好的安全性，无显著毒副作用。

临床安全试验：

分别使用三个不同批次的重组猪α干扰素以推荐剂量的2倍和10倍剂量经肌肉或皮下注射不同日龄临床猪，观察试验猪的临床反应性，结果发现临床试验猪未有不良反应。临床安全试验结果进一步证明了该制品良好的安全性。

实施例5、效力检测

考察其实验室条件性下对猪蓝耳病病毒的预防和治疗作用及其临床上对病毒性腹泻病猪的治疗效果。

(一)实验材料

将重组猪干扰素α制成水针剂，每瓶干扰素为20万国际单位，用于检测。

制得的水针剂性状：无色或淡黄色液体，偶有少量沉淀不影响使用，pH值6.0~7.0，渗透压比为1.0~1.3。

对照药品：猪白细胞干扰素：每瓶内干扰素为3万单位。四川世红生物技术有限公司生产，批号为农生药字(2003)437730，效价为5000u/ml。4℃冰箱，干燥保存。

动物来源：(1)实验室效力试验选取30日龄左右，体况健康的长白大约克二元交仔猪50头，公母各半，体重在5.0±0.5kg范围，购自山东齐和福地养殖有限公司，饲养在山东省农科院畜牧兽医研究所试验动物房内，所有试验仔猪只在20日龄左右接种2头份的猪瘟脾淋苗，没有接种其它疫苗，试验开始后也没有接种其它相关的疫苗。完成试验严格遵守国家关于实验动物福利的有关规定。(2)临床效力试验分别选取哺乳仔猪，保育猪和育成猪若干头，主要由病毒性疾病引起(包括猪传染性胃肠炎，猪流行性腹泻，冠状病毒，轮状病毒等)、少量为细菌性疾病引起的腹泻猪。品种包括大约克，杜洛克和长白品种猪。所有发病动物均购自山东省农科院良种猪场，喂养在山东省农科院良种猪研究中心猪舍内。完成试验严格遵守国家关于实验动物福利的有关规定。

猪舍清扫及消毒：每日上午和下午2次对猪舍进行清扫，用百毒杀、威岛、过氧乙酸等消毒液进行每周2次消毒，轮流交换消毒液的种类。全部作业结束后清扫，然后由动物管理室进行消毒。

动物饲养：仔猪饲料为全价日粮，102人工乳，由江苏安佑饲料有限公司生产。保育猪和育成猪全价日粮，由青岛六和饲料有限公司生产。哺乳仔猪和保育猪每日饲喂3~4次，保证自由采食。育成猪每日饲喂3~4kg。舍内配有自动饮水器，可以自由饮水。

毒种：猪蓝耳病病毒PRRSV标准毒株购自山东省农科院畜牧兽医研究所。毒价TCID₅₀＝10^-6.5/ml。

主要仪器设备：5ml注射器，10ml注射器，酒精棉，离心机，酶标仪，猪蓝耳病抗体检测试剂盒，体温计等。

(二)实验室效力试验(以蓝耳病为例)：

1、试验分组：首先将动物耳号做好标记，选取50头健康保育仔猪，要求体重日龄大小相差不大。随机分为5组，每组10头猪。

2、试验前仔猪蓝耳病抗体的测定：无菌采集仔猪前腔静脉血液2ml于灭菌EP管内，室温放置2h后放置4℃过夜，4℃，3000rpm离心分离血清样品，测定蓝耳病抗体。使用武汉科前生物公司生产的猪蓝耳病抗体检测试剂盒使用说明书操作：1，取预包被的微孔板，用样品稀释液将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加入100ul。再用样品稀释液1∶4稀释阴阳性对照，阴阳性对照孔各设2孔，每孔100ul。另设一空白对照孔，空白对照孔加100ul稀释液，轻轻振匀孔中样品，置37℃温浴30min。2，甩掉板中的溶液，用洗涤液洗板5次，200ul/孔，每次在干净吸水纸上拍干。3，每孔加酶标二抗(抗猪IgG-HRP结合物)，100ul/孔，置37℃温浴30min。4，洗涤5次，方法同2。切记每次在干净吸水纸上拍干。5，每孔加底物A液、B液各1滴(50ul)，混匀，室温避光显色10min。6，每孔加终止液1滴(50ul)，10min内测定结果。结果判定：样品OD₆₃₀值大于0.42，判为阳性；样品OD₆₃₀值在0.38~0.42之间，判为可疑；样品OD₆₃₀值小于0.38，判为阴性。

3、蓝耳病病毒细胞毒的获取及毒价测定：按常规方法，Marc-145细胞在37℃培养48h左右长成单层厚度，倾去生长液，每瓶细胞接种1ml细胞毒液，37℃吸附1h后，用含2.5％新生牛血清的维持液在37℃培养5~7天。逐日观察细胞CPE，当达到80％左右病变时，收毒，-20℃反复冻融3次。在96孔细胞培养板中培养Marc-145细胞，长成单层后，将收获的病毒液分别作10^-3，…10^-7、10^-8稀释，每个稀释度接种8孔，观察CPE变化，按照Reed-Muench法计算蓝耳病病毒标准毒株的TCID₅₀。

4、预防性和治疗性试验设计：检测蓝耳病抗体阴性的试验仔猪随机分为5组，每组10头，组1为标准病毒对照组，组2每头猪先肌肉注射重组猪α-干扰素3万单位，间隔24h后经鼻腔接种TCID₅₀为10^-6.5/ml的标准蓝耳病病毒4ml，颈部肌肉注射3ml。组3先进行人工感染病毒(方法和剂量同组2)，24h后肌肉注射重组猪干扰素α3万单位。组4每头试验仔猪先使用蓝耳病病毒人工感染(方法和剂量同组2)，引起仔猪发病后(体温升高至40.5℃开始计算)，再使用重组猪干扰素α进行治疗。组5同组4设计，不同的是使用猪白细胞干扰素进行治疗。观察并记录每组动物攻毒后发病情况及使用重组猪干扰素α和猪白细胞干扰素进行预防性和治疗性的试验效果(详见表4)，在注射干扰素的同时使用抗菌素，以防止继发其他细菌性疾病的感染。

表4、动物分组及试验方案

注：“-”表示未进行任何接种，作攻毒对照组。

5、观察指标：实验室效力包括预防和治疗性试验中，观察每头猪攻毒前后每日体温变化，记录有无发热咳嗽等症状，精神食欲情况，排泄及局部炎症等，记录有无异常反应。记录用蓝耳病病毒标准株攻毒后使用注射用重组猪干扰素α和猪白细胞干扰素进行治疗的效果，观察动物发病和死亡情况，统计试验组及对照组动物发病率或死亡率，评价制品的效力；必要时在观察期结束，将所有动物扑杀，进行病理剖检检查。

6、实验室效力试验结果

(1)试验前仔猪蓝耳病抗体的测定结果

所选试验仔猪体内抗蓝耳病抗体OD₆₃₀值与阴性对照相比，均低于阴性对照，所以试验仔猪抗蓝耳病抗体均为阴性(见表5所示)，可以用于后续的攻毒和预防及治疗性试验。

表5、试验仔猪试验前蓝耳病抗体检测结果

注：“+”为阳性对照，“-”为阴性对照，1-50为试验仔猪编号，其中OD₆₃₀小于0.38判为阴性。

(2)试验用蓝耳病病毒的获取及毒价测定：所收获的Marc-145细胞毒液，共有200ml，其中取部分样品用Reed-Muench法计算PRRSV标准毒株的TCID₅₀为10^-6.5/ml。

(3)试验动物攻毒情况观察和记录：对照组1中10头接种PRRSV标准株后，于48~72h陆续出现体温升高，食欲减退等症状，眼结膜潮红，高热，体温41~42℃，持续3天不退，厌食，嗜睡，呼吸急促。部分猪有咳嗽呼吸不畅等症状。其中8头分别于发病后第7天和第8天卧地不起，四肢抽搐而死亡，另1头至第9天，病情好转。组2先使用重组猪α-干扰素预防然后攻蓝耳病病毒标准株，与对照组相比可以延迟24h左右引起体温升高症状，且发病率和死亡率明显降低(40％)。组3是在PRRSV标准株攻毒的潜伏期内(24h)用重组猪干扰素α治疗，可见发病数更低，10头中仅有4头有发病症状，而且仅有1头病猪死亡。组4是PRRSV标准株攻毒发病后使用重组猪干扰素α治疗，可以看到比潜伏期使用相比保护效果要差，能引起20％的死亡。组5是在发病后用市场上同类产品猪白细胞干扰素进行治疗，可见发病后使用效果均不是特别理想，发病率和死亡率都是20％，但使用重组猪α-干扰素能稍微减轻发病的症状，见表6所示。

表6、各组试验结果统计表

(4)死亡猪的剖检变化：试验组发病死亡的猪剖检观察：发现肺脏呈胰样病变，散布斑点状淤血。气管淤血，心包积液。肝脏边缘有白色坏死灶，淋巴结水肿，脾脏边缘有梗死灶，肾脏肿大，呈土黄色有出血点，膀胱有针尖大点状出血，尿液颜色稍深，血液呈暗红色。临床症状和病理变化均符合蓝耳病的特征。

(三)临床效力试验设计(以病毒性腹泻为例)

1、试验分组及设计：选取猪场发生腹泻病猪若干头为试验动物，包括杜洛克，大约克，长白品种。年龄阶段包括哺乳仔猪，保育仔猪，育成猪。其中试验组使用重组猪α干扰素治疗，对照组使用猪白细胞干扰素治疗，分别按照说明书的剂量使用，同时设置空白对照组，该组腹泻病猪不用药治疗。如下表7和表8所示。

表7、试验组使用重组猪干扰素α治疗方案

表8、对照组使用猪白细胞干扰素治疗方案

2、观察指标：发病猪使用重组猪干扰素α和猪白细胞干扰素以后，每天观察猪精神状态，腹泻有无好转，治愈头数和治愈率等指标，与空白对照组相比在康复时间上的差异。记录试验中发病猪的临床症状等指标。

3、结果：腹泻病猪使用猪干扰素α和猪白细胞干扰素治疗，与空白组不用药相比，能减缓发病病程，腹泻症状相比减轻，精神状态相比较好。使用不同品种如大约克，杜洛克，长白品种猪分别进行试验，相比来说，杜洛克抗病力最强，经猪干扰素α治疗3~5天后，治愈率可达到85％，与同类产品(猪白细胞干扰素)和同种类型猪相比能增加7~8个百分点。详细记录如下表9和表10所示。

表9、试验组用重组猪干扰素α治疗效果

表10、对照组用猪白细胞干扰素治疗效果

实验室效力试验中，使用蓝耳病病毒攻毒后，对照组动物于48~72h后陆续出现体温升高，达到40.5~42℃左右，精神不振，食欲减退等症状，有的出现不间断的咳嗽症状。组2先注射重组猪α干扰素再攻毒，可以延缓24~48h引起发病(体温升高)症状，并能较好减少蓝耳病病毒的感染的发病率和死亡率，感染前和感染后分别肌肉注射3万单位的猪干扰素α，猪的发病率分别下降40％和20％。病毒感染潜伏期内肌肉注射猪α干扰素，猪的发病率下降60％，死亡率仅10％，可见猪干扰素α在病毒潜伏期内使用能治疗猪繁殖与呼吸综合症疾病具有较好的防治效果，这可能是因为在发病潜伏期内，使用干扰素后能启动机体的抗病毒因子的产生，形成一种网络的保护机制，释放抗病毒蛋白因子，能有效地提高猪体的免疫水平。而在发病后使用重组猪α-干扰素和白细胞干扰素都能一定程度上减少发病率和死亡率，两者效果相差不大，但重组猪干扰素α能更好减轻临床体温升高的症状。

临床效力试验中，注射用重组猪干扰素α对病毒性腹泻引起的病猪治疗效果较好，平均治愈率达到81％以上，对不同品种猪，杜洛克品种猪抗病力相比来说最强，这在重组猪干扰素α和猪白细胞干扰素均有相似的结果，但相比猪白细胞干扰素效果稍好，同比增加7~8个百分点，且与空白对照组(不用药治疗组)相比，能明显缩短发病病程，精神和食欲状态较好。同时试验发现由于哺乳仔猪大多数因为大肠杆菌、链球菌等细菌性因素引起仔猪腹泻疾病，而用干扰素治疗效果不是很好，治愈率都在80％以下，故用干扰素治疗可能敏感性不是太强。而育成猪多见病毒性疾病引起，如猪传染性胃肠炎病毒，猪流行性腹泻病毒和冠状病毒等，可见用干扰素类治疗治愈率基本可达到85％以上。同时发现使用干扰素对病毒性疾病的治疗一般用于发病的初期，对试验中病毒性腹泻病猪的发病后期再用干扰素治疗的效果不是很好，故在临床用药时要注意给药时间。

通过设计在攻毒前预防，攻毒后潜伏期和发病后分别使用重组猪干扰素α预防和治疗蓝耳病的动物试验，可以看出，重组猪干扰素α对于防治蓝耳病是十分有效的，尤其在攻毒潜伏期内使用重组猪干扰素α效果更佳。另一方面，临床治疗病毒性腹泻的结果表明，该制品能较好的治愈病毒性腹泻。因此，本制品可以作为一种有效的新型抗病毒制剂应用于畜牧业的生产。

序列表

<110>北京中科拜克生物技术有限公司

<120>一种生产α干扰素的方法及其专用菌

<130>CGGNAC92200

<160>3

<210>1

<211>498

<2 12>DNA

<213>猪属家猪(Sus domesticus)

<400>1

tgtgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctccccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg gttcccccaa 120

gaggccttgg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180

ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg ggatgagagc 240

ctcctgcacc agttctgcac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300

atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420

tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga tccttctctt cctccagaaa cctgcaagac 480

agactcagga agaaggag 498

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gcagaattca tgtgtgacct gcctcagacc c 31

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ccggatcctt actccttctt cctgagtctg tct 33

Claims

1.一种重组菌，是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α/pBV220/Sw IFN-αCGMCC NO.2845。

2.一种制备α干扰素的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述重组菌，得到α干扰素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件包括：温度为25-35℃，溶氧为20-40％(体积百分含量)，以100-300r/min的速度振荡，pH值为6.5-7.5。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述温度为30℃，所述溶氧为30％，所述pH值为7.0，所述振荡的速度为200r/min。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括在所述发酵后进行纯化的步骤；所述纯化的方法为依次进行强阴离子交换层析和阳离子交换层析。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵后和所述纯化前，包括如下分离的步骤：

2)将所述溶解液与0-4℃复性缓冲液混匀，过夜；

所述复性缓冲液为含有0.4-0.6mol/L L-Arg、1-3mmol/L EDTA、10-30％(体积百分含量)甘油、0.8-1.0mmol/L GSSG，0.05-1.15mol/L Tris·Cl、pH值为7-9的溶液。