CN104845942A - 可裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其分离方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性、高效杀灭多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其制备、用途。本发明从环境中筛选出具有特异性高效裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体，裂菌谱广。基于双层琼脂平板法，获得大量具有裂菌活性的噬菌体，确定其裂菌活性、裂菌谱、体外裂菌能力，以及噬菌体的理化特性。该噬菌体特异性强，且不易使细菌产生抗性，也不会对宿主产生不良影响，是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法，本发明有望成为一种防控耐药性金黄色葡萄球菌感染的新型抗菌制剂或环境消毒剂。

Description

可裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其分离方法和用途

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种高效快速杀灭多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其分离、用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的条件性致病菌，可引起人和动物多种严重的感染性疾病。由于金黄色葡萄球菌多重耐药性菌株的出现，使得对该菌引起感染的治疗变得越来越困难。尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,VRSA)菌株的出现，几乎对所有常用的抗生素都表现出极强的耐药性。在此形势下，即使投入大量的人力和资金继续研发新型抗生素，细菌的耐药问题仍无法得到有效解决。因此，寻找有效控制多重耐药菌的新对策十分迫切。

噬菌体通过高效、专一侵染细菌，并在细菌内大量复制并释放而裂解细菌，而且与传统的治疗细菌感染的方法相比，用噬菌体治疗细菌性感染有着很大的优势：(1)使用量极小。噬菌体病毒颗粒在感染细菌后，可迅速以指数数量级增殖，并产生数以万计的子代噬菌体颗粒，而每个子代噬菌体颗粒又可以继续感染其它细菌，再产生上万个子代噬菌体颗粒。如此只需重复几次，在理论上，一个噬菌体病毒颗粒便可以使上亿个细菌感染死亡，从而达到治疗细菌感染的目的。(2)高度地特异性。噬菌体具有严格的宿主特异性，往往只感染某一株或某一类细菌，而对动物或人机体内的正常微生物菌群无影响。(3)细菌不易对其产生抗性。噬菌体可以通过自身基因突变或者基因重组等方式来适应宿主细菌的变异，而传统的治疗方法则不具备这一优势。(4)无药物残留。噬菌体对宿主细菌的特异性和依赖性，从而决定了噬菌体只会在被细菌感染的部位，当宿主细菌被完全杀灭后，噬菌体也将随之死亡，不会导致体内残留的发生。(5)作为治疗细菌感染的噬菌体库丰富。据报道，噬菌体是地球上已发现的最丰富、最多样化的生物体，其在自然环境中含有量高达10³¹个，而传统的治疗方法或治疗药物均是有限的。(6)费用成本低。相比传统方法的治疗药物如新型抗生素药物的研发等需要数年，不仅需要花费数百万美元用于临床实验，而且还不能完全保证其治疗效果，而分离和鉴定噬菌体却是一个费用低、速度快的过程。(7)噬菌体可被用于治疗对抗生素或其他药物治疗过敏的患者。因此，噬菌体疗法是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法。而迄今为止，已经被分离和利用的噬菌体数量却非常有限，且大多数噬菌体的环境适应能力差、裂菌谱较窄、裂菌效率低，特别是特异性裂解MRSA菌株的噬菌体国内鲜有报道，本发明的突出优势就是解决了以上这几个问题。

本发明基于双层琼脂平板法，从环境中分离和筛选出金黄色葡萄球菌噬菌体，并研究噬菌体的病毒学特征和生物学活性，获得裂菌谱广、抗MRSA效率强的噬菌体；评估噬菌体的体外裂菌能力及环境杀菌能力。从而为制备新型生物杀菌制剂或环境消毒剂，以及有效防控金黄色葡萄球菌感染，特别是MRSA菌株感染，提供有效的生物材料和基础数据。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的缺陷，提供一种杀灭耐药性金黄色葡萄球菌噬菌体及其分离、用途；具体是一种能够高效裂解MRSA菌株、食源性金黄色葡萄球菌及临床分离株的噬菌体的分离、纯化、理化特性、裂菌条件优化、体外裂菌能力及用途。本发明从环境中分离、筛选具有特定高效裂菌作用的噬菌体，基于双层琼脂平板法，确定其裂菌活性、裂菌谱，以及影响其裂菌活性的最优裂解条件，提供一种能够高效裂解金黄色葡萄球菌的新型裂菌制剂、用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种噬菌体。该噬菌体，头部呈现正六边形外廓，直径约48nm～51nm，噬菌体含非收缩性的尾部，宽约5nm～8nm、长约18nm～21nm，为短尾噬菌体。该噬菌体能够高效裂解不同来源的金黄色葡萄球菌。

第二方面，本发明涉及一种上述噬菌体的分离方法，包括如下步骤：

步骤一：从上海某四个奶牛场中随机采集土壤、粪便和鼻拭子样品以及健康猪群的粪便样品，分别将样品充分溶解于灭菌的PBS溶液中，经低温、高速离心后，除去细菌及其他杂质，收集上清液，经无菌检验后，获得样品的无菌滤液；

步骤二：采用3次富集法，将步骤一所得无菌滤液经3次富集后，制备噬菌体原液；

步骤三：采用双层琼脂平板法，筛选步骤二的噬菌体的指示菌为多种不同来源的金黄色葡萄球菌；

步骤四：采用双层琼脂平板法，分离、纯化步骤三获得的噬菌体SLPW；

步骤五：观察噬菌体的形态，采用磷钨酸负染法，在透射电镜下观察该噬菌体的形态特征。结果显示，该噬菌体头部均呈现正六边形外廓，直径约48nm～51nm，噬菌体含非收缩性的尾部，宽约5nm～8nm、长约18nm～21nm，为短尾噬菌体。

步骤六：以金黄色葡萄球菌05L189为指示菌，采用双层琼脂平板法测定该噬菌体的效价为8.7×10⁹PFU/mL；

步骤七：确定该噬菌体的裂菌谱，所用指示菌为不同血清型的多重耐药的猪链球菌菌株、马链球菌兽疫亚种、不同来源的金黄色葡萄球菌菌株、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。该噬菌体对猪链球菌菌株、马链球菌兽疫亚种、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌不具有裂解活性，对金黄色葡萄球菌尤其是MRSA和VRSA菌株表现出极强地裂解活性；

步骤八：测定该噬菌体的理化特性，理化特性包括热稳定性、pH稳定性、紫外线灭活实验和氯仿敏感性。该噬菌体表现出良好的热稳定性和较宽的pH耐受范围。在60℃以下，作用1h仍能保持良好的活性；在pH4～pH11范围内，仍保持良好的侵染能力。此外，该噬菌体对紫外线和氯仿不敏感，经紫外线照射1h后，效价并未发生明显变化。经75％氯仿处理24h后，仍保持较高的感染能力，效价均在10⁷PFU/mL以上，表明该噬菌体无囊膜。

步骤九：确定该噬菌体的稳定性，稳定性包括该噬菌体在室温、4℃、-20℃和-80℃下保存三个月的稳定性。

在室温放置一个月后，该噬菌体效价下降7个指数级，几乎丧失感染能力；在4℃放置一个月后，效价下降1个指数级，在第2个月的时候，效价下降4个指数级，而在第3个月的时候，噬菌体效价下降了6个指数级；在-20℃和-80℃放置三个月，效价几乎未发生变化，表明-20℃和-80℃保存均是最佳的保存方法，室温保存效果最差，而4℃可以短暂放置，但不可长久保存。

步骤十：确定该噬菌体的液体裂菌效果以及环境抑菌、杀菌效果。以MRSA菌株PNB25和DL57-3为指示菌，该噬菌体不仅能在液体培养基中完全裂解两株细菌，而且还能在环境中很好地抑制和杀死细菌。

优选地，步骤二中，所述3次富集法：取经无菌检验的滤液30mL与等体积的BHI培养基混匀后，加入处于对数生长期(OD600＝0.5～0.7)的噬菌体宿主菌金黄色葡萄球菌3mL，37℃165rpm振荡培养过夜。次日4℃12000rpm离心15min，取上清30mL，分别加入等体积的BHI培养基和宿主菌增菌液1mL，37℃静置30min后，165rpm振荡培养12h后，4℃12000rpm离心15min。取上清15mL，加入等体积的BHI培养基及宿主菌增菌液0.6mL，室温静置30min，37℃165rpm振荡培养4h。4℃12000rpm离心20min，收集上清并用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到噬菌体原液。

优选地，步骤三中,所述双层琼脂平板法：分别以9株金黄色葡萄球菌、18株MRSA和VRSA菌株、10株食源性菌株及17株临床分离株共计54株菌株为指示菌，分别取300μL步骤二中富集得到的噬菌体原液，与54株过夜培养的300μL菌液分别混匀，轻轻漩涡振荡后于37℃孵育20min，加入40℃左右的上层琼脂中，混匀后迅速浇注在底层平板—BHI培养基固体平板上，室温放置15min，待其凝固后，倒置于37℃培养箱培养11h～13h，筛选能形成噬菌斑的平板。

优选地，所述步骤四中分离、纯化噬菌体具体为：选取噬菌斑生长均匀的双层琼脂平板，挑取单个噬菌斑，接种于1mL BHI培养基中，37℃培养2h～3h后，4℃12000rpm离心10min，收集上清经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存。将该液体做适当稀释，基于双层琼脂平板法，对单个噬菌斑进行上述反复纯化，最终使双层琼脂平板上的噬菌斑形态和大小完全一致，即获得了纯化的噬菌体分离株，为SLPW。

优选地，所述步骤六中测定该噬菌体效价具体为：将纯化好的噬菌体液用BHI培养基进行适当稀释，采用双层琼脂平板法，取100μL的噬菌体稀释液与等体积的指示菌混匀后倒双层琼脂平板，于37℃培养箱倒置培养11h～13h。选取30个～300个噬菌斑的平板进行计数，最终得出原噬菌体液的噬菌体数(噬菌效价)。每个稀释度做3个重复，实验重复3次，噬菌体效价取其平均值，经计算，其效价为8.7×10⁹PFU/mL。

优选地，所述步骤七中确定噬菌体的裂菌谱具体为：分别以20株MRSA和VRSA菌株、20株食源性菌株、20株临床分离菌株、猪链球菌、大肠杆菌参考株MC1061共62株作为指示菌。取300μL培养至对数早期的待测菌株加入45℃左右的上层琼脂培养基中，混匀后倒入预先制备好的BHI固体琼脂平板上，待平板凝固且表面干燥后，取20μL效价约10⁸PFU/mL的噬菌体SPLW滴加至平板表面，待菌液吸收后置37℃培养过夜，观察噬菌体对菌株的裂解情况。实验结果显示，噬菌体对不同来源的金黄色葡萄球菌的裂解能力不同。其中，噬菌体不仅对20株食源性菌株中的5株有较强的裂解作用，对20株临床分离菌株均有裂解作用，而且对10株MRSA和VRSA菌株中的18株也表现出强裂解性。说明噬菌体具有很宽的裂菌谱，且对MRSA和VRSA菌株具有很强的裂解能力。但噬菌体不能裂解猪链球菌和大肠杆菌，这与噬菌体的自然特征——对宿主菌的裂解具有特异性和专一性相符合。

优选地，所述步骤八中确定该噬菌体的热稳定性具体为：将噬菌体原液稀释至10⁸PFU/mL，取1mL于无菌EP管中，分别于25℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中作用1h，待作用时间结束后立即取出置于冰上冷却，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个温度做3个重复，实验重复3次。结果显示，该噬菌体的最适温度为37℃，且在25℃～60℃均能保持较高的感染力。

优选地，所述步骤八中确定该噬菌体的pH稳定性具体为：所选取的pH值梯度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。分别取0.8mL不同pH值的BHI培养基于无菌EP管中，经37℃水浴10min，待温度平衡后，分别加入0.2mL效价为10⁸PFU/mL的噬菌体，37℃水浴1h后，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个梯度做3个重复，实验重复3次。结果显示，该噬菌体的最适pH为7，且在pH3～pH12均能保持较高的感染力。

优选地，所述步骤八中噬菌体的紫外线灭活实验具体为：将噬菌体悬浮液(约108PFU/mL)置于30W的紫外灯下(约35cm处)1h，每隔10min取样，并将噬菌体进行适当倍比稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。每次取样做3个重复，实验重复3次。结果显示，随着照射时间延长，噬菌体的效价并未发生明显变化，表明噬菌体具有较强的紫外线耐受能力。

优选地，所述步骤八中噬菌体的氯仿敏感实验具体为：向噬菌体悬浮液(约108PFU/mL)中加入5％、25％、50％、75％的氯仿溶液，充分混匀并置于4℃静置，于6h、12h、18h、24h取样，4℃8000rpm离心15min，上清用BHI液体培养基进行倍比稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。每个时间点做3个重复，实验重复3次。结果显示，在不同浓度的氯仿中的噬菌体效价均没有发生显著性变化。其中5％的氯仿对噬菌体活性的影响最小，而75％的氯仿对噬菌体的活性略有影响，但噬菌体的效价均保持在10⁷PFU/mL以上。说明噬菌体能够耐受氯仿的压力，对氯仿不敏感，无囊膜。

优选地，所述步骤十中确定该噬菌体的环境杀菌效果具体为：取新鲜制备的BHI固体平板，做噬菌体喷雾处理，具体方法如下：将平板分别做噬菌体的喷雾1次(约110μL，10⁸个噬菌体)、喷雾2次和喷雾3次的处理，对照组喷雾等量的噬菌体稀释液，每个平皿分别于喷雾前或喷雾后涂布适量的MRSA菌株PNB25和DL57-3。于恒温培养箱37℃倒置培养12h后，对每组平板进行菌落计数。每个稀释度做3个重复，实验重复3次。结果显示，与对照组相比经噬菌体喷雾处理后的平板上，细菌菌落个数均明显减少甚至无菌落生长。结果表明该噬菌体对细菌有很好的抑制作用。

第三方面，本发明涉及一种上述制备的噬菌体在杀灭金黄色葡萄球菌中的用途。

优选地，所述金黄色葡萄球菌菌株有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株20株：PNB3、PNB5、PNB16、PNB25、PNB32、PNB38、PNB40、PNB49、PNB55、PNB65、PN31、DL44-2、DL56-1、DL57-2、DL57-3、DZ92等，临床分离金黄色葡萄球菌株20株等：SH1、SH2、SH4、SH5、SH6、SH7、SH8、SH9、SH10、SH11、SH12、SH15、SH17等和食源性金黄色葡萄球菌菌株20株：05L186、05L189等。

本发明的原理在于：噬菌体广泛分布于自然界中，且能高效、专一裂解细菌。本发明从环境中分离得到一株金黄色葡萄球菌烈性噬菌体，具有良好的热稳定性和较宽的pH耐受范围，且裂菌谱广，尤其是对MRSA菌株具有强裂解作用，在体外可高效裂解金黄色葡萄球菌临床分离株、食源性金黄色葡萄球菌和MRSA和VRSA菌株。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：针对金黄色葡萄球菌的严重耐药性，本发明有望成为一种防控耐药性金黄色葡萄球菌感染的新型抗菌制剂或环境消毒剂。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为以金黄色葡萄球菌05L189为指示菌，采用双层琼脂平板法，观察到的噬菌斑的示意图；

图2为透射电镜下观察到的噬菌体SLPW的形态特征的示意图；

图3为以MRSA菌株PNB25和DL57-3为指示菌，测定该噬菌体的液体裂菌实验的示意图；

图4为以MRSA菌株PNB25和DL57-3为指示菌，先喷雾噬菌体再涂布细菌的抑菌实验的示意图；

图5为以MRSA菌株PNB25和DL57-3为指示菌，先涂布细菌再喷雾噬菌体的杀菌实验的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、样品的处理

将采集的土壤、粪便和鼻拭子样品充分溶解于灭菌的50mL PBS溶液中，4℃5000rpm离心20min，除去细菌及其他杂质，上清用0.22μm滤膜过滤，将滤液置于无菌的瓶内于37℃150rpm振荡培养18h，作无菌检查，并将无细菌生长的滤液4℃保存，用于噬菌体的富集和分离。

实施例2、噬菌体原液的富集

采用3次富集法；具体操作如下：

取实施例1的滤液30mL与等体积的BHI培养基混匀后，加入处于对数生长期(OD₆₀₀＝0.5～0.7)的噬菌体宿主菌金黄色葡萄球菌3mL，37℃165rpm振荡培养过夜。次日4℃12000rpm离心15min，取上清30mL，分别加入等体积的BHI培养基和宿主菌增菌液1mL，37℃静置30min后，165rpm振荡培养12h后，4℃12000rpm离心15min。取上清15mL，加入等体积的BHI培养基及宿主菌增菌液0.6mL，室温静置30min，37℃165rpm振荡培养4h。4℃12000rpm离心20min，收集上清并用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到噬菌体原液。

实施例3、噬菌体指示菌的筛选

以20临床分离株金黄色葡萄球菌、20株MRSA菌株、20株食源性菌株及17株临床分离株共计60株菌株为指示菌，采用双层琼脂平板法，筛选能形成疑似噬菌斑的平板。具体过程：

取300μL实施例2的噬菌体原液，分别与60株过夜培养的等量菌液混匀，轻轻漩涡振荡后于37℃孵育20min，加入40℃左右的上层琼脂中，混匀后迅速浇注在底层平板—BHI培养基固体平板上，室温放置15min，待其凝固后，倒置于37℃培养箱培养11h～13h，获得可形成噬菌斑的平板，并筛选到金黄色葡萄球菌05L189为指示菌。

实施例4、噬菌斑的分离、纯化

采用双层琼脂平板法，分离、纯化噬菌体。具体操作如下：

选取噬菌斑生长均匀的双层琼脂平板，挑取单个噬菌斑，接种于1mL BHI培养基中，37℃培养2h～3h后，4℃12000rpm离心10min，收集上清经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存。将该液体做适当稀释，基于双层琼脂平板法，对单个噬菌斑进行上述反复纯化，最终使双层琼脂平板上的噬菌斑形态和大小完全一致，即获得了单一的噬菌体，如图1所示。

实施例5、噬菌体的形态观察

观察实施例4获得的噬菌体的形态特征，具体操作如下：

采用磷钨酸负染法，进行噬菌体形态特征的观察。

取300μL该噬菌体浓缩液，将铜网完全浸入7min后，取出置于干净的滤纸上，吸去多余的液体，晾干5min，用2％的磷钨酸(pH 6.7)负染10min，置通风厨中干燥后，进行透射电镜观察。结果显示：该噬菌体头部均呈现正六边形外廓，直径约48nm～51nm，噬菌体含非收缩性的尾部，宽约5nm～8nm、长约18nm～21nm，为短尾噬菌体。如图2所示。

实施例6、噬菌体效价的测定

测定实施例4获得的噬菌体效价，具体操作如下：

采用双层琼脂平板法，以05L189为指示菌进行测定。

取100μL的噬菌体稀释液与等体积的指示菌混匀后倒双层琼脂平板，于37℃培养箱倒置培养11h～13h。选取30个～300个噬菌斑的平板进行计数，最终得出原噬菌体液的噬菌体数(噬菌效价)。经测定，该噬菌体的效价为8.7×10⁹PFU/mL。

实施例7、噬菌体的裂菌谱测定

采用双层琼脂平板法测定实施例4获得的噬菌体的裂菌谱，具体操作如下：

金黄色葡萄球菌菌株包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素菌株20株(PNB3、PNB5、PNB16、PNB25、PNB32、PNB38、PNB40、PNB49、PNB55、PNB65、PN31、DL44-2、DL56-1、DL57-2、DL57-3、DZ92等)、临床分离菌20菌株(SH1、SH2、SH4、SH5、SH6、SH7、SH8、SH9、SH10、SH11、SH12、SH15、SH17等)和食源性菌20株分离菌株(05L186、05L189等)，猪链球菌1株和大肠杆菌菌株MC1061培养至对数早期，各取300uL，加入45℃左右的上层琼脂培养基中，混匀后倒入BHI固体琼脂平板上，待平板凝固且表面干燥后，取20μL效价约10⁸PFU/mL的噬菌体滴加至平板表面，置37℃培养过夜，观察噬菌体对菌株的裂解情况。结果表明，该噬菌体对猪链球菌、和大肠杆菌无裂解作用，但对不同来源的金黄色葡萄球菌具有很强的裂解活性，裂解活性高。裂菌谱测定结果见表1。

实施例8、噬菌体的理化特性

探索实施例4获得的噬菌体的理化特性，具体操作如下：

理化特性包括：热稳定性、pH稳定性、紫外线灭活实验和氯仿敏感性。采用双层琼脂平板法，以05L189为指示菌进行测定。

热稳定性的测定：将噬菌体稀释至10⁸PFU/mL，取1mL于无菌EP管中，分别于25℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中作用1h，待作用时间结束后立即取出置于冰上冷却，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个温度做3个重复，实验重复3次。结果表明：该噬菌体的最适温度为37℃。经45℃和50℃孵育1h后，仍能保持75％以上的感染率；经55℃和60℃孵育1h后，其活性下降显著；65℃温度下，活性丧失。

pH稳定性的测定：本实验所选取的pH值梯度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。分别取0.8mL不同pH值的BHI培养基于无菌EP管中，经37℃水浴10min，待温度平衡后，分别加入0.2mL效价为10⁸PFU/mL的噬菌体，37℃水浴1h后，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个梯度做3个重复，实验重复3次。结果表明：该噬菌体具有较宽的pH耐受范围，在pH5～pH11的条件下，仍保持较高的感染力。

紫外线灭活实验：将该噬菌体悬浮液(约10⁸PFU/mL)置于30W的紫外灯下(约35cm处)1h，每隔10min取样，并采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。每次取样做3个重复，实验重复3次。结果表明：紫外线对该噬菌体的活性影响不显著，随着照射时间延长，该噬菌体的效价并未发生显著性下降。

氯仿敏感性实验：向该噬菌体悬浮液(约10⁸PFU/mL)中加入5％、25％、50％、75％的氯仿溶液，充分混匀并置于4℃静置，于6h、12h、18h、24h取样，4℃8000rpm离心15min，将上清做适当稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。每个时间点做3个重复，实验重复3次。结果表明：在不同浓度的氯仿溶液中，该噬菌体的效价均未发生显著性变化。说明该噬菌体对氯仿不敏感，无囊膜。

实施例9、噬菌体的稳定性

探索实施例4获得的噬菌体的稳定性，具体操作如下：

稳定性的测定包括：室温、4℃、-20℃和-80℃下保存三个月的稳定性。测定方法采用双层琼脂平板法，以05L189为指示菌。

将该噬菌体液分别做如下保存：在噬菌体液中加入终浓度为20％的甘油，分装多管后于室温、4℃、-20℃和-80℃不同温度保存；另将噬菌体原液分装多管后直接置于室温、4℃、-20℃和-80℃不同温度保存，用双层琼脂平板法测定不同保存条件下噬菌体的效价。结果显示：是否加有20％甘油对噬菌体的稳定性影响不明显。其中，-20℃和-80℃是最好的保存方法；4℃只适合短暂放置，不适合长期保存；而室温保存效果最差，在室温条件下，1个月内噬菌体的效价便下降7个指数级。结果见表2。

实施例10、噬菌体的体外裂菌能力测定

探索实施例4获得的噬菌体的体外裂菌能力，具体操作如下：

噬菌体的体外裂菌能力测定包括：噬菌体的液体裂菌实验以及环境抑菌、杀菌实验。测定方法采用液体培养法和固体平板法，以MRSA菌株PNB25和DL57-3为指示菌。

液体裂菌实验：将指示菌培养至对数生长前期，分别以MOI＝1加入制备好的噬菌体，对照组加入等体积的噬菌体稀释液，37℃180rpm振荡培养，每隔30min取样测定OD₆₀₀值。结果显示：在加入该噬菌体1h后，两个实验组的菌液OD₆₀₀值均开始显著下降，在加入噬菌体2h后，实验组菌液OD₆₀₀值几乎降为0，且在之后的3h内保持不变。结果如图3所示。

模拟环境抑菌实验：取新鲜制备的BHI固体平板，做噬菌体喷雾处理，具体方法如下：将平板分别做噬菌体的喷雾1次(约110μL，10⁸个噬菌体)、喷雾2次和喷雾3次的处理，对照组喷雾等量的噬菌体稀释液，37℃培养箱正置放置30min，待噬菌体液大部分被吸附在平板上后，每个处理组分别涂布适量的菌液。于恒温培养箱37℃倒置培养12h后，对每组平板进行菌落计数。每个稀释度做3个重复，实验重复3次。结果显示：与对照组相比，事先经噬菌体喷雾处理后的平板上，细菌菌落个数均明显减少甚至无菌落生长。表明该噬菌体对细菌有很好的抑制作用。结果如图4所示。

模拟环境杀菌实验：将指示菌培养至对数生长期，取适当不同量的细菌涂布到BHI固体平板上，37℃培养箱正置培养30min后，对每个稀释度的细菌平板分别做噬菌体喷雾1次(约110μL，10⁸个噬菌体)、喷雾2次和喷雾3次的噬菌体喷雾处理，37℃培养12h后，对每组平板进行菌落计数。结果显示：经该噬菌体喷雾处理后，能有效减少甚至完全杀死细菌，表明该噬菌体对细菌有很好的裂解效果，可作为环境消毒剂或外喷治疗类药物。结果如图5所示。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

表1噬菌体SLPW的裂菌谱

注：++++表示极强裂解性，+++表示较强裂解性，++表示较弱裂解性，+表示弱裂解性，-表示不裂解。

表2不同保存方法对噬菌体效价的影响

Claims (9)

1.一种可裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体。

2.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体头部呈现正六边形外廓，直径48nm～51nm，含非收缩性的尾部，宽5nm～8nm、长18nm～21nm，为短尾噬菌体。

3.一种如权利要求1或2所述的噬菌体的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

随机采集土壤、粪便、鼻拭子样品以及健康猪群的粪便样品，制备样品的无菌滤液；

将所述无菌滤液进行富集后，得到噬菌体原液；

用所述噬菌体原液，采用双层琼脂平板法，采用耐药性金黄色葡萄球均作为指示菌，筛选噬菌体斑；

对所述噬菌体斑采用双层琼脂平板法分离出噬菌体斑SLPW；

采用液体培养的方法，利用噬菌体斑SLPW制备噬菌体。

4.如权利要求3所述的分离方法，其特征在于，还包括如下步骤：

观察噬菌体的形态，采用磷钨酸负染法，在透射电镜下观察该噬菌体的形态特征；

以金黄色葡萄球菌05L189为指示菌，采用双层琼脂平板法测定该噬菌体的效价；

确定所述噬菌体的裂菌谱；

测定所述噬菌体的理化特性，所述理化特性包括热稳定性、pH稳定性、紫外线灭活实验和氯仿敏感性；

确定所述噬菌体的稳定性，所述稳定性为所述噬菌体分别在室温、4℃、-20℃和-80℃下保存三个月的稳定性；

确定所述噬菌体的液体裂菌效果以及环境抑菌、杀菌效果。

5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述噬菌体原液的制备方法为：取经无菌检验的滤液30mL与等体积的BHI培养基混匀后，加入处于对数生长期的噬菌体宿主菌金黄色葡萄球菌3mL，在37℃、165rpm下振荡培养过夜，次日在4℃、12000rpm下离心15min，取上清30mL，分别加入等体积的BHI培养基和宿主菌增菌液1mL，37℃静置30min后，165rpm振荡培养12h后，4℃12000rpm离心15min。取上清15mL，加入等体积的BHI培养基及宿主菌增菌液0.6mL，室温静置30min，37℃165rpm振荡培养4h；4℃12000rpm离心20min，收集上清并用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到噬菌体原液；

所述噬菌体斑的双层琼脂平板法筛选的具体操作为：分别以9株金黄色葡萄球菌、18株MRSA和VRSA菌株、10株食源性菌株及17株临床分离株共计54株菌株为指示菌，分别取300μL步骤二中富集得到的噬菌体原液，与54株过夜培养的300μL菌液分别混匀，轻轻漩涡振荡后于37℃孵育20min，加入40℃左右的上层琼脂中，混匀后迅速浇注在底层平板—BHI培养基固体平板上，室温放置15min，待其凝固后，倒置于37℃培养箱培养11h～13h，筛选能形成噬菌斑的平板；

所述噬菌体斑SLPW的分离方法为：选取噬菌斑生长均匀的双层琼脂平板，挑取单个噬菌斑，接种于1mL BHI培养基中，37℃培养2h～3h后，4℃、12000rpm下离心10min，收集上清经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存。将该液体做适当稀释，基于双层琼脂平板法，对单个噬菌斑进行上述反复纯化，最终使双层琼脂平板上的噬菌斑形态和大小完全一致，即获得了纯化的噬菌体分离株，为SLPW；

所述噬菌体的效价的测定方法为：将纯化好的噬菌体液用BHI培养基进行适当稀释，采用双层琼脂平板法，取100μL的噬菌体稀释液与等体积的指示菌混匀后倒双层琼脂平板，于37℃培养箱倒置培养11h～13h。选取30个～300个噬菌斑的平板进行计数，最终得出原噬菌体液的噬菌体数，即效价；

所述噬菌体的裂菌谱的确定方法为：分别以20株MRSA和VRSA菌株、20株食源性菌株、20株临床分离菌株、猪链球菌、大肠杆菌参考株MC1061共62株作为指示菌；取300μL培养至对数早期的待测菌株加入45℃左右的上层琼脂培养基中，混匀后倒入预先制备好的BHI固体琼脂平板上，待平板凝固且表面干燥后，取20μL效价约10⁸PFU/mL的噬菌体SPLW滴加至平板表面，待菌液吸收后置37℃培养过夜，观察噬菌体对菌株的裂解情况；

所述噬菌体的热稳定性的测试方法为：将噬菌体原液稀释至10⁸PFU/mL，取1mL于无菌EP管中，分别于25℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中作用1h，待作用时间结束后立即取出置于冰上冷却，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个温度做3个重复，实验重复3次；

所述噬菌体的pH稳定性的测试方法为：所选取的pH值梯度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，分别取0.8mL不同pH值的BHI培养基于无菌EP管中，经37℃水浴10min，待温度平衡后，分别加入0.2mL效价为10⁸PFU/mL的噬菌体，37℃水浴1h后，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价；

所述噬菌体的紫外线灭活实验具体为：将噬菌体悬浮液置于30W的紫外灯下35cm处1h，每隔10min取样，并将噬菌体进行适当倍比稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。每次取样做3个重复，实验重复3次；

所述噬菌体的氯仿敏感实验具体为：向噬菌体悬浮液中加入5v/v％、25v/v％、50v/v％、75v/v％的氯仿溶液，充分混匀并置于4℃静置，于6h、12h、18h、24h取样，4℃、8000rpm下离心15min，上清用BHI液体培养基进行倍比稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价；

所述噬菌体的环境杀菌效果测试方法为：取新鲜制备的BHI固体平板，做噬菌体喷雾处理，具体方法如下：将平板分别做噬菌体的喷雾1次、喷雾2次和喷雾3次的处理，对照组喷雾等量的噬菌体稀释液，每个平皿分别于喷雾前或喷雾后涂布适量的MRSA菌株PNB25和DL57-3，于恒温培养箱37℃倒置培养12h后，对每组平板进行菌落计数。

6.如权利要求5所述的分离方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌包括食源性菌株、临床分离菌株、MRSA菌株和VRSA菌株。

7.一种利用权利要求1所述的噬菌体裂解不同来源的耐药性金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用三次喷雾的方法，将噬菌体喷雾在涂布细菌的平板中，37℃培养12h后，对每组平板进行菌落计数。

8.如权利要求1所述的裂解方法，其特征在于，所用的缓冲液包括PBS缓冲液、CH₃COOH-CH₃COONa缓冲液、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、HCl-Tris缓冲液中的一种。

9.如权利要求1所述的裂解方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为10～20mM、裂解酸度为pH 3～12、裂解温度为25～60℃。