CN113621584B - 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用 - Google Patents

一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用，所述金黄色葡萄球菌噬菌体s107已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)s107，保藏编号为CCTCC NO：M 2021125，保藏日期为2021年1月21日，地址：中国武汉武汉大学。噬菌体s107效价高，达到2.31×1010PFU/mL；pH稳定性好，温度稳定性好，裂解谱宽，对9株金黄色葡萄球菌有裂解能力，其中这9株金黄色葡萄球菌具有一定的耐药性，对大肠杆菌无裂解能力；具有针对金黄色葡萄球菌的特异性裂解谱，裂解能力强；金黄色葡萄球菌噬菌体s107能够用于制备治疗金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳房炎等疾病。

Description

一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此食品常常受到金黄色葡萄球菌的污染，特别是乳制品、速冻食品和生鲜肉类等更容易受到污染。
现有技术中对于金黄色葡萄球菌的防治主要采取抗生素治疗，由于抗生素的滥用带来的一些不好的影响，人们开始寻找抗生素的替代品，这其中噬菌体具有很大的优势，如特异性强，只针对特定的病原菌，而不破坏正常的微生态平衡，增殖能力强，副作用小等，使得噬菌体具有非常广阔的应用前景。现有技术中已经公开了一些金黄色葡萄球菌噬菌体，但是这些噬菌体很多存在宿主谱窄、温度和pH稳定性差等局限。
发明内容
本发明的目的在于提供一株金黄色葡萄球菌噬菌体s107，该噬菌体为宽谱型噬菌体，能够有效抑制多株金黄色葡萄球菌，且能够裂解金黄色葡萄球菌的耐药菌株。
本发明以金黄色葡萄球菌为宿主分离出一株效价高、裂解谱宽、温度和pH稳定性好、裂解能力强的噬菌体，并对其生理特性进行研究并进行分类鉴定和基因组测序。
本发明的第二目的在于提供金黄色葡萄球菌噬菌体s107在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一株金黄色葡萄球菌噬菌体s107，分离自山东省奶牛乳房炎送检奶样中分离得到的金黄色葡萄球菌（107）；
所述金黄色葡萄球菌噬菌体s107已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：金黄色葡萄球菌噬菌体（Staphylococcusaureusphage）s107，保藏编号为CCTCCNO：M2021125，保藏日期为2021年1月21日，地址：中国，武汉，武汉大学。
在本发明中，所述噬菌体s107具有不收缩、长而灵活的尾巴，属于虹吸管病毒科，s107的头长、头宽和尾巴长度分别为100.4nm、60.208nm和277.106nm。
在本发明的第二方面，提供金黄色葡萄球菌噬菌体s107在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
（1）噬菌体s107效价高，达到2.31×1010PFU/mL；
（2）pH稳定性好，对酸碱均有一定的耐受力，pH为7.4时，噬菌体活性最强，噬菌体s107的pH稳定性范围为3-11；
（3）温度稳定性好，噬菌体s107在-20~37℃活性基本稳定，效价维持在85-90%左右；
（4）裂解谱宽，通过点板法对54株临床分离细菌进行裂解试验，噬菌体s107对9株金黄色葡萄球菌有裂解能力，9株金黄色葡萄球菌分别为S. Aureus 160、S.Aureus 111、S.Aureus 688、S.Aureus 107、S. Aureus 218a、S.Aureus 683、S. Aureus 659、S.AureusJS-1和S. Aureus JS-2；其中S.Aureus 160、S. Aureus 107和S.Aureus 659为对氨苄西林和红霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌；S.Aureus 111为对红霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌；S. Aureus218a、S.Aureus 688和S. Aureus 683为对氨苄西林具有耐药性的金黄色葡萄球菌；对大肠杆菌无裂解能力；具有针对金黄色葡萄球菌的特异性裂解谱。
（5）裂解能力强，当感染复数（Multiplicityof infection，MOI）为0.1时，OD600吸光值已降低42%，噬菌体s107的最佳感染复数为0.1，s107噬菌体的敏感性为高度易感。
其中当MOI为1、0 .1、0 .01、和0 .001时，对金黄色葡萄球菌的裂解能力都很强，当MOI为0.1和0.01时，对金黄色葡萄球菌的裂解能力最强，可持续整个细菌的生长周期。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为噬菌体s107的噬菌斑形态图；
图2为噬菌体s107的透射电镜形态图；
图3为噬菌体s107的基因组图谱；
图4为噬菌体s107的裂解能力测定结果；
图5为噬菌体s107的裂解动力学测定结果；
图6为噬菌体s107的温度稳定性结果；
图7为噬菌体s107的紫外线稳定性结果；
图8为噬菌体s107的pH稳定性结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种实施方式中，提供了一株金黄色葡萄球菌噬菌体s107，分离自山东省奶牛乳房炎送检奶样中分离得到的金黄色葡萄球菌（107）；
所述金黄色葡萄球菌噬菌体s107已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：金黄色葡萄球菌噬菌体（Staphylococcusaureusphage）s107，保藏编号为CCTCCNO：M2021125，保藏日期为2021年1月21日，地址：中国，武汉，武汉大学。
在本发明中，作为实施方式之一，所述噬菌体s107具有不收缩、长而灵活的尾巴，属于虹吸管病毒科，s107的头长、头宽和尾巴长度分别为100.4nm、60.208nm和277.106nm。
在本发明中，作为实施方式之一，噬菌体s107进行金黄色葡萄球菌裂解时，效价达到2.31×1010PFU/mL；
在本发明中，作为实施方式之一，噬菌体s107，对金黄色葡萄球菌有较宽的裂解谱，裂解谱如表1所示；
在本发明中，作为实施方式之一，提供一种试剂，含有上述金黄色葡萄球菌噬菌体s107；进一步地，所述试剂还包含载体。
本发明公开的噬菌体s107效价高，pH和温度稳定性好，裂解谱宽，具有针对金黄色葡萄球菌的特异性裂解谱，且裂解能力强。
本发明的一种实施方式中，提供了金黄色葡萄球菌噬菌体s107在抑制金黄色葡萄球菌中的应用；
在本发明中，作为实施方式之一，提供一种噬菌体s107用于制备治疗金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳房炎等疾病的试剂中的应用。
在本发明中，作为实施方式之一，提供一种噬菌体s107用于制备杀灭空间环境中金黄色葡萄球菌试剂中的应用。
在本发明中，作为实施方式之一，提供一种噬菌体s107用于制备杀灭畜禽养殖空间环境内金黄色葡萄球菌的消毒剂或清洁剂中的应用。
在本发明中，作为实施方式之一，提供一种杀灭空间环境中金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括向空间环境中喷施上述金黄色葡萄球菌噬菌体s107或上述试剂。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1噬菌体的分离制备及纯化培养
1.1、菌株来源
宿主菌来自于山东省奶牛乳房炎送检奶样中分离得到的金黄色葡萄球菌（107）；
1.2、污水来源：
曲阜某检出金黄色葡萄球菌奶牛场周边粪污水及挤奶池污水混样；
1.3、主要试剂：
LB肉汤、LB半固体培养基、LB固体培养基、SM缓存液；
主要仪器：生物安全柜、电热恒温培养箱、恒温摇床、低温高速离心机、JEM-2100Plus透射电子显微镜、动态酶标仪。
2、方法
2.1、噬菌体的富集
将采集到的混合污水12000 rpm离心15min去除杂质，用注射器吸取上清液。如采集到的污水中含有大量土壤、粪便等固体物质，应先加入相同体积的无菌LB肉汤，置于37℃，180r/min 震荡过夜。再进行上述操作。分离得到的上清液，经0.22μm滤器过滤除菌，4℃备用。
以金黄色葡萄球菌（107）为宿主菌分离噬菌体。取15 mL上清滤液和1 mL处于对数生长期的宿主菌（金黄色葡萄球菌107）加入到15 mL无菌LB肉汤中，充分混匀。37℃，180r/min培养24h。12000rpm，离心5min，取上清，0.22μm滤器过滤除菌。
2.2、双层平板法分离
将宿主菌接种到高压灭菌后冷却至55℃的半固体LB培养基，充分混合均匀。再快速倾倒于已冷却的固体LB培养基表面，静置凝固。用点板的方式，将滤液均匀地滴在制备好的双层平板上，每滴8-10 μl，静置片刻，再于37℃恒温培养箱中倒置培养12 h。
2.3、噬菌体的纯化
观察上述培养的双层平板，如若有边缘清晰，形态规则，透明的圆形斑块（噬菌斑）出现，则用无菌针头挑取噬菌斑所在的上层培养基，加入含1 mL无菌SM缓存液的EP管中，4℃保存过夜。若无噬菌斑出现，再次采集合适的样品，重新分离。
将含初分噬菌斑的SM缓存液经0.22 μm滤器过滤，滤液连续10倍梯度稀释至10-10。按上述操作制备好相应病原菌的双层平板，吸取每个梯度浓度噬菌体液100 μl，滴加至平板表面，静置片刻，用一次性涂布棒均匀涂布至完全吸收。37℃培养12 h。再次挑选大小形态相同，噬斑透亮的噬菌斑，置于SM缓存液中，4℃过夜。多次重复上述操作，即可得到纯化的噬菌体。纯化的噬菌体液中可加入20-30％甘油，放置-20℃保藏。
通过双层平板法以奶牛乳房炎的分离菌金黄色葡萄球菌107为宿主菌，从奶牛场周遭污水中分离出来的噬菌体命名为s107。经双层平板法多次分离纯化，在双层平板上可观察到形状规则，大小均匀，边缘清晰的噬菌斑。如图1所示。
2.4、噬菌体电镜观察
取纯化后的噬菌体100 μl（106PFU/mL）滴加到干净的膜上，取铜网正面向上放入噬菌体液滴中，静置20 min取出铜网自然吸收20 s，用滤纸吸去多余液体。用200μl生理盐水洗涤并用吸水纸轻轻吸去液滴。
正面向上放入醋酸铀染液中染色2 min，取出后迅速用吸水纸吸取残留的染液，并用200 μl生理盐水洗涤，吸去液滴。接着放入另1滴醋酸铀染液中复染2 min，取出，吸去残留染液，干燥后置于透射电镜观察。
纯化的噬菌体负染后经透射电镜观察显示，s107具有不收缩、长而灵活的尾巴，属于虹吸管病毒科。s107的头长、头宽和尾巴长度分别为100.4nm、60.208nm和277.106nm，如图2所示。
2.6、噬菌体的基因组测序
为了了解s107噬菌体的基因组特征，我们测定了s107的全基因组序列。基因组长度为44644 bp；噬菌体s107的基因组图谱如图3所示。
实施例2
2.7、噬菌体效价测定
将纯化好的噬菌体连续10倍梯度稀释，每个梯度浓度取100 μl，按2.2中方法涂布双层平板，选择合适浓度梯度平板，计算噬菌斑个数。每个浓度梯度做三组重复，最终取平均值计算噬菌体效价。
噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑平均数×稀释倍数×10
将纯化后的噬菌体连续10倍稀释，通过双层平板法计算各浓度梯度噬菌斑个数。经多次平行试验后，得出s107噬菌体效价为2.31×1010PFU/mL。
实施例3
2.8、噬菌体的裂解能力
用微孔板噬菌体毒力试验评价噬菌体对宿主的溶毒活性，即裂解能力。将宿主细菌培养至对数生长期（约1×108CFU/mL），使用肉汤进行稀释，使最终接种细菌浓度为1×106CFU/mL。将噬菌体液连续10倍稀释，每个稀释浓度与宿主菌各100 μl共同接种到96微孔板中，感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000。37℃空气环境中培养6-10 h。目视检查微孔的浑浊度，并在OD600测其吸光值，记录使细菌完全溶解的最高稀释值。
噬菌体-宿主试验的MOI计算方法：每孔噬菌体数/每孔细菌数。噬菌体的敏感性分为：极敏感（10−6≤MOI<10−2）；高度易感：（0.01≤MOI<1）；中度易感：（1≤MOI<10）；和最低限度敏感：（10≤MOI<100）。
通过对微孔浑浊度的观察，发现s107噬菌体在浓度为104PFU/mL时，微孔清亮无明显浊度。同时测其吸光值，可发现当MOI为0.1（s107浓度为104PFU/mL，宿主菌浓度为105CFU/mL）时，OD600吸光值已降低42%。结合两结果可认定s107噬菌体的最佳感染复数为0.1，s107噬菌体的敏感性为高度易感。如图4所示，据此，可根据环境等样品中金黄色葡萄球菌含量，选择相应浓度的该噬菌体作为药物、环境控制剂进行应用。
实施例4
2.9、噬菌体裂解动力学
通过绘制细菌生长抑制曲线的方法，进一步评估噬菌体对宿主菌的动态感染。将初始为108PFU/mL的噬菌体储存液连续10倍稀释，并吸取100μl加入96孔微板中，每孔同时加入100 μl已稀释好的宿主菌悬浮液（106CFU/mL），此时最终MOIs分别为0.01、0.1、1、10、100和1000。同时设立未处理的对照组，只含有细菌的对照孔以及仅包含LB肉汤的空白对照孔。微孔平板在37℃下孵育，并使用多模式酶标仪在24小时内，每1小时间隔动态读取吸光值（OD 600 nm），进行三组重复实验。
利用动态酶标仪监测并记录了s107噬菌体不同MOI时的裂解曲线，如图5所示。结果显示，所有MOI值在前5h均无明显变化，此时处于潜伏期。第6h之后，所有MOI值均对细菌生长出现抑制作用。其中当MOI为0.1和0.01时，对细菌的裂解能力最强，可持续整个细菌的生长周期。
实施例5
2.10、噬菌体的宿主范围测定
使用点板的方法，测定噬菌体对不同细菌的裂解能力。分别活化15株大肠杆菌和39株金黄色葡萄球菌，各取100 μl菌液倾倒双层板，待平板凝固后，取噬菌体液5~10 μl 滴加到平板表面。静置一段时间后，放入37℃恒温干燥培养箱中过夜培养。观察噬菌斑的形成情况，得到噬菌体对不同细菌的裂解情况。
通过点板法对54株临床分离细菌进行裂解试验，其中15株大肠杆菌，39株金黄色葡萄球菌。由表1所示，噬菌体s107对部分金黄色葡萄球菌有裂解能力，裂解率为23.08%。对大肠杆菌无裂解能力。
表1 噬菌体s107对54株临床分离细菌的裂解情况
菌株 敏感性 菌株来源 菌株 敏感性 菌株来源
S. Aureus 160 + 乳样分离 S. Aureus 6.18 - 乳样分离
S. Aureus 111 + 乳样分离 S. Aureus 113 - 乳样分离
S. Aureus 688 + 乳样分离 S. Aureus 125 - 乳样分离
S. Aureus 107 + 乳样分离 S. Aureus 147 - 乳样分离
S. Aureus 218a + 乳样分离 S. Aureus 182 - 乳样分离
S. Aureus 683 + 乳样分离 S. Aureus 85 - 乳样分离
S. Aureus 659 + 乳样分离 S. Aureus 84 - 乳样分离
S. Aureus JS-1 + 乳样分离 S. Aureus 15 - 乳样分离
S. Aureus JS-2 + 乳样分离 S. Aureus 681 - 乳样分离
S. Aureus 222 - 乳样分离 S. Aureus 394 - 乳样分离
S. Aureus 60 - 乳样分离 S. Aureus 131 - 乳样分离
S. Aureus 124 - 乳样分离 S. Aureus 177 - 乳样分离
S. Aureus 148 - 乳样分离 Escherichia colis 11 - 乳样分离
S. Aureus 572 - 乳样分离 Escherichia colis 12 - 环境分离
S. Aureus 686 - 乳样分离 Escherichia colis 14 - 环境分离
S. Aureus 180 - 乳样分离 Etec - 1 - 乳样分离
S. Aureus 23 - 乳样分离 Etec - 2 - 乳样分离
S. Aureus 679 - 乳样分离 E.coli 1212 - 乳样分离
S. Aureus 687 - 乳样分离 Escherichia colis 1 - 环境分离
S. Aureus 477 - 乳样分离 Escherichia colis 2 - 环境分离
S. Aureus 685 - 乳样分离 Escherichia colis 5 - 环境分离
S. Aureus 6.30 - 乳样分离 Escherichia colis 6 - 乳样分离
S. Aureus 228 - 乳样分离 Escherichia colis 9 - 乳样分离
S. Aureus 573 - 乳样分离 E.coli 1210-1 - 环境分离
S. Aureus GS-JY - 乳样分离 E.coli 1210-3 - 环境分离
S. Aureus 133 - 乳样分离 E.coli 1210-5 - 环境分离
S. Aureus B11 - 乳样分离 E.coli 1210-6 - 环境分离
实施例6
2.11、噬菌体的热稳定性
将初始浓度为108PFU/mL的噬菌体储存液，分装到2 mL的EP管中，分别置于-20℃、4℃、25℃、37℃、46℃、54℃、60℃、70℃、90℃温度中处理1 h。处理后的噬菌体液通过双层平板法测定效价。检测噬菌体滴度变化，评价噬菌体热稳定性。每个处理组设三组重复。
s107噬菌体的热稳定性试验结果（图6）表明，噬菌体s107在-20~37℃，活性基本稳定，效价维持在85-90%左右。当温度逐渐升高时，活性明显降低。当温度升高至60℃时，噬菌体效价降低至30%。当温度达到70℃时，噬菌体完全失活。
实施例7
2.12、噬菌体的紫外线稳定性
将初始浓度为108PFU/mL的噬菌体储存液，分装到2 mL的EP管中。分别在紫外线环境中处理10 min、20 min、30 min，双层平板法测定处理后噬菌体的效价，评价噬菌体紫外线稳定性。每个处理组设三组重复。
结果如图7所示。噬菌体对紫外线的抵抗能力较弱，将噬菌体s107暴露在紫外线条件下10min，活性即下降至70%。20min时，噬菌体一半失去活性。30min时，噬菌体完全失活。
实施例8
2.13、噬菌体的pH稳定性
用H2SO4和NaOH调节SM缓冲液至pH为3、5、6、7、8、11、13。将噬菌体储存液（108PFU/mL）与不同pH缓冲液等体积混合，37℃静置孵育1 h，双层平板法测定处理后噬菌体的效价，评价噬菌体酸碱稳定性、每个处理组设三组重复。
s107噬菌体的pH稳定性试验结果，如图8所示。从结果可以看出，s107对酸碱均有一定的耐受力，但对强碱的耐受程度不如强酸。s107经不同pH处理1h后，可见在pH为7.4时，噬菌体活性最强。当pH在3、5、6、8.5、11时，对噬菌体的活性影响不大，效价降低20%。当pH为13时，噬菌体效价降低至40%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株金黄色葡萄球菌噬菌体（Staphylococcus aureus phage）s107，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体s107已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：金黄色葡萄球菌噬菌体s107，保藏编号为CCTCC NO：M 2021125，保藏日期为2021年1月21日，地址：中国，武汉，武汉大学。
2.一种试剂，其特征在于，含有权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体s107。
3.如权利要求2所示的试剂，其特征在于，所述试剂还包含载体。
4.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体s107用于制备治疗金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳房炎的试剂中的应用。
5.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体s107用于制备杀灭空间环境中金黄色葡萄球菌试剂的应用。
6.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体s107用于制备杀灭畜禽养殖空间环境内金黄色葡萄球菌的消毒剂或清洁剂中的应用。
7.一种杀灭空间环境中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述方法包括向空间环境中喷施权利要求1所述金黄色葡萄球菌噬菌体s107或权利要求2所述试剂。
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