CN118048318A - 一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体及其应用。所述噬菌体RDP‑VA‑22022保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45396。本发明提供的溶藻弧菌噬菌体RDP‑VA‑22022对溶藻弧菌有强裂解效用，效价较高，同时对胍类消毒剂具有较强的耐受性，可作为环境消毒剂与胍类消毒剂同时使用，可高效可靠的治疗溶藻弧菌引起的水产动物疾病，改善水体环境，减少抗生素的滥用，为水产养殖用药提供一种健康安全的新途径。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体及其应用。
背景技术
弧菌是一类常见嗜盐性的革兰氏阴性菌，其主要的栖息地是海水中，广泛存在于海水和海产品中，分布极广，是我国沿海地区海水鱼及贝类常见的致病菌，通常引起胃肠感染，也可以引起肠道外感染，会导致海水鱼类患有出血症。溶藻弧菌是海水中存在最广泛最普遍的致病菌，很大程度上阻挠目前的海水养殖行业的发展。
溶藻弧菌是一种重要的人畜共患病原菌，不仅引起严重的海水动物弧菌病，而且造成人类的感染，甚至死亡。目前，对于溶藻弧菌预防和控制的主要方法是使用抗生素，虽然抗生素具有使用方便，广谱抑菌，见效快等优点，但是，抗生素的滥用也导致了严重的细菌耐药性，在防治弧菌所造成的的疾病时效果越来越差，急需开发新型抗弧菌的药物。
噬菌体是一种细菌病毒，不会破坏微生态环境，而且溶藻弧菌噬菌体的作用靶点在原核微生物细胞壁，对动植物细胞上没有相应的作用位点，极具安全性。利用细菌的天敌噬菌体来解决细菌具有广阔前景的生物防治途径。
聚六亚甲基胍(Polyhexamethylene biguanide,PHMB)在水产养殖中经常用作一种有效的消毒剂和杀菌剂。它可以被用来清洁和消毒养殖设备、水槽和相关设施，以防止细菌、真菌和病毒的传播。在水产养殖中，保持水质的卫生和清洁非常重要，而PHMB的杀菌特性使其成为一种理想的选择。PHMB可以有效杀灭水中的有害微生物，帮助预防鱼类和其他水生生物的疾病。它还可以帮助维持水体的清洁和卫生，有助于提高养殖环境的质量，从而促进水产养殖业的可持续发展。
因此，需要研究一种对聚六亚甲基胍等消毒剂具有耐受性的噬菌体，将噬菌体与胍类消毒剂同时使用，以提高治疗效果，有效改善水体环境。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体及其应用。本发明提供的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022对溶藻弧菌有强裂解效用，效价较高，同时对胍类消毒剂具有较强的耐受性，可作为环境消毒剂与胍类消毒剂同时使用，可高效可靠的治疗溶藻弧菌引起的水产动物疾病，改善水体环境，减少抗生素的滥用，为水产养殖用药提供一种健康安全的新途径。
本发明的技术方案是：
本发明提供了一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体，所述的溶藻弧菌噬菌体为RDP-VA-22022，从山东省青岛市即墨田横镇的水产养殖场中分离得到，已于2023年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45396。
进一步地，所述噬菌体RDP-VA-22022有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约72nm，有一个长约200nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。
进一步地，所述对胍类消毒剂具有耐受性溶藻弧菌噬菌体为RDP-VA-22022具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步地，本发明所述的对胍类消毒剂具有耐受性溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022的最佳感染复数为10:1，对应效价为1012pfu/mL。
进一步地，本发明提供了一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022在制备预防或治疗溶藻弧菌感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明提供了一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022在制备预防或治疗溶藻弧菌感染引起的疾病的环境消毒剂中的应用。
本发明提供了一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022在制备预防或治疗溶藻弧菌感染引起的疾病的水产饲料添加剂中的应用。
进一步地，本发明提供了一种噬菌体组合物，包括上述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022。
本发明还提供了一种噬菌体药物制剂，包括权利上述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体或上述的噬菌体组合物。
进一步地，所述的噬菌体药物制剂中对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022的浓度大于109pfu/mL。
更进一步地，所述噬菌体药物制剂还包括药学上可接受的辅料，其剂型为粉剂、颗粒剂、冻干剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或凝胶剂。
更进一步地，所述噬菌体药物制剂中还包括益生菌，能有效提高实际应用的防治效果。
另外，由于本发明提供的噬菌体RDP-VA-22022对溶藻弧菌有强裂解效用，同时对胍类消毒剂具有具有优异的耐受性，可以与胍类消毒剂一起使用，共同提高杀菌效果，治疗溶藻弧菌引起的水产动物疾病，改善水体环境，因此，本发明还提供了一种环境消毒剂，包括上述的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022或上述的噬菌体组合物。
进一步地，本发明提供的环境消毒剂中还可以包括胍类消毒剂，优选的，所述胍类消毒剂的主要成分为聚六亚甲基胍。
更进一步地，所述的环境消毒剂可用于水体、饲养环境、饲养器具、池壁、料台、或循环水养养殖系统进行杀菌消毒。
与现有技术相比，本发明提供的对胍类消毒剂具有耐受性溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022具有以下优势：
(1)本发明于山东省青岛市即墨田横镇一水产养殖场中发现并分离了一株对胍类消毒剂具有耐受性溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022，该噬菌体效价较高，对溶藻弧菌有强裂解效用，裂解率高达98.5％，在预防和治疗由溶藻弧菌感染的疾病具有很好的优势，与抗生素相比具有更高的有效性、安全性和高度特异性，可以减少抗生素的滥用，并且可以与益生菌类产品同时使用，实际应用防治效果好。
(2)本发明提供的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022对胍类消毒剂具有较强的耐受性，可作为环境消毒剂与胍类消毒剂同时使用，可高效可靠的治疗溶藻弧菌引起的水产动物疾病，改善水体环境，为水产养殖用药提供一种健康安全的新途径。
生物保藏说明：
一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022，已于2023年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45396。
附图说明
图1为噬菌体RDP-VA-22022的噬菌斑照片；
图2为噬菌体RDP-VA-22022的电镜图；
图3为噬菌体RDP-VA-22022对溶藻弧菌生长曲线的作用图。
具体实施方式
本发明使用从青岛即墨田横镇区域养殖的患病海参病灶处分离致病性溶藻弧菌VA22022，并通过实验确定了VA22022的致病性和耐药性，以VA22022为宿主，从环境中分离得到一株溶藻弧菌噬菌体，并通过全基因组序列确定了RDP-VA-22022的基因型。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下面实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1溶藻弧菌及其噬菌体的分离纯化
(1)溶藻弧菌的分离鉴定
从青岛即墨田横镇区域养殖的发病海参的病变部位取样，采用无菌操作的方法，在TCBS培养基上划线，37℃培养24h后，在TCBS琼脂平板上呈现边缘整齐的圆形绿色菌落，直径约2～4mm；然后挑取典型菌落在科玛嘉弧菌显色培养基上划线，37℃培养18～24h后，在科玛嘉弧菌显色培养基上呈现紫色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL的2216E液体培养基中，37℃，140rpm振荡培养7h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过两组溶藻特异性引物(如表1所示)核酸检测均呈阳性，且PCR产物测序用BLAST比对后，确定为溶藻弧菌，将其中一株命名为VA22022。
表1引物序列
| VA485-F | AAGAGGGTTACTTTCATCAG |
| VA485-R | CGTGTTTCCACCAGCAT |
| VA353-F | CCTAAACGCGGTTATCAACTCA |
| VA353-R | GGCGTCATCACAGCTACATTTT |
(2)溶藻弧菌噬菌体的分离鉴定
本发明试验用污水样品为2022年从青岛即墨田横养殖户周边污水中采集，作为噬菌体分离的水样。
取污水10毫升，10000rpm离心5分钟，出除较大杂质及大部分细菌后，再用0.22微米微孔滤膜过滤除菌。取3毫升滤液和3毫升宿主菌菌悬液，一起加入20毫升高压灭菌后的2216E液体培养基中，然后置37℃培养箱中，过夜培养。培养后取5毫升，10000rpm离心5分钟，再用0.22微米微孔滤器过滤除菌，滤液即为拟含有噬菌体的原液。然后，采用双平板法鉴定是否有噬菌体，若有噬菌斑则有噬菌体，反之则表明未分离出噬菌体，需从新筛选。
(3)噬菌体的纯化
初次分离的噬菌斑大小、形态常常不一致，因此需要进一步的纯化。在有噬菌斑的双层平板上挑取单个独立、形态均匀、清晰透明的噬菌斑，置1毫升生理盐水中，浸泡10分钟后，取清液，用0.22微米微孔过滤器过滤，然后将滤液适当稀释(铺双平板时有单个噬菌斑)后，与宿主菌悬液铺双层平板，此步骤重复3～4次，待双平板上各噬菌斑大小、形态和清晰度一致时即得到纯化的噬菌体。
(4)噬菌体效价的测定
将纯化好的噬菌体铺双层平板，然后取单个噬菌斑，加入LB肉汤中，同时加入宿主菌悬液，将噬菌体增殖后，再将增殖液10000rpm离心5分钟后再用0.22微米微孔过滤器过滤，将滤液做10倍梯度稀释至1010倍，取最后3个稀释度的噬菌体稀释液0.1毫升和宿主菌悬液0.1毫升，铺双层平板，测定噬菌体效价。
噬菌体效价(pfu/mL)＝噬菌斑数×稀释倍数÷0.1
结果表明，如图1所示，其噬菌斑形态、大小和清晰度一致，有典型的裂解性噬菌体特征。经计算得该噬菌体的效价可达1011pfu/mL以上。
实施例2：噬菌体的形态观察
运用磷钨酸负染法：在石蜡片上滴噬菌体液(效价1010pfu/m L)100μL，将铜网有膜的一面置于噬菌体液滴上，10min后取下，在空气中自然干燥2～3min。然后在铜网上滴一滴2％的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色，10min后取下，在空气中干燥10～15min，用电子显微镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照，得图2。
由图2的电镜照片可看出，透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约72nm，有一个长约200nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。
实施例3：噬菌体基因组测序
通过对单株噬菌体的富集培养后，在4℃条件下8000g离心15分钟，加入10％PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去处氯仿层和PEG层后，加入限制性核酸内切酶消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30min，最后将透析好的噬菌体送基因测序公司进行全基因组测序，测序结果如SEQ ID No.1所示。
实施例4：抗胍类消毒剂(聚六亚甲基胍)实验
取100mL噬菌体液，取1mL铺双平板测得初始效价为3.31×1010pfu/mL，加入10mL10％的聚六亚甲基胍，混匀，静止2h后，取1mL铺双平板测得效价为3.12×1010pfu/mL，可以判断噬菌体RDP-VA-22022可以有效耐受聚六亚甲基胍，在实际的水产养殖生产过程中噬菌体RDP-VA-22022可以与胍类消毒剂同时使用。
实施例5：最佳感染复数实验
按照感染复数为1：1、1：10、10：1、100：1、1000：1的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃140rpm振荡培养7h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价，所得结果如表2所示。由表2可知，噬菌体RDP-VA-22022最佳感染复数为10：1，此时噬菌体RDP-VA-22022的效价为1012pfu/mL。
表2最佳感染复数的测定结果
实施例6：噬菌体对溶藻弧菌VA22022生长曲线的作用图
在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD 600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养9h的宿主菌悬液以3％的比例接种到100mL LB培养基中，以最佳感染复数，加入噬菌体增殖液，同时以不加噬菌体的作为对照组，做3组平行对照，结果取其平均值，得图3。
由图3可知，对照组未加入噬菌体的宿主，随着宿主的增值，其OD600逐渐增加，在10h基本达到平衡，而实验组中加入噬菌体的宿主，在前1h，噬菌体处于对宿主的吸附、侵染阶段，对照组与实验组OD600增加程度相近，随着噬菌体的数量的指数增加，在2h后，噬菌体裂解宿主，对比对照组，实验组OD600提升更小一些，但随着时间的延长，其OD600逐渐增大。
可见，溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022加入到宿主菌VA22022菌悬液中，作用1h后即出现一定的裂解效果，与对照组相比，未加入噬菌体的宿主OD600增加明显，说明该噬菌体对宿主有较强的裂解能力，能够持续的对宿主菌进行裂解。
由于前3h，噬菌体处于对宿主菌的吸附、侵染阶段，只有少部分噬菌体开始裂解宿主，因此，其裂解宿主的量远远小于宿主的增长量，因此，OD600在前2h内，依旧保持一定的上升趋势，伴随着噬菌体数量的指数增加，在3h后，其裂解宿主数量大于宿主的增殖速度，所以OD600值开始逐渐降低，混合菌液达最澄清。持续作用10h后，混合菌液出现返浊，原敏感菌被噬菌体裂解，被突变的耐受菌所取代的一种菌群交替。因此，为获得高效价的噬菌体，应控制混合菌液在达到最高清晰度至返浊现象开始之前这一时间范围内，从而避免对噬菌体效价的影响。
实施例7：裂解率实验
无菌条件下，分别取1mL样品和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)，37℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10-1～10-3个梯度，每个梯度取100μL涂布于2216E琼脂平板上，置于37℃，培养24小时，每个梯度重复两次。同时取1mL生理盐水和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)作为空白对照，重复以上步骤。选取30～300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。噬菌体裂解率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％。
经计算得，本实验中噬菌体RDP-VA-22022的裂解率达98.5％，对宿主有较好的裂解效果，适合在养殖过程中使用，减少抗生素的滥用，高效可靠的治疗溶藻弧菌引起的水产动物疾病，改善水体环境，为水产养殖用药提供一种健康安全的新途径。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一株对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45396。
2.根据权利要求1所述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体RDP-VA-22022有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径72nm，有一个长200nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。
3.一种根据权利要求1或2所述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体在制备预防或治疗溶藻弧菌感染引起的疾病的药物中的应用。
4.一种根据权利要求1或2所述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体在制备预防或治疗溶藻弧菌感染引起的疾病的环境消毒剂中的应用。
5.一种根据权利要求1或2所述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体在制备预防或治疗溶藻弧菌感染引起的疾病的水产饲料添加剂中的应用。
6.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022。
7.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的对胍类消毒剂具有耐受性的溶藻弧菌噬菌体或权利要求6所述的噬菌体组合物。
8.根据权利要求7所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂还包括药学上可接受的辅料，其剂型为粉剂、颗粒剂、冻干剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或凝胶剂。
9.一种环境消毒剂，其特征在于，包括权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体RDP-VA-22022或权利要求6所述的噬菌体组合物。
10.根据权利要求9所述的环境消毒剂，其特征在于，所述环境消毒剂还包括胍类消毒剂。
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