CN109251898A - 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其用途 - Google Patents

一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01，已于2018年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Staphylococcus aureus phage VB_SavM_JYL01，保藏编号为：CCTCC M 2018154；金黄色葡萄球菌噬菌体具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解金黄色葡萄球菌，也可以裂解一些表皮葡萄球菌，既可以裂解宿主菌206，也可以裂解从环境中或者发病动物粪便中分离的葡萄球菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品。

Description

一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其用途
技术领域
本发明公开了一株金黄色葡萄球菌噬菌体，同时还提供了其分离与纯化方法以及一般生物学特性，本发明属于生物工程技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种普遍存在的病原细菌，可以引起皮肤脓肿、伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、肺炎、以及中毒性休克综合征等多种局部和全身性感染疾病。随着抗生素的大量使用和滥用，金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性逐渐增强，使得该菌引起感染的治疗变得越来越困难，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现，引起了医学界的广泛关注。目前，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌最有效的抗生素是万古霉素，但是，现在在临床上已经分离到对万古霉素不敏感的金黄色葡萄球菌。因此，迫切需要研发新型药物，以控制耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染。
噬菌体是一种细菌病毒，可以通过尾丝蛋白或其他吸附相关的蛋白与宿主菌特异性的结合，然后将遗传物质注入到宿主菌内；首先阻断和接管宿主菌的所有代谢活动，并利用宿主菌的原料合成自身的基因组及结构蛋白；在噬菌体颗粒组装完成之后会合成裂解酶，从宿主菌内部将其细胞壁水解，最终使细菌发生崩解，释放出子代的噬菌体颗粒，然后开始下一轮的感染周期。近些年，随着耐药菌株的不断出现，抗生素治疗的效果越来越差，因此，噬菌体疗法又重新受到了广大研究人员的重视。据分析在地球上约有 1031
数量的噬菌体，种类大约有106，是一个非常丰富的基因库，因此，噬菌体又是一个很好的遗传学研究对象。另外，在噬菌体疗法研究中延伸出了一个新的方向，即噬菌体裂解酶作为治疗制剂的研究。裂解酶由噬菌体基因组编码、在噬菌体感染细菌的后期表达，可以水解细菌的细胞壁，从而引起细菌的死亡。已有研究表明来自噬菌体的裂解酶可以高效的杀灭细菌，在细菌外部与之相作用时，表现为更快速的裂解活性。近几年，噬菌体和裂解酶作为治疗制剂的研究越来越多。与抗生素相比，二者最大的特点是：特异性，不影响正常菌群；与抗生素作用机制不同，对耐药菌株同样有效；高效性，可以快速的杀灭特定病原菌。目前，国内关于金黄色葡萄球菌噬菌体研究极少。
发明内容
本发明公开一株金黄色葡萄菌噬菌体，命名为VB_SavM_JYL01；该噬菌体具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解金黄色葡萄球菌，也可以裂解一些表皮葡萄球菌，既可以裂解宿主菌206，也可以裂解从环境中或者发病动物粪便中分离的葡萄球菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品。
本发明公开的一株金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01，所述的菌株已于2018年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Staphylococcus aureus phage VB_SavM_JYL01，保藏编号为：CCTCC M 2018154。
本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01在制备由葡萄球菌引起的感染性疾病药物中的用途
本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01作为有效成分在制备杀灭空间环境中葡萄球菌药物中的应用。
本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01作为有效成分在制备杀灭禽畜体表和体内葡萄球菌药物中的应用。
本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01作为有效成分在制备用于杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的葡萄球菌的饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂、饮用水、消毒剂或清洁剂中的用途。
本发明一株金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01，对金黄色葡萄球菌具有较宽的裂解谱，同时对一些表皮葡萄球菌有裂解作用，裂解谱如表1所示。
本发明的积极效果在于：提供了一株金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01，具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解金黄色葡萄球菌，也可以裂解一些表皮葡萄球菌，既可以裂解宿主菌206，也可以裂解从环境中或者发病动物粪便中分离的葡萄球菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品。
附图说明
图1. 噬菌体VB_SavM_JYL01噬菌斑照片；
图2. 噬菌体VB_SavM_JYL01的透射电镜照片；
图3. 噬菌体VB_SavM_JYL01的最佳MOI图；
图4.噬菌体VB_SavM_JYL01的一步生长曲线图。
具体实施方式如下：
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另
有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本发明的实施方案中，提供了对葡萄球菌具有杀伤活性的新型噬菌体。
噬菌体是能够感染特定细菌并抑制细菌生长的细菌特异性病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。
本发明的噬菌体分离自污水的新型噬菌体，该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在TSB琼脂培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-2mm；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA（dsDNA）。已于2018年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2018154，地址：中国武汉，武汉大学。
实施例1
噬菌体分离及制备
噬菌体的分离过程在下文中详细描述。本发明中的粪液污水样品采自长春市火烧李，宿主菌为金黄色葡萄球菌206。采集污水，用纱布过滤，6000r/min离心10min，取上清，用处理过的污水代替ddH2O配制TSB培养基（100mL）；培养基内加入1mL过夜培养的宿主细菌206，37℃培养10-12h；取培养物1mL，12000r/min离心5min，上清用0.22μm滤器过滤形成噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于空斑测试，以检查是否包括能够裂解金黄色葡萄球菌206的噬菌体。
空斑测试：以2%的比例在5mlTSB液体培养基中接种金黄色葡萄球菌206，37℃振荡培养过夜。取0.1ml上述制备的细菌培养液滴于平板正中央，用涂棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取上述噬菌体原液20ul滴于其中一个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。
如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。取噬菌体原液100mL，进行一系列的10倍稀释。取10-2、10-4和10-6稀释液各0.1mL与宿主菌培养物0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约7mL ,45℃,TSB半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入1.5% TSB琼脂培养基平板上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养8h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
实施例2
噬菌体扩增和纯化
在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌的移液器的枪头挑取直径较大的、比较圆且透亮的单个噬菌斑，接种于5 ml BHI液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液200μL，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，12000rpm，4℃ 离心10min，取上清；重复双层平板实验，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加300μL噬菌体裂解液（以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例）。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入800mL TSB液体培养基，再加入CaCl 2 母液至终浓度1.25mM，37℃摇振培养6 ~ 8h，12000rpm，4℃ 离心10min，取上清，即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入RNase A、DNaseⅠ至终浓度均为1μg/mL，室温放置30min；加入NaCl至终浓度为1mol/L，混合均匀后，冰浴1-2h；4℃ 离心机，8000r/min离心15-20min后收集上清；按每100ml 10g的量加入PEG-8000，轻轻搅拌使其溶解，冰浴2h以上（最好过夜），使噬菌体在PEG-8000作用下形成沉淀；4℃ 离心机，12000r/min离心10-20min，回收沉淀的噬菌体颗粒，加2mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃ ，5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。
CsCl等密度梯度离心纯化: 按表制备CsCl梯度液，按照从高密度到低密度的顺序，在5mL半透明聚丙烯酰胺高速离心管中依次加入各梯度液1mL；将噬菌体浓缩液700μL缓慢加入到CsCl梯度液的上面，放到4℃高速离心机中，35000r/min水平离心3h；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层蓝色带，用细针头从带侧面插入，小心吸取；将样品置于透析袋中，用10mM Tris-HCl，PH为7.4，100mM MgCl 2 缓冲液进行透析，2L一次（10-14kd）；最终将样品吸出，测定噬菌体效价。
采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取
相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1 mL与宿主菌液0.1 mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10 h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在1.5%的TSB琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为2-3mm。
将纯化的噬菌体自命名为VB_SavM_JYL01，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏号：CCTCC M 2018154，分类命名：金黄色葡萄球菌噬菌体（Staphylococcus aureus phage VB_SavM_JYL01），保藏日期为2018年3月25日。
实施例3
噬菌体VB_SavM_JYL01透射电镜观察
取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10μL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min, 用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为90nm，尾长约为190nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，VB_SavM_JYL01属于肌尾病毒科（Myoviridae）。
实施例4
噬菌体VB_SavM_JYL01的最佳MOI测定
最佳MOI测定：将培养至对数期的菌液调到浓度为107cfu/mL，然后按照噬菌体/细菌的比例为0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10将噬菌体与菌进行混合，转接到BHI液体培养基中，在37℃振荡培养8h。将培养液在4℃进行10000g离心15min，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤得到噬菌体增值液，利用双层平板法对增值液进行滴度测定，低度最高的噬菌体/细菌比例即为最佳MOI，结果如图3所示。
实施例5
噬菌体VB_SavM_JYL01的一步生长曲线测定
一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照最佳MOI的比例进行混合，在4℃放置15min，用新鲜BHI液体培养基将沉淀悬起，将悬液雨37℃振荡培养，每隔10min取一次样品测定噬菌体的滴度，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图4所示。
实施例6
噬菌体VB_SavM_JYL01宿主谱分析
将实施例2获得的噬菌体VB_SavM_JYL01效价调整为10 8 pfu/mL备用。试验选择多株金葡菌和表葡菌为对象，对噬菌体VB_SavM_JYL01的宿主谱进行分析，具体操作如下：
空斑试验测定：分别取待测菌株的过夜培养物0.1mL，滴加在1.5% TSB培养基平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。取10μL噬菌体AVP滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养箱培养12 ~ 16h，观察结果，如有空斑产生则记为“+”，否则为“-”，结果如表5所示。
噬斑试验测定：取噬菌体原液1mL，进行一系列的10倍稀释。取10-2、10-4和10-6稀释液各0.1mL分别与待测菌株的过夜培养物0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约7mL,45℃,TSB半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入1.5% TSB琼脂培养基平板上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养8h后观察结果，有噬斑产生则记为“+”，否则为“-”，结果如表1所示。
表1. 噬菌体VB_SavM_JYL01宿主普分析
结论：上表所有测试的50菌株中，有4株表皮葡萄球菌，其余46株全部为金黄色葡萄球菌由表1可见，在空斑试验中，噬菌体VB_SavM_JYL01都能使得50株测试菌株产生空斑，而在噬斑试验中，噬菌体VB_SavM_JYL01能使得34株测试菌株产生噬斑，其中包括4株表皮葡萄球菌，6株金黄色葡萄球菌标准株，裂解率为68%，说明该噬菌体有较宽裂解谱的特性。

Claims (5)

1.一株金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01，所述的菌株已于2018年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为 Staphylococcus aureus phage VB_SavM_JYL01，保藏编号为：CCTCC M 2018154。
2.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01在制备由葡萄球菌引起的感染性疾病药物中的用途。
3.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01作为有效成分在制备杀灭空间环境中葡萄球菌药物中的应用。
4.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01作为有效成分在制备杀灭禽畜体表和体内葡萄球菌药物中的应用。
5.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体VB_SavM_JYL01作为有效成分在制备用于杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的葡萄球菌的饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂、饮用水、消毒剂或清洁剂中的用途。
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