CN107779439A - 新的葡萄球菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体提供了新的葡萄球菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用，所述噬菌体为金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1、保藏编号为CCTCC No：M2016284；金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2、保藏编号为CCTCC No：M2016285；金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3、保藏编号为CCTCC No：M2016286；金黄色葡萄球菌噬菌体J2‑1P1、保藏编号为CCTCC No：M2016287；或金黄色葡萄球菌噬菌体J2‑1P2、保藏编号为CCTCC No：M2016288。本发明所述噬菌体可以防治由各种葡萄球菌，尤其是金黄色葡萄球菌引起的人或动物细菌感染疾病，为开发新型抗菌制剂提供了优良的噬菌体资源，具有良好的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及新的葡萄球菌菌噬菌体性、其组合物以及它们的制备方法和应用。
背景技术
葡萄球菌属归属于杆菌纲(Bacilli),杆菌目(Bacillales),葡萄球菌科(Staphylococcaceae)。葡萄球菌广泛分布于空气，饲料，饮水，地面及物体表面。人及畜禽的皮肤，黏膜，肠道，呼吸道及乳腺中也有寄生，是引起诸多人畜细菌性疾病的主要致病菌。2004年，《伯吉系统细菌学手册》将本属细菌分为37种，许多种内还分为亚种。按其对兔血浆的凝固能力又可以分为凝固酶阳性菌和凝固酶阴性菌两大类。在诸多葡萄球菌中，以金黄色葡萄球菌对人畜的危害最大。金黄色葡萄球菌可引起人类局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染；在动物病害方面主要会引起家畜乳房炎，伤口和皮肤感染以及家禽的关节炎或是腹泻等疾病。除了金黄色葡萄球菌外，猪葡萄球菌，伪装中间葡萄球菌和中间葡萄球菌等其它凝固酶阳性葡萄球菌，主要在动物身上传播，为条件致病菌，常寄居于皮肤和黏膜上。当动物机体的抵抗力降低或皮肤，黏膜破损时，病菌便乘虚而入。猪葡萄球菌是引发小猪渗出性皮炎以及母猪子宫内膜炎的主要致病菌。伪中间葡萄球菌和中间葡萄球菌则可以导致猫犬类动物脓皮病、外耳道炎、伤口感染、尿道感染以及其他一些感染。近年来,成为人类(尤其是宠物饲养者)感染较常见的葡萄球菌，在人类身上也有诸多病例报道。凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)，包括表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，头葡萄球菌等30多种。通常认为CNS是人/动物体正常菌群之一，但近年来，各种CNS葡萄球菌的感染逐年增多，近年来临床和实验室检测结果表明证实CNS已经成为医院感染的主要病原菌之一，其耐药菌株日渐增多，造成诊治困难。医院凝固酶阴性葡萄球菌耐药比例可高达60％～70％，是导致人工瓣膜性心内膜炎、静脉导管感染、腹膜透析性腹膜炎、血管移植物感染和人工关节感染等病症的致病菌；在动物疾病方面，CNS也可以诱发奶牛乳房炎，仔猪油皮病等病害。由于耐药性的不断提高，对CNS的治疗也愈发困难。
面对葡萄球菌，传统的抗生素治疗存在诸多劣势：①葡萄球菌容易形成生物膜，而抗生素很难突破生物膜杀死致病菌；②葡萄球菌普遍具有多重抗药性，可选用的抗生素不多；③抗生素在养殖业上的滥用，不仅增强了葡萄球菌的耐药性，同时也对人类的食品安全造成了严重威胁。因此，目前亟需一种新型的抗菌物质取代或是辅助抗生素进行治疗。
噬菌体是一种通过与细菌细胞表面特异位点结合后杀灭特异性细菌的病毒，在地球上广泛存在。自从Frederik Tword于1915年首次发现噬菌体以来，越来越多的研究证明了噬菌体具有较高的抗菌活性和专一性，可防治耐药性细菌并防止损伤微生物群落。与抗生素治疗相比，其副作用极低且更加快速有效，不会抑制机体的自然免疫或引起变态反应，同时对人类或其他哺乳动物不具有侵染性及毒性。然而目前对噬菌体的研究仅集中于筛选及生物特性的探讨，对其应用方面鲜有报道。因此，筛选并应用合适的烈性噬菌体，是研发新型抗菌制剂的一条有效途径。
目前，关于金黄色葡萄球菌烈性噬菌体有大量文献报道。然而关于其它类葡萄球菌的噬菌体的报道则数量较少，仅有关于表皮葡萄球菌烈性噬菌体的报道，例如Melo,L.D.R.,等人公开了长尾噬菌体科的唯一成员表皮葡萄球菌噬菌体vB_SepS_SEP9的特征(Research in Microbiology,2014.165(8):p.679-685.)。但是目前还尚未有既能裂解金黄色葡萄球菌的同时也能裂解其它的葡萄球菌的烈性噬菌体的相关报道。目前，诸多人类和动物的病症并非仅有单一的金黄色葡萄球菌引发，而是由多种葡萄球菌共同引发的。例如仔猪油皮病的致病菌就有可能是由猪葡萄球菌，松鼠葡萄球菌和金黄色葡萄球菌共同引发；母猪子宫内膜炎的致病葡萄球菌则可能同时包括溶血葡萄球菌，表皮葡萄球菌，猪葡萄球菌等葡萄球菌；奶牛乳房炎则可能由金黄色葡萄球菌以及其他CNS类葡萄球菌共同引发。
因此开发新的具有广谱的能够裂解多种不同的金黄色葡萄球菌的噬菌体在实际应用中将更有优势，更加有利于金黄色葡萄球菌感染的预防和治疗。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供了可裂解不同葡萄球菌的金黄色葡萄球菌噬菌体以及它们的组合物，本发明噬菌体具有较强的裂解葡萄球菌，尤其是金黄色葡萄球菌MRSA的能力。本发明所述金黄色葡萄球菌噬菌体包括以下噬菌体：
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)、保藏编号为CCTCC No：M2016284，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)、保藏编号为CCTCC No：M2016285,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)、保藏编号为CCTCC No：M2016286，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)、保藏编号为CCTCC No：M2016287，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)、保藏编号为CCTCC No：M2016288，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)具有等轴衣壳、可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构；并在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性，在MOI＝100条件下培养6h，其效价为8.1×109pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcusaureus phage J1P2)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性，MOI＝0.1条件下培养6h，J1P2效价为1.89×108pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcusaureus phage J1P3)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性、MOI＝0.1条件下培养6h，其效价可达到4.6×108pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH3～pH10、37℃～60℃具有耐性、MOI＝0.1条件下培养6h，其效价可达到5.5×107pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)所述噬菌体具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性，MOI＝0.0001条件下培养6h，其效价为3.2×109pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcusaureus phage J1P1)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcusaureus phage J1P2)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcusaureus phage J1P3)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
本发明中所述主要结构蛋白是指在对噬菌体进行SDS-PAGE蛋白条带分析中，所测到的含量最高的蛋白即为主要结构蛋白；本发明以上所述噬菌体的主要结构蛋白为衣壳蛋白，其相对分子量均为55KDa
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcusaureus phage J1P1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcusaureus phage J1P2)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcusaureus phage J1P3)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcusaureus phage J1P1具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、或/和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列中至少一个核酸序列作为其基因组的一部分；作为示例性的说明，例如包括SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8；或它们中的任意两种核苷酸序列的组合；或具有SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcusaureus phage J1P2)具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列中至少一个核酸序列作为其基因组的一部分；作为示例性的说明，例如包括SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或它们中任意两种核苷酸序列的组合；或具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列中至少一个核酸序列作为其基因组的一部分；作为示例性的说明，例如包括SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或它们中任意两种核苷酸序列的组合；或具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列作为其基因组的一部分；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列中至少一个核酸序列作为其基因组的一部分；作为示例性的说明，例如包括SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或它们中任意两种核苷酸序列的组合；或具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
本发明中所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，J1P1可形成平均直径为1.5～2mm的噬菌斑(图1)；在电子显微镜下观察J1P1噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为200nm(图2)。J1P1噬菌体全基因组序列大小为140118bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，J1P1属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，且与NCBI上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新种噬菌体；基因组序列分析表明，J1P1噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因；噬菌体J1P1主要结构蛋白相对分子量为55kDa。
本发明中所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，J1P2可形成平均直径为1.5～2mm的噬菌斑(图1)；在电子显微镜下观察J1P2噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为90nm，尾部长约为200nm(图2)。J1P2噬菌体全基因组序列大小为140120bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，J1P2属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，且与NCBI上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新新种型噬菌体；基因组序列分析表明，J1P2噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因；噬菌体J1P2主要结构蛋白相对分子量为55kDa。
本发明中所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，J1P3可形成平均直径为1.5～2mm的噬菌斑(图1)；在电子显微镜下观察J1P3噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为200nm(图2)。J1P3噬菌体全基因组序列大小为140118bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，J1P3属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，且与NCBI上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新种噬菌体；基因组序列分析表明，J1P3噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因；噬菌体J1P3主要结构蛋白相对分子量为55kDa。
本发明中所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，J1P3可形成平均直径为1.5～2mm的噬菌斑(图1)；在电子显微镜下观察J2-1P1噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为80nm，尾部长约为250nm(图2)。J2-1P1噬菌体全基因组序列大小为140894bp,为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，J2-1P1属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，且与NCBI上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新种噬菌体；基因组序列分析表明，J2-1P1噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因；噬菌体J2-1P1主要结构蛋白相对分子量为55kDa。
本发明中所述金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌为J1宿主菌，于37℃下过夜培养，J2-1P2可形成平均直径为1.5～2mm的噬菌斑(图1)；在电子显微镜下观察J2-1P2噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为200nm(图2)。J2-1P2噬菌体全基因组序列大小为141821bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，J2-1P2属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，且与NCBI上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新种噬菌体；基因组序列分析表明，J2-1P2噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因；噬菌体J2-1P2主要结构蛋白相对分子量为55kDa。
本发明还进一步提供了金黄色葡萄球菌噬菌体的组合物，作为实施方案之一，所述组合物含有金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)、金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)、金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)、金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcusaureus phage J2-1P1)、金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phageJ2-1P2)中的三种或三种以上组合。
作为更进一步实施方案之一，所述组合物包括J1P1、J1P2和J1P3的组合，J1P1、J1P2和J2-1P1的组合，J1P1、J1P2和J2-1P2的组合，J1P1、J1P3和J2-1P1的组合，J1P1、J1P3和J2-1P2的组合，J1P1、J2-1P1和J2-1P2的组合,J1P2、J1P3和J2-1P1的组合，J1P2、J1P3和J2-1P2的组合,J1P2、J2-1P1和J2-1P2的组合，J1P3、J2-1P1和J2-1P2的组合，J1P1，J1P2，J1P3，和J2-1P1的组合；J1P1，J1P2，J1P3和J2-1P2的组合，J1P1，J1P2，J2-1P1和J2-1P2的组合，J1P1，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的组合,J1P2，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的组合或J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1，J2-1P2的组合。
本发明组合物中各噬菌体的量可以由本领域技术人员根据本发明公开内容及具体适用环境和本领域常识进行确定，作为实施方案之一，以单位体积中所含有各噬菌体的效价比计、所述J1P1、J1P2和J1P3的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P2和J2-1P1的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P2和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P3和J2-1P1的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P3和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P1、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P2、J1P3和J2-1P1的比例为1：1：1，所述J1P2、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P2、J1P3和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P3、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P1，J1P2，J1P3，和J2-1P1的比例为1：1：1：1；所述J1P1，J1P2，J1P3和J2-1P2的比例为1：1：1：1，所述J1P1，J1P2，J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1：1，所述J1P1，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1：1,所述J1P2，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1：1或所述J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的组合的比例为1：1：1：1：1。
作为实施方案之一，本发明还提供一种含有上述金黄色葡萄球菌噬菌体或金黄色葡萄球菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。本领域技术人员可以根据本发明公开内容和本领域常识来制备本发明含有上述金黄色葡萄球菌噬菌体或金黄色葡萄球菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
本发明提供一种上述的噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒在抗金黄色葡萄球菌(MRSA,MSSA,BORSA)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌、猪葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马胃葡萄球菌、小牛葡萄球菌、科氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌或缓慢葡萄球菌的应用。
作为实施方案之一，在无论使使用单一噬菌体或两种或两种以上噬菌体组合物进行细菌裂解时，所述噬菌体总有效工作效价为≧107pfu/ml。
作为实施方案之一，本发明还提供一种上述噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒用于制备治疗由葡萄球菌引发的仔猪渗出性皮炎，母猪子宫内膜炎疾病的药物中的应用。可用于预防和治疗由上述葡萄球菌属类细菌引发包括人类烧伤感染，仔猪渗出性皮炎，母猪子宫内膜炎在内的多种疾病。
本发明中所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2，是从中国南京江宁某养牛场牛粪中分离出的。
作为实施方案之一，所述方法包括：
将采集于江苏省南京市江宁区江南奶牛场堆积1昼夜的牛粪中的噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的来源样品，经0.9％NaCl溶液解吸附后，低速常温离心取上清液，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用滤膜过滤上清液。
噬菌体的分离：分别取上述过滤后上清液，加入TSB培养基中，同时加入噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养、然后取上述培养物离心、滤膜过滤上清液，备用。取噬菌体宿主菌对数期菌液加入、半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。
噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至SM缓冲液中震荡，进行梯度稀释，取稀释液分别加入对数期宿主菌，混合均匀静置后，加入半固体TSB培养基,立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置待其凝固，置于37℃温箱培养，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至SM缓冲液中，按照上述方式纯化多次，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有对数期宿主菌菌液的TSB培养基中，37℃条件下摇培。取培养物离心、滤膜过滤上清液，即为得到的纯化噬菌体溶液。
实验证明：本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2中任1株或是随机任意的组合对药物敏感性及耐药性金黄色葡萄球菌的裂解范围：例如含有J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1，J2-1P2的鸡尾酒(所含各噬菌体有效工作效价比例为1:1:1:1:1)可识别132株不同的金黄色葡萄球菌,其中包括MRSA 97株,MSSA31株以及BOASA 5株。还可识别46株其他葡萄球菌，其中包括表皮葡萄球菌7株，溶血葡萄球菌2株，木糖葡萄球菌4株，猪葡萄球菌5株，产色葡萄球菌2株，松鼠葡萄球菌5株，腐生葡萄球菌5株，马胃葡萄球菌4株，小牛葡萄球菌1株，科氏葡萄球菌6株，模仿葡萄球菌2株，阿尔莱特葡萄球菌2株，缓慢葡萄球菌1株。本发明的5株噬菌体具有较强的属内专一性，对10株大肠杆菌均无法识别，同时无法识别30株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株，非宿主菌包括停乳链球菌5株，无乳链球菌5株，副溶血弧菌5株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌5株，鲍曼不动杆菌5株。
与现有技术相比，本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2具有的优势包括：为严格的烈性噬菌体并可有效杀灭包括金黄色葡萄球菌在内的各种葡萄球菌；在较低浓度下对宿主菌依然具有较好的裂解能力；对正常微生物菌群无毒害作用；其DNA无法编码毒力基因。需重点申明的是，本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的5株葡萄球菌噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2可防治由葡萄球菌引起的细菌感染，为开发新型抗菌制剂提供了优良的菌种资源，具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1：实施施1中所得的5株噬菌体在多重耐药性金黄色葡萄球菌菌苔上产生的单一噬菌斑；
图2：实施例2中观察实施1所得的5株噬菌体透射电子显微镜下的形态特征；
图3：实施例6中检测实施施1中所得的5株噬菌体结构蛋白SDS-PAGE胶分析。
金黄色葡萄球菌噬菌体为金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureusphage J1P1)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编 430072；保藏日期为2016年5月26日、保藏编号CCTCC M2016284；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编 430072；保藏日期为2016年5月26日、保藏编号CCTCC M2016285；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编 430072；保藏日期为2016年5月26日、保藏编号CCTCC M2016286；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日、保藏编号CCTCC M2016287；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日、保藏编号CCTCC M2016288。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，
LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml；
LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml；
半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂7g，蒸馏水1000ml；
SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。
实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养
本发明中噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1和J2-1P2的来源样品采集于江苏省南京市江宁区江南奶牛场堆积1昼夜的牛粪中，经0.9％NaCl溶液解吸附24h后，低速常温离心取上清液，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。
噬菌体的分离：取10ml过滤后上清液，加入10ml 2倍TSB培养基中，同时加入1ml噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养16h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min,用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5ml噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5ml，40℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10ul，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。
噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1ml SM缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取102,104和106稀释液分别加入对数期宿主菌0.5ml，混合均匀静置15min后，加入5ml,40℃半固体TSB培养基,立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养16h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1ml SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1ml对数期宿主菌菌液的50ml TSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培16h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到金黄色葡萄球菌噬菌体为金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureusphage J1P1)、保藏编号为CCTCC No：M2016284，金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)、保藏编号为CCTCC No：M2016285,金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)、保藏编号为CCTCC No：M2016286，金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)、保藏编号为CCTCCNo：M2016287，金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)、保藏编号为CCTCC No：M2016288。上述各噬菌体的单一噬菌斑参见图1。
实施例2：噬菌体的电镜观察
分别取实施例1制得的各噬菌体培养物上清作电镜观察：取20μl样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：结果如图1所示，通过透射电镜可见在电子显微镜下观察J1P1噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为200nm，尾部的末端具有六条短棘；J1P2噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为90nm，尾部长约为200nm，尾部的末端具有六条短棘；J1P3噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为200nm，尾部的末端具有六条短棘；J2-1P1噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为80nm，尾部长约为250nm，尾部的末端具有六条短棘；J2-1P2噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为200nm，尾部的末端具有六条短棘。(参见图2)
实施例3：噬菌体基因组的提取与测序
分别取实施例1制得的各噬菌体100ml，加入终浓度1μg/ml的DNaseI，RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84g Nacl(终浓度1mol/L),溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％，即100ml加入10g),完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/ml，37℃反应30～60min。加入EDTA至终浓度20mmol/L(即1mlSM液加入40μl0.5mol/LEDTA),同时每1mlSM液中加入10ul 10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)具有SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有SEQID No.4所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)具有SEQID No.5所示的核苷酸序列。
实施例4：噬菌体基因组序列的特征序列
以实施例3测定的5株噬菌体的全基因组序列为基础。
J1P1、J1P2、J1P3、J2-1P2共有一条特征序列SEQ ID No.6，全长781bp，该段序列为除去J1P1、J1P2、J1P3、J2-1P2外所有现有发现的噬菌体所不含有的特征序列；
J1P1、J1P2、J1P3、J2-1P2共有一条特征序列SEQ ID No.7，全长225bp,该段序列为除去J1P1,J1P2,J1P3,J2-1P2外所有现有发现的噬菌体所不含有的特征序列；
J1P1,J1P2,J1P3,J2-1P1,J2-1P2共有一条特征序列SEQ ID No.8，全长661bp,该段序列为除去J1P1,J1P2,J1P3,J2-1P1,J2-1P2外所有现有发现的噬菌体所不含有的特征序列；
其中，所述SEQ ID.6～8的序列为本发明上述噬菌体所特有的核苷酸序列，目前已发现的其它噬菌体乃至其它生物的基因组都还尚未检测出包含上述SEQ ID.6～8的核苷酸序列。
实施例5：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本专利选取44种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本专利5株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。
表1 病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
实施例6 噬菌体SDS-PAGE分析
取实例1中的噬菌体溶液，按照质量体积比1：10加入PEG8000,溶解后冰浴3h后，4℃条件下11000rpm离心20min后，弃上清，用适量无菌水重悬沉淀，即获得该噬菌体浓缩液。取浓缩后的含噬菌体颗粒的液体15μL与3μL的6×上样缓冲液混匀后100℃水浴5min使蛋白变性，将处理后的样品和蛋白Marker加入凝胶加样孔并做好标记，接通电源后90V约100min后待测样品电泳至浓缩胶和分离胶交界处，然后将电压升高至150V，继续电泳至分离胶下缘，停止电泳，将整块分离胶放到玻璃平皿中，用常规蛋白银染方法进行银染，待蛋白条带显色后取出并扫描,结果如图3。
结果表明：M泳道(蛋白Marker)，分子量标准依次为170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；1号泳道(J1P1)有8个结构蛋白，2号泳道(J1P2)有1个结构蛋白，3号泳道(J1P3)主要有2个结构蛋白，4号泳道(J2-1P1)有1个结构蛋白，5号泳道(J2-1P2)有1个结构蛋白，5株噬菌体的主要结构蛋白均为55kDa左右。
实施例7：噬菌体MOI及效价的测定
挑取金黄色葡萄球菌J1单个菌落，接种到盛有3ml LB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到l0ml LB培养液，37℃160rprn振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例分别加入噬菌体5种噬菌体纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入LB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心l0min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2原液(由实施例1制得)分别10倍梯度稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l00μl与其宿主菌多重耐药性金黄色葡萄球菌菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
结果表明，培养6h条件下，噬菌体J1P1效价达到最高(8.1×109pfu/ml)时，其MOI＝100；噬菌体J1P2效价于6h内达到最高(1.8×10^8pfu/ml)，其MOI＝0.1；噬菌体J1P3效价达到最高(3.3×10^8pfu/ml)时，其MOI＝0.1；噬菌体J2-1P1效价达到最高(5.5×107pfu/ml)时，其MOI＝0.1；噬菌体J2-1P2效价于6h内达到最高(3.2×109pfu/ml)，其MOI＝0.0001。
表2 5株噬菌体MOI值
实施例8：噬菌体pH和温度稳定性的测定
8-1：不同pH条件下噬菌体的稳定性
将J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2等5种噬菌体(由实施例1制得)分别置于pH＝3,5,7,9,11的LB溶液中，37℃培养24h后，再检测其效价。结果如表1所示，在pH5～pH9之间，5株噬菌体的效价均无显著变化，表明其在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。在pH3条件下，5株噬菌体的效价均为0，表明在酸性条件下5株噬菌体均失活；在pH11条件下，5株噬菌体的效价也均为0，表明在碱性条件下5株噬菌体均失活。
表3 5株噬菌体在不同pH条件下的稳定性(效价变化)
8-2：不同温度条件下噬菌体的稳定性
将J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2等5株噬菌体分别置于37℃,40℃以及68℃条件下2h后检测其效价。结果如表5所示，5株噬菌体在37℃,40℃具有较高的稳定性，而当温度达到68℃时，半个小时后5株噬菌体的不再具有活性。
表4 5株噬菌体在37℃条件下的稳定性(效价变化)
表5 5株噬菌体在40℃条件下的稳定性(效价变化)
表6 5株噬菌体在65℃条件下的稳定性(效价变化)
实施例9 耐药性金黄色葡萄球菌裂解范围试验
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取临床分离所得的31株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)、97株耐甲氧西林金葡菌(MRSA)及5株边缘型抗苯甲异噁唑青霉素金葡菌(BORSA)的单菌落，将其接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl各噬菌体培养液(由实施例1制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果如表3所示，J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达96.24％，82.7％，95.48％，71.42％，和87.21％。含有J1P1，J1P2，J1P3，J2-1P1及J2-1P2的鸡尾酒组合(其有效工作效价比例为1:1:1:1:1，总效价为107pfu/ml)可识别所有供试金葡菌,裂解率可达100％。说明这些噬菌体具有较宽的宿主谱且在噬菌体治疗方面具有极大的应用潜力。
表7 金黄色葡萄球菌裂解谱的测定结果
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例10：对其它葡萄球菌的裂解试验
挑取致病性表皮葡萄球菌7株，溶血葡萄球菌2株，木糖葡萄球菌4株，猪葡萄球菌5株，产色葡萄球菌2株，松鼠葡萄球菌5株，腐生葡萄球菌5株，马胃葡萄球菌4株，小牛葡萄球菌1株，科氏葡萄球菌6株，模仿葡萄球菌2株，阿尔莱特葡萄球菌2株，缓慢葡萄球菌1株，共46株其他葡萄球菌菌落，将其分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液(由实施例1制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果表明，J1P1可以裂解4株表皮葡萄球菌，3株木糖葡萄球菌，5株猪葡萄球菌，2株产色葡萄球菌，5株松鼠葡萄球菌，5株腐生葡萄球菌，4株马胃葡萄球菌，1株小牛葡萄球菌，6株科氏葡萄球菌，2株模仿葡萄球菌，2株阿尔莱特葡萄球菌和1株缓慢葡萄球菌，不能裂解溶血葡萄球菌，总裂解率为86.95％；J1P2可以裂解6株表皮葡萄球菌，2株溶血葡萄球菌，4株木糖葡萄球菌，5株猪葡萄球菌，2株产色葡萄球菌，5株松鼠葡萄球菌，5株腐生葡萄球菌，4株马胃葡萄球菌，1株小牛葡萄球菌，6株科氏葡萄球菌，2株模仿葡萄球菌，2株阿尔莱特葡萄球菌和1株缓慢葡萄球菌，不能裂解溶血葡萄球菌，总裂解率为97.82％；J1P3可以裂解2株表皮葡萄球菌，1株溶血葡萄球菌，4株木糖葡萄球菌，5株猪葡萄球菌，2株产色葡萄球菌，4株松鼠葡萄球菌，5株腐生葡萄球菌，4株马胃葡萄球菌，1株小牛葡萄球菌，6株科氏葡萄球菌，2株模仿葡萄球菌，2株阿尔莱特葡萄球菌和1株缓慢葡萄球菌，不能裂解溶血葡萄球菌，总裂解率为86.95％；J2-1P1可以裂解3株表皮葡萄球菌，4株木糖葡萄球菌，5株猪葡萄球菌，2株产色葡萄球菌，4株松鼠葡萄球菌，5株腐生葡萄球菌，4株马胃葡萄球菌，1株小牛葡萄球菌，6株科氏葡萄球菌，2株模仿葡萄球菌，2株阿尔莱特葡萄球菌和1株缓慢葡萄球菌，不能裂解溶血葡萄球菌，总裂解率为84.78％；J2-1P2可以裂解5株表皮葡萄球菌，2株溶血葡萄球菌，4株木糖葡萄球菌，5株猪葡萄球菌，2株产色葡萄球菌，4株松鼠葡萄球菌，5株腐生葡萄球菌，4株马胃葡萄球菌，1株小牛葡萄球菌，6株科氏葡萄球菌，2株模仿葡萄球菌，2株阿尔莱特葡萄球菌和1株缓慢葡萄球菌，不能裂解溶血葡萄球菌，总裂解率为93.47％。
表8 其他葡萄球菌的裂解谱的测定结果
注：可分为“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例11：噬菌体对非致病性细菌的裂解试验
挑取10株非致病性大肠杆菌菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果如表7所示，在本研究中，5株噬菌体均无法识别10株供试大肠杆菌。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
表9 5株噬菌体对非致病性大肠杆菌的裂解试验
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例12：噬菌体对非宿主性致病性细菌的裂解试验
挑取30株非宿主性病原细菌单菌落,包括停乳链球菌5株，无乳链球菌5株，副溶血弧菌5株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌5株，鲍曼不动杆菌5株。分别接种于盛有3mlLB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果显示，5株噬菌体均无法识别30株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表8)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
表10 5株噬菌体对非宿主性致病性细菌的裂解试验
(注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例13不同噬菌体组合的制备
根据表8中的要求分别将实施例1制得的噬菌体进行混合，最终获得的混合液中，各噬菌体的单位体积有效工作效价相等混合液的各噬菌体总效价不应低于107pfu/ml.
表8 不同的噬菌体组合物及比例和杀菌范围
实施例14：以葡萄球菌噬菌体为有效成份的新型抗菌组合物在治疗母猪子宫内膜炎中的应用
病料来源广西壮族自治区钦州市高明猪场以及贵港某猪场的9头发病母猪。分别用棉拭子采集母猪产道分泌物后迅速放入冰盒中低温保藏，快递到南京实验室待检。
将棉拭子浸泡于生理盐水中半小时后，梯度稀释，分别涂抹于甘露醇高盐培养基平板上，置于37℃条件下培养16h。挑取单菌落，用平板划线法进行纯化。经革兰氏染色镜检和16S rDNA鉴定，分离获得松鼠葡萄球菌，猪葡萄球菌，溶血葡萄球菌，阿尔莱特葡萄球菌和科氏葡萄球菌等致病性葡萄球菌供18株。
用实施例1制备的噬菌体按照实施例13的配制方法制成J1P1、J2-1P1和J2-1P2的组合物，根据实例9中所采用双层平板点滴法，对上述18株致病菌进行裂解试验。
试验地点：广西壮族自治区钦州市高明养猪场
试验时间：2015.11.30～2016.03.14
试验材料：由噬菌体J1P2，J2-1P1和J2-1P2(效价均为107pfu/ml) 组成的鸡尾酒混合物；15头患病母猪，3头作为对照组不进行任何治疗，12头平均分为3个处理组，进行噬菌体治疗。
试验方法：噬菌体产品从4℃冰箱取出后，用生理盐水稀释10倍后子宫内灌注(可参见母畜输精方法：先插入管子，再用大型注射器抽取一次量50ml)，每日灌注一次，连续治疗7天
试验结果：经B超检测用噬菌体治疗母猪12头母猪中，9头成功配种妊娠；对照组3头母猪均未发情配种。3个处理组妊娠率均为100％，显著高于对照组妊娠率0％。
结果如表所示，由J1P2、J2-1P1和J2-1P2噬菌体组成的组合物对18株葡萄球菌均有不同程度的杀伤能力，裂解率为100％。
实施例15：以葡萄球菌噬菌体为有效成份的新型抗菌组合物在治疗仔猪渗出性皮炎中的应用
病料来源广西壮族自治区钦州市高明猪场以及贵港某猪场的21头发病仔猪。分别用棉拭子采集仔猪表皮分泌物后迅速放入冰盒中低温保藏，快递到南京实验室待检。
将棉拭子浸泡于生理盐水中半小时后，梯度稀释，分别涂抹于甘露醇高盐培养基平板上，置于37℃条件下培养16h。挑取单菌落，用平板划线法进行纯化。经革兰氏染色镜检和16S rDNA PCR鉴定，分离获得松鼠葡萄球菌，猪葡萄球菌，溶血葡萄球菌及木糖葡萄球菌等致病性葡萄球菌共12株。
用实施例1制备的噬菌体按照实施例13的配制方法制成J1P2、J2-1P1和J2-1P2的组合物，根据实例9中所采用双层平板点滴法，对上述12株致病菌进行裂解试验。
试验地点：广西壮族自治区钦州市高明养猪场
试验时间：2015.9.30～2016.10.14
试验材料：由噬菌体J1P2，J2-1P1和J2-1P2(效价均为107pfu/ml)组成的鸡尾酒混合物；20头患病仔猪，5头作为对照组不进行任何治疗，15头平均分为3组，进行噬菌体治疗。
试验方法：噬菌体产品从4℃冰箱取出后，用生理盐水稀释10倍后喷洒在仔猪皮肤上，每日一次。
试验结果：
一周之后，处理组15头仔猪病情显著好转，表现为皮肤上无明显痂皮，采食量恢复正常，精神状态良好，活泼好动；而对照组病情没有显著好转，表现为皮肤仍有大量痂皮，食欲不振，精神萎靡。
一个月之后，对处理组以及对照组的仔猪进行体重测量，如下表所示,结果表明用噬菌体治疗的3组仔猪体重均显著大于对照组，且三组之间无显著差异。
结果显示：由J1P2、J2-1P1和J2-1P2的组合物对12株葡萄球菌均有不同程度的杀伤能力，裂解率为100％。
实施例16：以葡萄球菌噬菌体为有效成份的新型抗菌组合物在裂解奶牛乳房炎致病菌中的应用
病料来源南京市江宁区某奶牛场6头发病奶牛。分别采集乳汁后迅速放入冰盒中低温保藏，快递到南京实验室待检。
将牛奶梯度稀释，分别涂抹于甘露醇高盐培养基平板上，置于37℃条件下培养16h。挑取单菌落，用平板划线法进行纯化。经革兰氏染色镜检和16S rDNA PCR鉴定，分离获得金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌共12株。
用实施例1制备的噬菌体按照实施例13的配制方法制成J1P1、J1P2、J1P3、J2-1P1和J2-1P2的组合物，根据实例9中所采用双层平板点滴法，对上述12株致病菌进行裂解试验。
试验地点：江苏省南京市江宁区某奶牛场
试验时间：2014.11.15～2014.11.30
试验材料：由噬菌体J1P1，J1P2，J1P3,J2-1P1和J2-1P2(效价均为107pfu/ml)组成的鸡尾酒混合物；兽用青霉素针剂(500,000units)，从患病奶牛牛奶中分离获得的12株致病葡萄球菌。
试验方法：噬菌体产品和抗生素从4℃冰箱取出后，通过双层平板点滴法对致病菌进行点滴实验。
试验结果：如表所示，噬菌体可以裂解所有12株致病葡萄球菌，而青霉素只能裂解其中2株。
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”。
Claims (11)
1.新的金黄色葡萄球菌噬菌体，特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体为金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)、保藏编号为CCTCC No：M2016284；金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)、保藏编号为CCTCCNo：M2016285；金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)、保藏编号为CCTCC No：M2016286；金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phageJ2-1P1)、保藏编号为CCTCC No：M2016287；金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcusaureus phage J2-1P2)、保藏编号为CCTCC No：M2016288。
2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)具有等轴衣壳、可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构；并在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性，在MOI＝100条件下培养6h，其效价为8.1×109pfu/ml；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性，MOI＝0.1条件下培养6h，J1P2效价为1.89×108pfu/ml；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性、MOI＝0.1条件下培养6h，其效价可达到4.6×108pfu/ml；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH3～pH10、37℃～60℃具有耐性、MOI＝0.1条件下培养6h，其效价可达到5.5×107pfu/ml；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)所 述噬菌体具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH3～pH10、37℃～60℃条件下具有耐性，MOI＝0.0001条件下培养6h，其效价为3.2×109pfu/ml。
3.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)的主要结构蛋白相对分子量为55kDa。
4.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcusaureus phage J2-1P2)具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、或/和SEQ IDNo.8所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)具有SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcus aureus phage J1P3)具有SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)具有SEQ IDNo.8所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)具有SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
6.一种葡萄球菌噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物含有金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1(Staphylococcus aureus phage J1P1)、金黄色葡萄球菌噬菌体J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)、金黄色葡萄球菌噬菌体J1P3(Staphylococcusaureus phage J1P3)、金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P1(Staphylococcus aureus phage J2-1P1)和金黄色葡萄球菌噬菌体J2-1P2(Staphylococcus aureus phage J2-1P2)中的三种或三种以上的组合。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括J1P1、J1P2和J1P3的组合，J1P1、J1P2和J2-1P1的组合，J1P1、J1P2和J2-1P2的组合，J1P1、J1P3和J2-1P1的组合，J1P1、J1P3和J2-1P2的组合，J1P1、J2-1P1和J2-1P2的组合,J1P2、J1P3和J2-1P1的组合，J1P2、J1P3和J2-1P2的组合,J1P2、J2-1P1和J2-1P2的组合，J1P3、J2-1P1和J2-1P2的组合，J1P1，J1P2、J1P3、和J2-1P1的组合；J1P1、J1P2、J1P3和J2-1P2的组合，J1P1、J1P2、J2-1P1和J2-1P2的组合，J1P1、J1P3、J2-1P1和J2-1P2的组合,J1P2、J1P3、J2-1P1和J2-1P2的组合或J1P1、J1P2、J1P3、J2-1P1、J2-1P2的组合。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，以单位体积中所含噬菌体效价(pfu/ml)计、所述J1P1、J1P2和J1P3的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P2和J2-1P1的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P2和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P3和J2-1P1的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P3和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P1、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P2、J1P3和J2-1P1的比例为1：1：1，所述J1P2、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P2、J1P3和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P3、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1，所述J1P1、J1P2、J1P3，和J2-1P1的比例为1：1：1：1；所述J1P1、J1P2、J1P3和J2-1P2的比例为1：1：1：1，所述J1P1、J1P2、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1：1， 所述J1P1、J1P3、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1：1,所述J1P2、J1P3、J2-1P1和J2-1P2的比例为1：1：1：1或所述J1P1、J1P2、J1P3、J2-1P1和J2-1P2的组合的比例为1：1：1：1：1。
9.一种含有权利要求1～6任一所述葡萄球菌噬菌体或7～8任一所述葡萄球菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
10.权利要求1～9任一所述的噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒在抗金黄色葡萄球菌(MRSA,MSSA,BORSA)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌、猪葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马胃葡萄球菌、小牛葡萄球菌、科氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌或缓慢葡萄球菌的应用。
11.权利要求1～9任一所述的噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒用于制备治疗由葡萄球菌引发的仔猪渗出性皮炎，母猪子宫内膜炎疾病的药物中的应用。
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