CN114558128A - 裸花紫珠作为鱼类疫苗佐剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是将裸花紫珠作为鱼类疫苗的佐剂，其有效成分为裸花紫珠，该佐剂的应用可以提高疫苗接种后的特异性保护率，该佐剂使用方式是与迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗混合后注射使用。将裸花紫珠作为一种鱼类疫苗佐剂，其优点在于价格低廉、残留低，不会使鱼获得耐药性、抗药性等。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及裸花紫珠作为鱼类疫苗佐剂及其应用。
背景技术
近年来，随着我国水产养殖业规模化和集约化程度的提升，病害已成为制约水产养殖业持续健康发展的重要因素。其中，迟缓型爱德华氏菌所引起的细菌性疾病对青鱼、草鱼等鲤科鱼类的健康养殖造成了巨大威胁。迟缓型爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)属于肠杆菌科爱德华菌属，属革兰氏阴性菌，已被中国农业农村部列为三类动物疫病，其易感动物包括鱼类、贝类、哺乳类、爬行类等。鱼类主要通过摄食带有迟缓爱德华氏菌的饵料，或接触带有迟缓爱德华氏菌的鱼类而受到感染。Edwardsiella tarda通过鱼类的消化道、鳃或者受伤表皮侵入鱼体，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。
鱼类虽然是最低等的脊椎动物，但它同时拥有先天免疫系统和适应性免疫系统。早在1938年，Snieszko等就发表了使用点状气单胞菌免疫鲤鱼后可获得免疫保护力的相关文献；1939年及1942年，Duff的研究发现通过注射和口服免疫，鳟鱼可获得杀鲑气单胞菌的免疫保护；在随后的“二战”时期，由于抗菌药物的广泛使用，使得水产养殖业进入了“药物时代”。但随着病原抗药性、耐药性等问题的出现，不仅导致水产养殖业巨大的经济损失，而且影响水产品质量并造成生态环境污染，这让人们重燃起对鱼类疫苗的兴趣。至20世纪70年代，鱼类疫苗在商业化的水产养殖业中开始得到应用。
鱼类疫苗根据其能否复制，可分为非复制型及复制型疫苗。其中非复制型疫苗包含灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗及颗粒疫苗，这些疫苗可通过紫外线、高温及声波等物理方法灭活，也可通过使用化学试剂如甲醛或通过低PH、溶剂、洗涤剂等化学方法灭活。复制型疫苗主要包括减毒活疫苗，它可通过实验室传代、环境菌替代、物理或化学诱变、基因工程技术及活菌表达抗原等方式达到减毒的效果。
鱼类疫苗主要通过三种方式进行接种：腹腔或肌肉注射、浸泡(浸浴或喷洒)及饲喂含疫苗饲料的经口免疫。这三种接种方式有各自的优缺点：(1)注射免疫能引起最佳的免疫保护，但对接种设备要求高、不适合鱼苗或小鱼种、耗费劳动力；(2)浸浴操作方便，不需要将鱼从养殖池转运出来，不会对鱼造成损伤，但其缺点是只适合鱼苗或幼鱼，成鱼或数量巨大的鱼如果用浸浴免疫会导致成本过高；(3)口服免疫适用于数量巨大、不易处理或易应激的鱼类，其缺点是保护效果差、疫苗消耗过大。
迄今为止，疫苗接种是预防水产养殖业传染性疾病最有效的方法。然而仅使用疫苗并不能起到很好的免疫保护效果，因此，通常会加入佐剂来提高疫苗的免疫效力。传统佐剂(如矿物油)被广泛应用于鱼类细菌疫苗，但这类佐剂不易注射，会引起较强的组织炎性反应，产生明显的副作用，且对细胞内病原疫苗作用不明显。随着鱼类免疫学的深入研究，纳米粒子、β-葡聚糖、细胞因子及中草药成分也作为佐剂应用于鱼类疫苗。如将黄茋多糖和蒲公英多糖作为哈维氏弧菌灭活疫苗的佐剂，可以明显提高该疫苗对牙鲆的免疫保护率。
裸花紫珠是一种分布于中国海南、广东、广西的中草药，属马鞭草科的灌木或小乔木。其叶有止血止痛、散瘀消肿之药用，亦可用于血热毒盛所导致的呼吸道、消化道出血及细菌感染性炎症，裸花紫珠还具有治疗肝硬化消化道出血、慢性盆腔炎、细菌性肺炎等临床药效。研究人员通过色谱法分离纯化，发现裸花紫珠化学成分主要包括6个黄铜和3个苯乙醇苷。目前，未有将裸花紫珠作为鱼类疫苗佐剂的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术中上述问题，本发明提供了裸花紫珠作为鱼类疫苗佐剂及其应用。
为了达到上述目的，本发明的实施例提供了裸花紫珠在制备增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂中的应用。
进一步的，所述鱼类疫苗的抗原为细菌。
更进一步的，所述细菌为迟缓型爱德华氏菌。
更进一步的，所述鱼类疫苗选自迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗。
进一步的，所述佐剂的使用方法为与灭活疫苗混合后注射使用。
本发明是将裸花紫珠作为鱼类疫苗的佐剂，裸花紫珠是其有效成分，该佐剂的应用可以提高疫苗接种后的特异性保护率，该佐剂使用方式是与迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗混合后注射使用。
本发明的上述方案有如下的有益效果：
本发明的上述方案将裸花紫珠作为一种鱼类疫苗佐剂能明显提高迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗的免疫保护率，且其优点在于价格低廉、残留低，不会使鱼获得耐药性、抗药性等。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
除非另有定义，本发明中所使用的专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明针对现有的问题，提供了裸花紫珠作为鱼类疫苗佐剂及其应用。
本发明佐剂使用方法如下：
(1)裸花紫珠注射斑马鱼/青鱼安全剂量的确定：将裸花紫珠浸膏称重，取1g溶于50mL灭菌PBS溶液中配制原液，即原液浓度为20mg/mL。将原液与PBS按比例配制为不同浓度的佐剂溶液：0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL，将上述不同浓度的裸花紫珠溶液经腹腔注射30尾斑马鱼/青鱼，观察21天，根据免疫鱼的成活情况，由此确定裸花紫珠作为佐剂的安全剂量范围。
(2)迟缓型爱德华氏菌致死浓度的确定：第一天将-80℃冰箱保种的迟缓型爱德华氏菌划线到带有Col抗性的TSA平板上；第二天挑取3个爱德华氏菌单克隆摇菌，在5mL TSB培养基中加入5μL Col，接种后拍打管壁，于28℃培养箱中静置过夜培养；第三天按1：20比例转菌，即250μL菌液加入4750μLTSB中，转接后置于培养箱中培养2-3小时，期间测OD540，当OD540为0.5时收菌，此时细菌浓度为2.5×108个/mL，4000g离心5分钟收集1mL菌种，PBS洗3次，再加入250μL PBS吹散混匀(标记为细菌原液；cfu：1×109)。将细菌原液与PBS按比例配制不同浓度的菌液(PBS组、104倍稀释液、103倍稀释液、102倍稀释液、10倍稀释液)，每组30条斑马鱼，每条斑马鱼注射10μL菌液，各组斑马鱼注射爱德华氏菌数分别为：0、103、104、105、106、107。
(3)灭活疫苗的制备及使用：将迟缓型爱德华氏菌置于1％浓度福尔马林中，4℃冰箱中静置过夜。第二天用PBS清洗3遍后离心，加入PBS制备为不同浓度的灭活疫苗。将不同浓度裸花紫珠佐剂与灭活疫苗按比例混合后，对斑马鱼进行腹腔注射接种，再按前述方法喂养及观察斑马鱼。
(4)裸花紫珠作为佐剂用于斑马鱼/青鱼的最佳浓度确定：将不同浓度裸花紫珠佐剂(0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL)与疫苗(104/105cfu)按比例混合后免疫接种斑马鱼/青鱼，30天后进行活的迟缓型爱德华氏菌攻毒试验，攻毒浓度为104/105cfu，攻毒后28天统计斑马鱼/青鱼死亡率。
以下通过实施例对本发明进一步说明。
实施例1：裸花紫珠对斑马鱼安全注射剂量试验
1.材料与方法
(1)试验材料及养殖条件：选取五月龄健康TU品系斑马鱼，体重约为0.32g，试验期间各组置于分隔的水槽中，每日喂斑马鱼两次丰年虫，水温控制在21℃-25℃之间，每日14小时光照及10小时黑暗；
(2)裸花紫珠对斑马鱼注射安全剂量的确定：分别使用前述浓度的裸花紫珠腹腔注射斑马鱼，每组注射30尾，每尾注射10μL，观察21天。
2.试验结果
对照组及试验组斑马鱼在21天中的死亡情况见表1，由此可知，裸花紫珠对斑马鱼的最大安全注射剂量为50μg/尾，即156.25μg/g(裸花紫珠/鱼体重)。
表1裸花紫珠对斑马鱼注射安全剂量试验
实施例2：迟缓型爱德华氏菌对斑马鱼致死浓度试验
1.材料与方法
(1)试验材料及养殖条件：同实施例1；
(2)迟缓型爱德华氏菌对斑马鱼致死浓度的测定：分别使用0、103、104、105、106、107数量的迟缓型爱德华氏菌经腹腔注射斑马鱼，每组注射30尾，每尾注射10μL，观察21天。
2.试验结果
对照组及试验组斑马鱼在21天中的死亡情况见表2，由此可知，迟缓型爱德华氏菌对斑马鱼的注射完全致死浓度为104/尾。
表2迟缓型爱德华氏菌对斑马鱼注射致死浓度试验
实施例3：裸花紫珠添加于迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗中，注射免疫接种斑马鱼。
1.材料与方法：
(1)试验材料及养殖条件：同实施例1。
(2)疫苗制备：第一天将-80℃冰箱保种的迟缓型爱德华氏菌在TSA培养基板(Col+)子上划板，活化细菌；第二天挑取TSA板子上的3个克隆接种至TSB培养基(Col+)中，于28℃培养箱中静置过夜；第三天再以1：20的比例转菌，即250μL细菌接种于4750μL TSB(Col+)中，继续培养约3小时，检测OD540值并确定其浓度。4000g离心5分钟收集菌种，PBS洗3次，再用PBS悬浮菌种，将其制成2.5×108cfu/mL浓度的菌悬液，置于浓度为1％福尔马林中，4℃冰箱中放置过夜，次日用PBS清洗菌体3次，再用PBS悬浮，制成迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗，置于4℃保存。取出100μL灭活疫苗涂布于TSA培养基上划板，过夜培养，第二日确定无菌种生长，即可确定灭活疫苗制备成功。此试验中，注射裸花紫珠与灭活疫苗的总量为20μL/尾。
2.试验设计
(1)试验分组：将试验设计分为7组，分别为对照组(仅注射PBS)、裸花紫珠组、迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗组、不同剂量裸花紫珠与迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗配对组。具体分组情况见表3。
表3斑马鱼免疫试验分组
(2)免疫方法：腹腔注射，注射剂量为20μL/尾。
(3)免疫后攻毒：免疫28天后，斑马鱼经腹腔注射新鲜E.tarda菌液(1×104cfu/尾)，进行人工感染试验。
3.试验结果
攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并根据公式相对保护率＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％，计算相对保护率。具体结果见表4。
表4裸花紫珠为迟缓爱德华氏菌灭活疫苗免疫佐剂对斑马鱼的免疫相对保护率
试验结果表明，仅注射裸花紫珠或仅注射迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗，对斑马鱼的免疫保护效果太差，其平均相对保护率分别为7.8％及17.8％。在灭活疫苗中添加不同剂量的裸花紫珠，均可提高灭活疫苗的相对保护率。其中，当灭活疫苗中添加31.25μg/g(裸花紫珠/体重)裸花紫珠时，效果最为明显，其平均相对保护率可提高至58.9％。上述结果证明了裸花紫珠作为迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗的佐剂，可提高该疫苗的相对保护率。
实施例4：裸花紫珠对青鱼安全注射剂量试验
1.材料与方法
(1)试验材料及养殖条件：选取10-12cm、体重约为18g的同批次健康青鱼，试验期间各组置于分隔的水桶中，每日投喂青鱼两次赤虫，水温控制在21℃-25℃之间，24小时连续充气；
(2)裸花紫珠对青鱼注射安全剂量的确定：分别使用前述浓度的裸花紫珠腹腔注射青鱼，每组注射30尾，每尾注射10μL，观察21天。
2.试验结果
裸花紫珠注射组，各组在21天时死亡青鱼数汇总见表5，通过结果可知，裸花紫珠对青鱼的注射安全剂量范围为50μg/尾，即2.78μg/g(裸花紫珠/鱼体重)。
表5裸花紫珠对青鱼注射安全剂量试验
实施例5：裸花紫珠添加于迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗中，注射免疫接种青鱼。
1.材料与方法：
(1)试验材料及养殖条件：同实施例4。
(2)疫苗制备：同实施例3。
2.试验设计
(1)试验分组：将试验设计分为7组，分别为对照组(仅注射PBS)、裸花紫珠组、迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗组、不同剂量裸花紫珠与迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗配对组。具体分组情况见表6。
表6青鱼免疫试验分组
(2)免疫方法：腹腔注射，注射剂量为20μL/尾。
(3)免疫后攻毒：免疫28天后，青鱼经腹腔注射新鲜E.tarda菌液(1×105cfu/尾)，进行人工感染试验。
3.试验结果
攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并根据公式前述公式计算相对保护率。结果见表7。
表7裸花紫珠为迟缓爱德华氏菌灭活疫苗免疫佐剂对青鱼的免疫相对保护率
试验结果表明，仅注射裸花紫珠或迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗，对青鱼的免疫保护效果较差，其平均相对保护率分别为8.9％及17.8％。在灭活疫苗中添加不同量的裸花紫珠，均可提高灭活疫苗的相对保护率。其中，当灭活疫苗中添加0.278μg/g(裸花紫珠/体重)裸花紫珠时，其保护效果最为明显，其平均相对保护率可提高至48.9％。上述结果证明了裸花紫珠作为迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗的佐剂，可提高疫苗的相对保护率。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.裸花紫珠在制备增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的佐剂在制备鱼类疫苗中的应用，其特征在于，所述鱼类疫苗的抗原为细菌。
3.根据权利要求2所述的佐剂在制备鱼类疫苗中的应用，其特征在于，所述细菌为迟缓型爱德华氏菌。
4.根据权利要求3所述的佐剂在制备鱼类疫苗中的应用，其特征在于，所述鱼类疫苗选自迟缓型爱德华氏菌灭活疫苗。
5.根据权利要求1所述的佐剂在制备鱼类疫苗中的应用，其特征在于，所述佐剂的使用方法为与灭活疫苗混合后注射使用。
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