CN113201505B - 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113201505B
CN113201505B CN202110364774.2A CN202110364774A CN113201505B CN 113201505 B CN113201505 B CN 113201505B CN 202110364774 A CN202110364774 A CN 202110364774A CN 113201505 B CN113201505 B CN 113201505B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
vibrio
vibrio alginolyticus
alginolyticus
valp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110364774.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113201505A (zh
Inventor
潘强
任慧英
孙虎芝
徐帆
闫艳新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd filed Critical Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Priority to CN202110364774.2A priority Critical patent/CN113201505B/zh
Publication of CN113201505A publication Critical patent/CN113201505A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113201505B publication Critical patent/CN113201505B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10231—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明公开了一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体被命名为vB_ValP_PJ115，于2020年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.20719。该噬菌体不仅具有宽裂解谱，特异性强，可有效防控水产养殖场溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌，极大地降低由于溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌引起的各种疾病的病发概率；还可广泛用于水产养殖过程中的容易因溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。

Description

一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物 及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的组合物及其应用。
背景技术
水产养殖过程中常见的致病菌包括溶藻弧菌(Vibrio Alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio Harveyi)、坎贝氏弧菌(Vibrio Cambellii)和副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)。溶藻弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌和副溶血弧菌都属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，革兰氏阴性短杆菌。
溶藻弧菌属于条件性致病菌，可通过受损的皮肤和口腔感染多种海水养殖鱼类、虾类和贝类，引起鱼类溃疡病、腹水症、虾红体病或出血病等消化道疾病的发生与流行，溶藻弧菌还可引起人类食源性疾病，造成典型的胃肠炎反应。
哈维氏弧菌是养殖对虾最主要的病原菌之一，对虾感染后一般会出现红腿、肌肉白浊等症状，苗期和动物幼体常被感染，同时也会造成鲈鱼、遮目鱼、大菱鲆等鱼类的角膜透明、充血，肠胃炎，肌肉溃烂，鳍条基部、肛门红肿等弧菌病。
噬菌体(Bacteriophage或Phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，其体积微小、结构简单，不具备细胞结构，分布十分广泛，凡是细菌存在之处几乎都有相应的噬菌体。专一性强，噬菌体只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，不会破坏正常菌群；无残留、无毒害，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内，而且噬菌体的降解终产物为氨基酸和核苷酸对人和动物无影响。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ115及其应用；该噬菌体不仅可用于制备成药物用于预防和治疗因溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌感染导致的疾病，还可用于制备水产饲料添加剂、以及水体消毒剂等。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，用以解决因溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌造成的感染、以及与水体中因上述病原菌大量增殖引起的水体问题，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ115，该噬菌体分离自山东省青岛市某湾区污水，已于2020年11月09日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20719。
电镜下观测到：该噬菌体头部长为78-80nm，头宽为73-75nm，尾长约25nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于短尾噬菌体科，将其命名为vB_ValP_PJ115。
第二方面，本申请还提供了上述溶藻弧菌噬菌体在制备用于预防或治疗因溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌感染导致疾病的药物中的应用。优选的，上述溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌感染的疾病包括由溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌感染引发的水产的疾病。
优选地，所述水产选自海水水产，更优选为海水产的鱼类、虾类、蟹类、螺类或贝类的至少一种。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ115。
优选地，所述噬菌体组合物中溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ115作为唯一活性成分，或与其他溶藻弧菌噬菌体进行复配。
优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_ValP_PJ115的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％，且保持基本相同的抑菌活性。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_ValP_PJ115的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％；更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_ValP_PJ115的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分上述的溶藻弧菌噬菌体或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他病原菌的噬菌体。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
优选地，采用溶液剂。溶液剂通过浸浴给药是将噬菌体制剂直接投放于水产养殖水体中进行给药的方式，操作简单，效果好。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。
第五方面，本发明还提供一种水产饲料添加剂，其包括如上所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物，通过与水产饲料进行混拌后，对水产动物(如对虾)进行饲喂，从而达到预防或治疗溶藻弧菌病的效果。
优选地，饲料中每种噬菌体的效价为1×108PFU/g以上。
第六方面，本发明还提供一种水体消毒剂，其有效成分主要为所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的效价为1×104PFU/mL以上。水体消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分或其他佐剂，更优选地，所述佐剂包括能延长噬菌体有效期的佐剂。
上述水体消毒剂可用于水产养殖场所的环境消毒和饲料消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲料、饲养器具等进行溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌消毒。所述养殖环境包括池壁、水体等。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
第八方面，本发明还提供上述检测试剂盒在用于检测溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌中的用途。
第九方面，本发明还提供用于水产品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。生物抑菌剂通过对水产品的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌的增殖。
在本发明中，溶藻弧菌噬菌体命名为vB_ValP_PJ115，于2020年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.20719。
本发明具有以下有益效果：
1、该噬菌体对溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌具有较强的裂解作用，该噬菌体对溶藻弧菌裂解率可达80.47％，对哈维氏弧菌裂解率可达77.8％，对坎贝氏弧菌裂解率可达73.68％，可以有效防控水产养殖场中因溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌导致的疾病，极大地降低引起的各种疾病的病发概率，如急性肝胰腺坏死综合征；还可以用于对水产养殖场环境、饲料、水体等进行全面的溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌的消毒，极大地降低了引起的水产品发病率和死亡率。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。可广泛用于水产养殖过程中的容易因感染溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_ValP_PJ115的电镜照片；
图2为噬菌体vB_ValP_PJ115的热稳定性结果；
图3为噬菌体vB_ValP_PJ115的pH稳定性结果；
图4为噬菌体vB_ValP_PJ115的一步生长曲线；
图5为噬菌体vB_ValP_PJ115的体外裂解实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)、丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
实施例1噬菌体的分离培养
(一)宿主菌悬液的制备
宿主菌Va157在TCBS平板上分区划线，挑单菌落接种入5mL 2216E液体培养基中，170rpm、37℃条件下增殖至对数生长期，得到新鲜菌液。
(二)噬菌体的分离和纯化
(1)噬菌体的分离
将取自山东省青岛市某湾区采集的污水进行11000r/min，5min离心，将离心得到的上清液使用0.22μm滤膜过滤后，加入2216E培养基与100μL的宿主菌悬液，在170rpm、37℃的条件下培养16h后，再于11000r/min的条件下离心5min，最后用0.22μm滤膜过滤后，得到噬菌体原液。
将噬菌体原液用1×PBS溶液进行10倍倍比稀释，得到10-2、10-4、10-6、10-8稀释液后，分别取上述不同浓度稀释液各100μL与制备好的溶藻弧菌悬液混合后在37℃孵育5min后，加入5mL的NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E培养基平板中，待其凝固后倒置于37℃温箱中培养16h后观察，得到噬菌斑。
(2)噬菌体的纯化
用无菌镊子抠取单个噬菌斑，置于1mL PBS溶液后放置于170rpm、37℃摇床中浸出30min，将浸出液稀释至10-2，按照1:1的比例与溶藻弧菌混合，37℃孵育5min，混合液加入5mL NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E培养基平板中，待其凝固后倒置37℃温箱中培养16h后得到纯化1代噬菌体。纯化3-5代，得到形态一致的噬菌斑。
(3)噬菌体悬液的制备
取按照上述方法纯化3代后的噬菌体平板，抠取单斑，置于1mL PBS溶液中捏碎，于170rpm、37℃摇床中浸出30min。
取宿主菌悬液100μL加入5mL2216E液体培养基中，将噬菌体浸出液与宿主菌悬液按照1:1的比例加入上述培养基中，置于170rpm、37℃摇床中振荡增殖4h，对所得增殖液11000rpm离心5min，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体悬液。
(三)噬菌体效价的测定
将上述噬菌体悬液使用PBS缓冲液进行10倍稀释，使用双层平板法测定稀释至10-6与10-7的噬菌体效价，两个平行。培养后对噬菌斑进行计数并计算效价。测定得到，所述噬菌体悬液效价为1.82×1010PFU/mL。
实施例2噬菌体的生物学特性测定
(一)噬菌体的电镜检测
取20μl的效价为1010PFU/mL的噬菌体滴在铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。
结果如图1所示，该噬菌体头部长为78-80nm，头宽为73-75nm，可伸缩的尾长约25nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于短尾噬菌体科，将其命名为vB_ValP_PJ115。
(二)噬菌体的裂解谱测定
实验方法：本实施例采用双层平板法测定噬菌体裂解谱，将噬菌体悬液分别与溶藻弧菌菌液各取100μL加入0.5mL离心管中混合，37℃孵育5min后加入5mL NB上层培养基中混匀，迅速倒入2216E培养基平板中，待其冷凝后倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后取出平板观察有无噬菌斑形成来鉴别能否裂解。
通过上述方法检测噬菌体vB_ValP_PJ115对128株溶藻弧菌、36株哈维氏弧菌和19株坎贝氏弧菌的裂解能力，噬菌体vB_ValP_PJ115对溶藻弧菌裂解率可达80.47％，对哈维氏弧菌裂解率可达77.8％，对坎贝氏弧菌裂解率可达73.68％。其中，这183株弧菌分别来源于山东滨州、山东海阳、山东青岛、福建漳州、广东湛江病死虾及水样。对这183株弧菌进行PCR毒力基因检测和敏感性检测，结果见下表1。
表1噬菌体vB_ValP_PJ115对溶藻弧菌的裂解谱
表2噬菌体vB_ValP_PJ115对哈维氏弧菌的裂解谱
表3噬菌体vB_ValP_PJ115对坎贝氏弧菌的裂解谱
(三)噬菌体的最佳感染复数的测定
采用平板涂布法测定宿主菌浓度，并进行两个平行，倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后进行菌落计数，计算宿主菌浓度。
取宿主菌液100μL于5mL 2216E液体培养基中，按照感染复数分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例加入噬菌体悬液并混匀，170rpm，37℃振荡培养至液体变清，11000rpm离心5min，测定噬菌体效价。
结果如表4所示，感染复数为0.001时，噬菌体的效价最高，最高6.22×1010PFU/mL。
表4噬菌体最佳感染复数
(四)噬菌体的热稳定性测定
取测定效价为1×1010PFU/mL的噬菌体悬液500μL于1.5mL离心管中，分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中并在20min、40min、60min分别测定效价。
结果如图2所示，噬菌体vB_ValP_PJ115在30℃、40℃、50℃、60℃时经过1h后，其效价并无明显变化；70℃时经过40min作用后基本失活，说明vB_ValP_PJ115噬菌体能够耐受一定程度的高温，60℃以下较稳定。
(五)噬菌体的pH稳定性测定
取无菌试管中加入4.5mL的不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的PBS，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL 1010PFU/mL的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。处理结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图3所示，噬菌体vB_ValP_PJ115在pH＝3～12之间能够保持自身稳定性，仍具有裂解能力；而该噬菌体对强酸强碱较为敏感，在pH低于2或高于13的强酸强碱条件下，噬菌体基本完全失活。因此，vB_ValP_PJ115能够耐受一定的酸碱环境。
(六)噬菌体一步生长曲线的测定
按照MOI＝0.001添加噬菌体vB_ValP_PJ115增殖液和其宿主菌对数期菌液各1mL，充分混匀并开始计时，37℃温育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1mL 2216E液体培养基洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的2216E液体培养基混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0min和每隔10min取出150μL，10000rpm离心1min，吸取100μl的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期。
如图4的噬菌体vB_ValP_PJ115的一步生长曲线所示，噬菌体裂解周期时长为100min：噬菌体感染宿主菌后，30min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为30min；噬菌体侵染宿主菌后的30-80min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为50min；在随后的20min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。噬菌体的裂解量约为1.32×1010PFU/mL/1×108CFU/mL＝132PFU/细胞(裂解末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度)。噬菌体vB_ValP_PJ115潜伏期和裂解期时间较短，同时裂解量较高，适合用于噬菌体治疗。
(七)噬菌体体外裂解实验
将噬菌体悬液与宿主菌按照MOI＝0.001的比例加入100mL 2216E液体培养基中，临床分离致病性溶藻弧菌菌株Va375的终浓度为5.00×106CFU/mL，噬菌体的终浓度为5.00×103PFU/mL，对照组加入与噬菌体溶液相同量的无菌2216E培养基，菌液和噬菌体混合后在37℃，170rpm的摇床内振荡培养，每隔一定的时间测定OD600值直至混合液变清亮。
结果如图5所示：噬菌体能够有效抑制宿主菌。2h时试验组OD600明显下降，说明菌浓度急剧下降；3.5h时试验组OD600已降至0.3，对照组宿主菌OD600值在3h时已上升至1.0以上；5.5h时加入噬菌体悬液的试验组已经显著澄清，而对照组十分浑浊。
实施例3噬菌体拌料饲喂后虾体内代谢过程
实验方法：选择体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。分别设置实验组和对照组，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体vB_ValP_PJ115与对虾饲料均匀混合，噬菌体拌料后效价为5×108PFU/g，将饲料阴干，再以对虾体重3％的剂量饲喂实验组的对虾，对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。喂食后0.5、6、24、48、72、96、120、144h检测虾肠、肝胰腺以及空白对照组正常对虾体内噬菌体的含量。
实验结果说明：饲喂浸泡过噬菌体vB_ValP_PJ115的虾料0.5h后，实验组的虾体肠道、肝胰腺内即检测到噬菌体的存在，效价可达6.85×106PFU/g，噬菌体可以通过喂食进入虾体内，且噬菌体可持续存在2天以上，这对噬菌体作为水产饲料添加剂具有指导作用，且可用于预防和治疗弧菌病。实验结果还表明，噬菌体对南美白对虾的健康没有影响，不影响对虾正常活动，说明噬菌体安全性很好。
实施例4噬菌体vB_ValP_PJ115预防溶藻弧菌感染南美白对虾效果测定
(一)噬菌体拌料饲喂南美白对虾预防溶藻弧菌感染的效果测定
实验方法：准备体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。每组50只，试验组设置双平行，且按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂，噬菌体的含量为1×108PFU/mL。对照组(即攻毒组)按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。1h后给所有对虾注射溶藻弧菌，剂量为3.25×106CFU/只，同时设一空白对照组不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体结果见下表5。
表5噬菌体拌料对溶藻弧菌的预防效果
上述结果显示，实验组的保护率高于80％，这说明噬菌体作为水产饲料添加剂添加入南美白对虾的饲料中，能有效预防对虾感染溶藻弧菌而导致的早疾病，降低南美白对虾的死亡率，提高成活率，降低养殖风险。
(二)噬菌体vB_ValP_PJ115治疗南美白对虾感染溶藻弧菌效果测定
实验方法：体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。每组50只，试验组设置双平行，给所有对虾注射溶藻弧菌，剂量为3.25×106CFU/只。攻毒1h后，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂。对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。同时设一空白对照组不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体测试结果见表6。
表6噬菌体拌料对溶藻弧菌疾病的治疗效果
实验结果显示：给南美白对虾注射致病性溶藻弧菌1h后，饲喂浸润了噬菌体的饲料，可有效控制对虾的死亡率，与未饲喂携带噬菌体的饲料的攻毒组相比，试验组的对虾存活率得到大幅度地提高。本发明为噬菌体制剂制备、抗溶藻弧菌的药物提供了一种新来源，从而为治疗溶藻弧菌感染引起的疾病提供新的理论依据和实践经验。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一株溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_ValP_PJ115，其保藏编号为CGMCCNo.20719。
2.如权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体在制备用于预防或治疗溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌感染的疾病的药物中的应用。
3.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ115。
4.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1或3任一项所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
5.权利要求4所述的噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂还包括其他病原菌的噬菌体。
6.权利要求5所述的噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
7.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1或3所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物；其中还包含其他用于抑制或消灭环境中病毒、细菌的活性成分。
8.权利要求7所述的水体消毒剂，其特征在于，溶藻弧菌噬菌体的效价为1×104PFU/mL以上。
9.如权利要求7或8所述的消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂用于杀灭环境中的溶藻弧菌、哈维氏弧菌或坎贝氏弧菌。
10.如权利要求9所述的消毒剂的应用，所述环境包括水池、饲养环境、料台、饲养器具、循环水养殖系统。
11.一种用于水产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
CN202110364774.2A 2021-04-02 2021-04-02 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Active CN113201505B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110364774.2A CN113201505B (zh) 2021-04-02 2021-04-02 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110364774.2A CN113201505B (zh) 2021-04-02 2021-04-02 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113201505A CN113201505A (zh) 2021-08-03
CN113201505B true CN113201505B (zh) 2023-12-29

Family

ID=77026131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110364774.2A Active CN113201505B (zh) 2021-04-02 2021-04-02 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113201505B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114561363B (zh) * 2022-01-27 2024-07-12 青岛百奥安泰生物科技有限公司 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用
CN115044561B (zh) * 2022-03-31 2024-07-12 青岛百奥安泰生物科技有限公司 一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体及其用途
CN118048318A (zh) * 2024-02-01 2024-05-17 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190099459A1 (en) * 2016-04-01 2019-04-04 Trustees Of Tufts College Methods and compositions for preventing infection by a Vibrio species
CN111676197A (zh) * 2020-07-01 2020-09-18 青岛诺安百特生物技术有限公司 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190099459A1 (en) * 2016-04-01 2019-04-04 Trustees Of Tufts College Methods and compositions for preventing infection by a Vibrio species
CN111676197A (zh) * 2020-07-01 2020-09-18 青岛诺安百特生物技术有限公司 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株宽谱裂解性溶藻弧菌噬菌体ФV170的分离鉴定及生物学特性;付汉清;《微生物学通报》;20191231;第46卷(第4期);第819-828页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113201505A (zh) 2021-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113201505B (zh) 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
US20210046131A1 (en) Wide-spectrum salmonella phage and application thereof
CN111690620B (zh) 一株魏氏梭菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111254121B (zh) 一种沙门氏菌噬菌体及在防治沙门氏菌感染的疾病的药物中的应用
CN111705042B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02、其噬菌体组合物及其应用
CN111909904B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN114736875B (zh) 一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111718907B (zh) 新型溶藻弧菌噬菌体、其组合物及其应用
CN111676197B (zh) 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111705041B (zh) 一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其应用
CN111363723B (zh) 新型霍乱弧菌噬菌体及其应用
CN111363724B (zh) 一种新型噬菌体、噬菌体混合制剂及其在防治水貂出血性肺炎的药物中的应用
CN114763539B (zh) 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN114480302B (zh) 一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
JP6262881B2 (ja) 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物
CN116286671A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体sp8、噬菌体组合物及其应用
CN115247155B (zh) 一株美人鱼发光杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN114736877B (zh) 一株杀鱼爱德华氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN115181731B (zh) 一株坎贝氏弧菌噬菌体、制备方法及其应用
CN117264910B (zh) 耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用
CN115820569A (zh) 一株奥氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN114703151B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用
CN115247154B (zh) 一株鸭源魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PM13、其噬菌体组合物及其应用
CN116121203A (zh) 一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用
CN116286674A (zh) 一株鸭疫里默氏菌噬菌体vB_RanS_PT24、其噬菌体组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant