CN110592028A - 一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法包括培养基及试剂，水样的处理，噬菌体的富集及噬菌体的分离，观察现象，发现双层平板上出现大块透明斑点，证明成功分离出约氏不动杆菌噬菌体。本发明的有益效果在于噬菌体分离更加快捷准确，实验周期短，实验操作要求不高，并且极大地提高了噬菌体分离的成功率，具有相当高的实际应用性和应用前景。

Description

一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法。

背景技术

约氏不动杆菌(Vibrio parahaemolyticus)属于不动杆菌属，广泛存在于土壤，海洋及海洋生物体表，淡水及淡水鱼类肠道内，该菌粘附力极强，易在各类医用材料上粘附，而可能成为贮菌源。此外，本菌还存在于健康人皮肤、咽部，也存在于结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中。约氏不动杆菌的传播途径主要有接触传播和空气传播，易感者为低抵抗力的老人，早产儿及新生儿，容易引发肺部感染、伤口及皮肤感染、泌尿系统感染，感染者易患菌血症及脑膜炎等。目前，使用药物治疗不动杆菌引发的疾病是最主要的方式，然而不动杆菌的耐药率呈上升趋势，有的上升较快(如环丙沙星)，耐药率一直保持在较高水平的有氨苄西林、头孢唑啉及氯霉素等。耐药率尚较低的有亚胺培南-西司他丁、头孢他啶、头孢哌酮-舒巴坦、氨苄西林-舒巴坦，哌拉西林-他唑巴坦及阿米卡星等。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，根据其对宿主菌的作用方式，噬菌体可分为烈性噬菌体和温和性噬菌体。噬菌体治疗的原理就是利用它能对致病菌起裂解作用，降低其密度，进而减少或避免致病菌感染或发病的机会，达到治疗和预防疾病的目的。噬菌体治疗的优势有以下几点：第一，专一性强，只针对某一特定的致病菌，对其他菌群无伤害；第二，指数增殖的能力，保证有足够的噬菌体；第三，给药方式多样，疗效持久；第四，细菌很难产生抗药性；第五，无药物残留；第六，研制开发周期短、成本低。

约氏不动杆菌噬菌体是一类以约氏不动杆菌为宿主的噬菌体，该噬菌体能够特异、高效裂解约氏不动杆菌，因此我们可以利用约氏不动杆菌噬菌体治疗由约氏不动杆菌引发的疾病。然而，目前国内尚未有约氏不动杆菌噬菌体分离相关专利，本专利将创新性的建立一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法。

发明内容

本发明涉及一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法，该发明能够保证高效分离约氏不动杆菌噬菌体，将为解决由约氏不动杆菌感染引发的疾病提供新的防治方法。由于约氏不动杆菌噬菌体具有严格的宿主特异性，通过把握约氏不动杆菌噬菌体这一特性对其进行分离。首先，广泛地采取污水废水、排泄物以及各种养殖水体；接下来，从这些水体中进行细菌分离，明确水体存在约氏不动杆菌，由于噬菌体的广泛存在性，因此认为此水体中必定含有约氏不动杆菌噬菌体；最后，利用已得到的约氏不动杆菌为宿主菌，从相应的水体或者环境中分离约氏不动杆菌噬菌体，一举成功分离得到约氏不动杆菌噬菌体。本发明的有益效果是相对于目前普遍存在的噬菌体分离技术，此技术更加快捷准确，实验周期短，实验操作要求不高，并且极大地提高了噬菌体分离的成功率，具有相当高的实际应用性和应用前景。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：培养基及试剂

1.5％TSB固体培养基、0.5％TSB半固体培养基、3×TSB液体培养基、TSB液体培养基、SM缓冲液；

步骤2：水样的处理

获得水样后将其上下颠倒混匀，取30ml水样于50ml离心管中，4℃环境下9000rpm离心30min，得到上清与沉淀，噬菌体存在于上清中，而约氏不动杆菌存在于沉淀中，取上清液置于一新的50ml离心管，向上清液中加入CaCl至终浓度1mmol/L，溶解后过0.22μm滤膜除去杂菌，将滤液放入冰箱4℃冷藏备用，将沉淀用适量PBS磷酸盐缓冲液重悬，利用涂布法在含1.5％TSB固体培养基平板上涂布，在培养箱中28℃过夜培养；

步骤3：噬菌体的富集

取滤液15ml，加入3×TSB液体培养基以及1ml培养至对数期的约氏不动杆菌菌液，混合后置于无菌三角摇瓶中，于振荡培养箱中28℃，200rpm过夜培养，取培养物于50ml无菌离心管中，在4℃条件下9000rpm离心30min，将上清液过0.22μm滤膜除去细菌，将滤液4℃保存以备用；

步骤4：噬菌体的分离

采用传统的双层平板法进行约氏不动杆菌噬菌体分离的验证，下层培养基为含1.5％TSB的固体培养基，上层培养基为含有0.5％TSB的半固体培养基；

(1)制备底层平板，将融化的无菌1.5％TSB固体培养基均匀地倒入平板中，冷却后置于4℃冰箱保存；

(2)取400μl培养至对数期约氏不动杆菌菌液与4ml 0.5％TSB半固体培养基混合均匀，将其均匀倒入已制备好的底层平板中，待其冷却；

(3)取10μl 2.3中滤液滴在制好的双层平板上，静置30min待其水分蒸发之后，于培养箱中28℃过夜培养；

观察现象，发现双层平板上出现大块透明斑点，证明成功分离出约氏不动杆菌噬菌体。

附图说明

图1约氏不动杆菌噬菌体双层平板噬菌斑形态。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

1实验材料

1.1水体来源

为了得到约氏不动杆菌噬菌体，本实验从青岛市城阳区海鲜批发市场中分别取得了3种不同的水产品暂养水体：A水体为鲤鲫鱼混合暂养水体；B水体为章鱼暂养水体；C水体为石斑鱼暂养水体。

1.2主要培养基及试剂为TSB胰酪大豆胨液体培养基

(1)1.5％TSB固体培养基(100ml)：

称取胰蛋白胨(TRYPTONE)1.7g，大豆蛋白胨(Soya Peptone)0.3g，无水葡萄糖0.25g，氯化钠0.5g，无水磷酸氢二钾0.25g，琼脂1.5g，溶于100ml ddH₂O中，高温高压灭菌后置于4℃保存备用。

(2)0.5％TSB半固体培养基(100ml)：

称取胰蛋白胨(TRYPTONE)1.7g，大豆蛋白胨(Soya Peptone)0.3g，无水葡萄糖0.25g，氯化钠0.5g，无水磷酸氢二钾0.25g，琼脂0.5g，溶于100ml ddH₂O中，高温高压灭菌后置于4℃保存备用。

(3)3×TSB液体培养基(100ml)：

称取胰蛋白胨(TRYPTONE)5.1g，大豆蛋白胨(Soya Peptone)0.9g，无水葡萄糖0.75g，氯化钠1.5g，无水磷酸氢二钾0.75g，溶于100ml ddH₂O中，高温高压灭菌后置于4℃保存备用。

(4)TSB液体培养基(100ml)：

称取胰蛋白胨(TRYPTONE)1.7g，大豆蛋白胨(Soya Peptone)0.3g，无水葡萄糖0.25g，氯化钠0.5g，无水磷酸氢二钾0.25g，溶于100ml ddH₂O中，高温高压灭菌后置于4℃保存备用。

(5)SM buffer：

氯化钠5.8g，MgSO₄·7H₂O 2g，明胶0.1g，Tris-HCl(1mol/L,pH 7.5)50ml,补ddH₂O至1L，摇匀并充分溶解，高压灭菌后置于4℃保存备用。

1.3主要仪器如表1所示。

表1实验仪器

2实验方法

2.1水样的采集与处理

水样采集于山东省青岛市城阳区海鲜批发市场。获得水样后将其上下颠倒混匀，A号，B号，C号水体分别取30ml水样于50ml离心管中，4℃环境下9000rpm离心30min，得到上清与沉淀(噬菌体存在于上清中，而约氏不动杆菌存在于沉淀中)。取上清液置于一新的50ml离心管，向上清液中加入CaCl至终浓度1mmol/L，溶解后过0.22μm滤膜除去杂菌，将滤液放入冰箱4℃冷藏备用。将A、B、C号沉淀用适量PBS重悬，利用涂布法在含1.5％TSB固体培养基平板上涂布，在培养箱中28℃过夜培养。

2.2细菌的采集与鉴定

从上述3个过夜培养的平板中分别挑取3个单菌落，置于含20μl PBS的1.5ml EP管(微型离心管)中混合均匀，编号为A1-A3，B1-B3，C1-C3。各取2μl混合液作为菌落PCR(聚合酶链式反应)的模板，用16SrDNA通用引物27F和1492R进行菌落PCR。然后分别向1.5ml EP管中加入1ml液体TSB培养基于振荡培养箱中28℃，200rpm培养10-12h。通过测序结果比对后将目的菌液进行扩大培养(约10ml左右)至对数期。表2为PCR反应体系。

表2

PCR反应条件为：(1)94℃预变性，5min；(2)94℃变性，30s；(3)55℃退火，30s；(4)72℃延伸，1min；循环数为34个循环；(5)72℃再延伸，8min。将PCR产物送至生物公司测序，将测序结果进行Blast比对，比对结果显示，C2号菌为约氏不动杆菌，成功从水体中分离得到目的菌株。

2.3噬菌体的富集

取2.1中C号滤液约15ml，加入3×TSB液体培养基以及1ml培养至对数期的约氏不动杆菌菌液，混合后置于无菌三角摇瓶中，于振荡培养箱中28℃，200rpm过夜培养。取上述培养物于50ml无菌离心管中，在4℃条件下9000rpm离心30min，将上清液过0.22μm滤膜除去细菌，将滤液4℃保存以备用。

2.4噬菌体的分离

采用传统的双层平板法进行约氏不动杆菌噬菌体分离的验证。下层培养基为含1.5％TSB的固体培养基，上层培养基为含有0.5％TSB的半固体培养基。

(1)制备底层平板。将融化的无菌1.5％TSB固体培养基均匀地倒入平板中，冷却后置于4℃冰箱保存。

(2)取400μl培养至对数期约氏不动杆菌菌液与4ml 0.5％TSB半固体培养基混合均匀，将其均匀倒入已制备好的底层平板中，待其冷却。

(3)取10μl 2.3中滤液滴在制好的双层平板上，静置30min待其水分蒸发之后，于培养箱中28℃过夜培养。

观察现象，发现双层平板上出现大块透明斑点，证明成功分离出约氏不动杆菌噬菌体。

2.5噬菌体的纯化

本实验依然是采用双层平板法进行约氏不动杆菌噬菌体的纯化。

(1)挑取噬菌斑。用注射器针头在噬菌斑周围刺穿划一区域，挑取含噬菌斑的上层培养基置于适量(约1ml)SM buffer中，将其破碎均匀后于摇床振荡4h。

(2)将上述液体过0.22μm滤膜除去杂质，取100μl滤液梯度稀释至10^-6，其余置于4℃冰箱保存备用。

(3)取10μl各稀释梯度的约氏不动杆菌噬菌体，分别加入400μl培养至对数期的约氏不动杆菌菌液，于培养箱中28℃培养30min，让噬菌体充分侵染到宿主菌中去。然后将共培养的液体与4ml 0.5％TSB半固体培养基混合均匀倒入已制备好的底层平板中，于培养箱中28℃过夜培养，观察噬菌斑的形态大小是否均匀。

按此操作进行纯化3-5次，可得到形状大小均匀一致的噬菌斑，即为较纯的约氏不动杆菌噬菌体。

2.6噬菌体的洗脱

尽量选取纯化后形状大小均匀一致，噬菌斑连成片的双层平板进行约氏不动杆菌噬菌体的洗脱，方便得到效价较高的噬菌体。

(1)在超净工作台中沿板壁缓慢向长有噬菌斑的平板中加入5ml SM buffer，置于摇床上摇动4h以洗脱噬菌体。

(2)将洗脱液过0.22μm滤膜以除去细菌，所得滤液即为纯化的约氏不动杆菌噬菌体。

3实验结果

图1约氏不动杆菌噬菌体双层平板噬菌斑形态。本实验为了得到约氏不动杆菌噬菌体，首先从3种不同的水体中分离出不同的细菌，对分离得到的细菌进行菌落PCR，将PCR产物送至生物公司测序，发现其中存在以下序列：

CCTATCGGTCCACCGTGGTAGCGTCCTCCTTGCGGTTAGACTACCTACTTCTGGTGCAACAAATTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGGCTTAACCCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTACCTCAGCGTCAGTATTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCATACTCTAGCTTCCCAGTATCGAATGCAATTCCTAAGTTAAGCTCAGGATTTCACATCCGACTTAAAAAGCCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTCGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCCAAGAGTATTAATCTCGGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTAACAACCAAAGGCCT

通过测序结果比对发现从C号水体中成功分离得到一株约氏不动杆菌，因而我们可以确定C号水体中存在约氏不动杆菌噬菌体。利用双层平板法，通过对水体中约氏不动杆菌噬菌体进行分离纯化，本实验成功地从C号石斑鱼暂养水体中分离出一株较纯的约氏不动杆菌噬菌体。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种约氏不动杆菌噬菌体分离方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤1：培养基及试剂

1.5％TSB固体培养基、0.5％TSB半固体培养基、3×TSB液体培养基、TSB液体培养基、SM缓冲液；

步骤2：水样的处理

获得水样后将其上下颠倒混匀，取30ml水样于50ml离心管中，4℃环境下9000rpm离心30min，得到上清与沉淀，噬菌体存在于上清中，而约氏不动杆菌存在于沉淀中，取上清液置于一新的50ml离心管，向上清液中加入CaCl至终浓度1mmol/L，溶解后过0.22μm滤膜除去杂菌，将滤液放入冰箱4℃冷藏备用，将沉淀用适量PBS磷酸盐缓冲液重悬，利用涂布法在含1.5％TSB固体培养基平板上涂布，在培养箱中28℃过夜培养；

步骤3：噬菌体的富集

取滤液15ml，加入3×TSB液体培养基以及1ml培养至对数期的约氏不动杆菌菌液，混合后置于无菌三角摇瓶中，于振荡培养箱中28℃，200rpm过夜培养，取培养物于50ml无菌离心管中，在4℃条件下9000rpm离心30min，将上清液过0.22μm滤膜除去细菌，将滤液4℃保存以备用；

步骤4：噬菌体的分离

采用传统的双层平板法进行约氏不动杆菌噬菌体分离的验证，下层培养基为含1.5％TSB的固体培养基，上层培养基为含有0.5％TSB的半固体培养基；

(1)制备底层平板，将融化的无菌1.5％TSB固体培养基均匀地倒入平板中，冷却后置于4℃冰箱保存；

(2)取400μl培养至对数期约氏不动杆菌菌液与4ml 0.5％TSB半固体培养基混合均匀，将其均匀倒入已制备好的底层平板中，待其冷却；

(3)取10μl 2.3中滤液滴在制好的双层平板上，静置30min待其水分蒸发之后，于培养箱中28℃过夜培养；

观察现象，发现双层平板上出现大块透明斑点，证明成功分离出约氏不动杆菌噬菌体。