CN107686832B - 新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，提供了新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用，具体包括副溶血性弧菌噬菌体VP46，保藏编号CCTCC NO：M2016290；副溶血性弧菌噬菌体VP48，保藏编号CCTCC NO：M2016291；或副溶血性弧菌噬菌体VP7，保藏编号CCTCC NO：M2016289。该噬菌体为严格烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性，宿主范围较广，低浓度下对宿主菌具有高毒性；所述噬菌体的DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；且于培养液中室温下稳定存活，4℃下超过12个月；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可实现大规模工业生产。

Description

新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及新的副溶血性弧菌噬菌体性、其组合物以及它们的制备方法和应用。
背景技术
南美白对虾是当前世界养殖产量最高的甲壳类养殖品种，其适盐度广、生长迅速、出肉率高，于我国沿海及内陆地区得到大范围养殖。2012年我国南美白对虾养殖总产量达145万吨，占对虾养殖产量85％，产值超过300亿元，是单一品种总产量和产值最高的甲壳类养殖品种。但近年来全球南美白对虾急性肝胰腺坏死综合征(Acute HepatopancreaticNecrosis Syndrome，AHPNS)的爆发使其养殖业遭受重创。AHPNS最早发生于2009年，该病由美国亚利桑那大学Lightener教授于2011年首次报道，Lightner(2011)发现AHPNS病原为一种罕见的副溶血性弧菌，Lightner(2013)与罗竹芳(2013)均证实AHPNS由携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌引起，对虾感染该病原菌后表现出生长缓慢、螺旋式游动、体色发白、肝胰腺肿大且褪色，部分虾还出现明显的肝胰腺萎缩。目前除印度与印尼外，东南亚各主要对虾养殖国均受到AHPNS的侵染：马来西亚2011年对虾产量减少约3万吨；越南2011年对虾受感染养殖面积达9.0万公顷；最大的南美白对虾生产国-中国，产量由2013的153万吨下降到2014年的130万吨左右，同时于2013年从对虾净出口国变为对虾净进口国。AHPNS爆发后，虾塘排塘率高达80％以上，养殖成功率不足20％。养殖户损失惨重，许多虾农改养其他养殖品种，南美白对虾养殖面积逐年减少，AHPNS困扰着全球对虾的养殖。
目前主要通过抗生素、消毒剂、微生物制剂等药物对AHPNS进行防治，但随着养殖过程中各类抗生素的滥用使得副溶血性弧菌大量出现耐药株，甚至是多重耐药株；而且随着多种新型抗生素的出现，副溶血性弧菌的耐药谱在不断扩展，目前许多菌株均对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、氨苄西林、青霉素等抗生素耐药。吴蓓蓓等人(《中国人兽共患病学报》，2011,27(5)381-385)发现宁波地区海产品中82％以上的分离菌株可耐受6种以上抗生素；写腊月等人(《海洋渔业》2011,33(4)442-446)测定来自上海、江苏、海南等地海水养殖区域内的副溶血性弧菌耐药性后发现其80％以上对3种以上抗生素耐药，说明水产养殖中副溶血性弧菌耐药性已十分严重。抗生素等药物的大量使用，还造成了对虾体内含有残留的抗生素类物质，人长时间摄入该类食品后，易导致抗生素类物质蓄积在人体内，引起各种组织器官病变甚至癌变。
水产养殖中抗生素的滥用已成为当前渔业细菌性疾病防控的突出问题。病原菌耐药菌株的出现不仅对经济造成损失、而且也极大威胁着人类健康、克服细菌耐药性已成为目前的关注重点。
噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。宁淑香等人(《水产科学》2000,19(2)14-16)自海水中分离噬菌体并对其特性进行了初步研究。蔺红苹等人(《水产科学》2010,29(5)291-294)将噬菌体投入对虾养殖水体中观测其防治效果，结果发现噬菌体可有效清除水体中副溶血性弧菌。丁云娟(《中国海洋大学硕士学位论文》2012)发现副溶血性弧菌噬菌体qdvp001可对牡蛎体内副溶血性弧菌具有一定净化作用。彭勇(《中国海洋大学硕士学位论文》2013)发现了副溶血性弧菌噬菌体VPp1、VPp2、VPp3仅可识别12株供试副溶血性弧菌中的3株，其裂解率为25％。
CN101798568A公开了一株副溶血性弧菌噬菌体，以用于治疗和预防由副溶血性弧菌引起的水体污染及水产生物病害；CN105200028A公开了一种来源于副溶血性弧菌噬菌体的内溶素及其应用，以用于检测副溶血性弧菌或抑制其生长。目前，关于副溶血性弧菌噬菌体的研究主要集中于噬菌体的分离及特性方面，目前还尚未发现针对AHPNS病原菌的噬菌体及其应用方面的研究鲜见报道。因此，丰富广谱性噬菌体资源，寻找针对AHPNS病原菌的强裂解性噬菌体是本技术领域对于AHPNS病原菌防治中急需解决的问题。而从对虾养殖水体中筛选烈性噬菌体是研发新型抑菌制剂以促进噬菌体疗法发展的一条有效途径。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供了新的副溶血性弧菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用，特别是针对AHPNS病原菌的副溶血性弧菌噬菌体。本发明所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)，保藏编号为CCTCC NO.M2016290，其生物学特征为：在电子显微镜下副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)呈现为1个直径约60nm的多面体立体对称的头部，及一个短收缩尾部(图4)。基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为短尾噬菌体科(Podoviridae)。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)噬菌体全基因组序列大小约为43kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(megablast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)与短尾噬菌体科(Podoviridae)的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，VP46噬菌体鉴定为短尾噬菌体科(Podoviridae)的新种，即副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)具有如SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)具有具线性双链DNA。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016290。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)，保藏编号为CCTCC NO.M2016291；其生物学特征为：在电子显微镜下VP48噬菌体呈现为1个直径约60nm的多面体立体对称的头部，及一个短收缩尾部(图5)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为短尾噬菌体科(Podoviridae)。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的全基因组序列大小约为43kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(megablast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)序列与可对比噬菌体序列相似度均较低，小于70％。依其形态特征可将副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)分类为短尾噬菌体科(Podoviridae)，但序列比对结果显示其与已知噬菌体亲缘关系均较远，无法进行匹配。因此副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)可鉴定为短尾噬菌体科(Podoviridae)的新种、即副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)。
作为实施方案之一、本发明所述短尾噬菌体科(Podoviridae)VP48具有SEQ IDNO：2的核苷酸序列。
作为实施方案之一、本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)具有线性双链DNA。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M2016291。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)，保藏编号为CCTCC NO：M2016289；其生物学特征为：在电子显微镜下VP7噬菌体呈现为1个直径约60nm的多面体立体对称的头部，及一个短收缩尾部(图6)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为短尾噬菌体科(Podoviridae)。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)全基因组序列大小约为43kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，VP7噬菌体与短尾噬菌体科(Podoviridae)的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)被鉴定为短尾噬菌体科(Podoviridae)的新种，即VP7噬菌体鉴定为副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)具有线性双链DNA。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M2016289。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)不含毒力基因或不良基因。
作为实施方案之一，本发明所述的毒力基因或不良基因是指表10所记载的毒力基因或不良基因。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)不识别绝大部分非致病性细菌。
作为实施方案之一，所述非致病性细菌包括副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)不识别188株非致病性细菌、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)不识别的188株非致病性细菌、或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)不识别的191株非致病性细菌，其中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)都不识别的非致病性细菌包括187株非致病性细菌。
作为实施方案之一，本发明上述非致病性细菌是指表12所记载的副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticusphage VP7)不识别的非致病性细菌。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)不识别非宿主性致病性细菌。
作为本发明实施方案之一，所述非宿主性致病性细菌为39株非宿主性致病性细菌；以上所述非宿主性致病性细菌是指表13所具体记载的副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticusphage VP7)所不识别的非宿主性株致病性细菌。
作为实施方案之一，本发明另一目的提供了一种副溶血性弧菌噬菌体的应用，具体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)在裂解携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌中的应用。
作为本发明实施方案之一，所述的携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌包括副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)可裂解的22株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)可裂解的23株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌、或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)可裂解的24株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌。
其中，所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)都可裂解的包括24株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌；其中以上所述的携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌是指表11所记载的副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)可裂解的携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌。
作为本发明实施方案之一，所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的效价为109pfu/ml、1010pfu/ml、1010pfu/ml。
本发明还提供一种副溶血性弧菌噬菌体的制备方法，具体提供一种副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)、或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticusphage VP7)的制备方法。
本发明方法中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)是从福建海产品样本中分离得到的；所述副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phageVP7)是从墨西哥海水样本中分离得到的。
作为实施方案之一，本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的制备方法包括：
1-1)采集福建海产品样本或墨西哥海水样本离心取上清液并除菌，然后与TSB液体培养基与处于对数期的携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌均匀混合，于30℃下150r过夜摇培，富集噬菌体；
1-2)将样本富集液离心，取上清液除菌得到含有噬菌体的滤液，取滤液与其携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌宿主菌液均匀混合，室温下静置使其与细菌表面受体充分结合；
1-3)将上述混合液加入半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上30℃下培养，形成噬菌斑后取噬菌斑，接种于液体TSB培养基中，加入携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌菌液并混匀过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态；
1-4)重复步骤3)的操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑，即得副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)。其中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)的保藏编号为CCTCC NO：M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏编号为CCTCC NO：M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)保藏编号为CCTCC NO：M2016289。
经过核苷酸测序，所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticusphage VP46)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
本发明进一步还提供一种副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticusphage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的发酵方法，所述方法包括：
2-1)取副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的宿主菌菌落，接种到TSB(2％NaCl)培养液中振荡得到宿主菌悬液；
2-2)将菌悬液稀释转接到TSB(2％NaCl)培养液，摇培至对数前期并测定其菌悬液浓度；
2-3)调节副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的发酵初始pH值为7；
2-4)采用火焰接种法接种，向TSB液体培养基中分别接入噬菌体和对数期宿主菌液并发酵，发酵过程中通入无菌空气，并加入消泡剂；
2-5)发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液取出并离心，上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存，即得。
作为实施方案之一，本发明所述制备或发酵方法中，所述TSB培养液的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
所述TSB(2％NaCl)培养液的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠20g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
所述TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白酶消化物5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
作为实施方案之一，本发明还提供一种噬菌体的组合物，所述组合物为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)中的任意两种或三种的组合物。
作为示例性的说明，如副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticusphage VP46)和副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的组合物、副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的组合物、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)的组合物，以及副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的组合物，它们的之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
作为进一步的实施方案之一，所述噬菌体组合物包括含有副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticusphage VP7)；作为更进一步的实施方案之一，所述组合物中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticusphage VP7)的生物量比为1：1：1。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)在噬菌体效价、裂解携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌的最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、温度对噬菌体存活稳定性的影响等方面具有如下的生理特性：具有较高的效价(参见表1)，其中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)感染携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌的最佳MOI分别为1:1000、1:10及1:1000；并具有高度亲和性及裂解能力的烈性噬菌体，可迅速裂解携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌(表2-表4)；所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)在pH为8时生长活性所受影响最小，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)最适pH为6，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)则为8(表5)；对温度的热稳定性均相对较好；适宜4℃低温存放。
而且所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)无毒力基因或不良基因；对携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌的裂解范围：供试噬菌体具有较宽的宿主范围，可识别所有24株携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)对非致病性细菌的裂解：仅与无PirA、PirB基因副溶血性弧菌的小部分菌株(196株供试无PirA、PirB基因副溶血性弧菌菌株中的24株)反应。更进一步地、本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticusphage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的组合物无法识别包括7株金黄色葡萄球菌、2株嗜水气单胞菌、6株大肠杆菌及172株无PirA、PirB基因副溶血性弧菌在内的非致病性细菌(表12)。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别39株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株。
本发明的所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)具有如下的优势：其为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围；其DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存12个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的3株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP)能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本发明中所述副溶血性弧菌噬菌体VPp1、VPp2和VPp3的鸡尾酒组合可裂解24株携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌，裂解率达100％(参见表11)，且可识别24株无PirA、PirB基因的副溶血性弧菌，具有更强的裂解性及更宽的宿主谱。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7或其组合物可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防由携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌引起的南美白对虾肝胰腺坏死综合征的药剂或试剂。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7或其组合物的产品形式包括但不限于以载体携带、浓缩喷洒或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、生活水体等范围；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于含水性载体；浓缩喷洒形式包括但不限于虾苗喷洒等；药剂浸泡形式包括但不限于漂洗剂等。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7可选取一株或多株被制备成作为有效成分应用于携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌的快速检测试剂或试剂盒。其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。
本发明所述副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7或其组合物被制备常作为有效成分应用于环境消毒的各种产品，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于消毒剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、海水等。
附图说明
图1：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)的平板培养照片；
图2：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)的平板培养照片；
图3：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的平板培养照片；
图4：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)的透射电子显微镜照片；
图5：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)的透射电子显微镜照片；
图6：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)噬菌体透射电子显微镜照片；
图7：实施例1中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)及副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)噬菌体基因组大小；
图8：实施例4中副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)不同pH值下的效价；
图9：实施例4中副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)不同pH值下的效价；
图10：实施例4中副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phageVP7)不同pH值下的效价。
所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M2016290；
所述副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M2016291；
所述副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M2016289。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，
所述TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
所述TSB(2％NaCl)培养液的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠20g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
所述TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白酶消化物5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂7g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。
副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的组合物(1：1：1)均为按照实施例8的方法制备。
实施例1副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的分离纯化
分别采集福建海产品样本及墨西哥海水样本各50ml，5000rpm离心10min后取20ml上清液并除菌，将其与20ml 2倍TSB液体培养基及2ml处于对数期的携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌菌液(108cfu/ml)均匀混合，于30℃下150r过夜摇培，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液50μl与其宿主携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5ml TSB液体培养基中，加入0.1ml携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌菌液并混匀，30℃下150r过夜摇培，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
自福建海产品样本中共分离得到2株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌噬菌体，其分别为副溶血性弧菌噬菌体VP46、副溶血性弧菌噬菌体VP48；自墨西哥海水样本中共分离得到1株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌噬菌体，为副溶血性弧菌噬菌体VP7。副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48与副溶血性弧菌噬菌体VP7在携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌菌苔上均产生单一的圆形噬菌斑，中心透亮，边缘具晕圈，直径为5-6mm(参见图1、图2、图3)；副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48、VP7透射电子显微镜照片参见图4-6。
副溶血性弧菌噬菌体VP46的保藏编号为CCTCC NO.M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48的保藏编号为CCTCC NO.M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7保藏编号为CCTCCNO.M2016289。经过核苷酸测序，所述副溶血性弧菌噬菌体VP46具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；副溶血性弧菌噬菌体VP48具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；副溶血性弧菌噬菌体VP7具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。图7是副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7基因组大小。
实施例2副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7效价的测定
用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7(由实施例1制得)的原液分别10倍梯度逐级稀释至l07倍。分别取l05、l06及l07稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数
从表1可以得出，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7培养12h后均具有109PFU/ml以上的效价。
表1培养12h后副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的效价
Figure BDA0001070528400000171
实施例3副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7对携带PirA、PirB基因的副溶血副溶血性弧菌弧菌最佳感染复数(MOI)的测定
挑取携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌单个菌落，接种到盛有3mlTSB(2％NaCl)培养液的试管中，30℃摇床中150rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到l0ml TSB(2％NaCl)培养液，30℃150rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数比例分别加入噬菌体VP46、VP48及VP7(由实施例1制备)的纯培养液(实由实施例1制得)和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在30℃摇床中150rpm过夜摇培。培养完毕后5000g离心l0min并收集上清液，测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
结果如表2-表4所示，副溶血性弧菌噬菌体VP46效价达到最高(7.8x109PFU/ml)时，其MOI为1:1000；噬菌体VP48效价达到最高(4.5x109PFU/ml)时，其MOI为1:10；噬菌体VP7效价达到最高(8x109PFU/ml)时，其MOI为1:1000；因而可以确定副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7感染携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌的最佳MOI分别为1:1000、1:10及1:1000。
表2不同感染复数下副溶血性弧菌噬菌体VP46的效价
Figure BDA0001070528400000172
Figure BDA0001070528400000181
表3不同感染复数下副溶血性弧菌噬菌体VP48的效价
MOI VP48(PFU/ml) 宿主菌(CFU/ml) VP48效价(PFU/ml)
1000:1 10<sup>7</sup> 10<sup>4</sup> 2.5x10<sup>5</sup>
100:1 10<sup>7</sup> 10<sup>5</sup> 3.2x10<sup>5</sup>
10:1 10<sup>7</sup> 10<sup>6</sup> 1.53x10<sup>6</sup>
1:1 10<sup>7</sup> 10<sup>7</sup> 6.7x10<sup>8</sup>
1:10 10<sup>7</sup> 10<sup>8</sup> 4.5x10<sup>9</sup>
1:100 10<sup>7</sup> 10<sup>9</sup> 8.2x10<sup>8</sup>
1:1000 10<sup>7</sup> 10<sup>10</sup> 4.16x10<sup>9</sup>
表4不同感染复数下副溶血性弧菌噬菌体VP7的效价
Figure BDA0001070528400000182
Figure BDA0001070528400000191
实施例4副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的pH稳定性试验
取无菌EP管分别加入不同pH(1-12)的TSB培养基900μl后将上述EP管置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μl菌体纯培养液，室温下静置1h。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。之后分别于4h、8h、24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。
结果如表5、图8-10所示，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7均在pH为5-10范围内处理96h后其效价无明显变化。
表5反应不同时间后副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的pH值稳定性
a.副溶血性弧菌噬菌体VP46的pH值稳定性(起始效价：3.7x108PFU/ml)
Figure BDA0001070528400000192
b.副溶血性弧菌噬菌体VP48的pH值稳定性(起始效价：6.2x108PFU/ml)
Figure BDA0001070528400000193
Figure BDA0001070528400000201
c.副溶血性弧菌噬菌体VP7的pH值稳定性(起始效价：1x109PFU/ml)
Figure BDA0001070528400000202
实施例5副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的热稳定性试验
各取l00μl噬菌体纯培养液分装于无菌EP管中，分别于50℃、60℃、70℃水浴中作用1h及2h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
结果如表6所示，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7最适存活温度均为50℃。3株噬菌体具有良好的热稳定性，在60℃水浴2h后仍有较高的效价；但当温度增加至70℃后，VP46与VP48效价极低，VP7于70℃下作用2h后仍具有106PFU/ml效价，VP7对高温具有良好的耐受性。
表6副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7于不同温度下的效价
a.副溶血性弧菌噬菌体VP46的热稳定性
Figure BDA0001070528400000211
b.副溶血性弧菌噬菌体VP48的热稳定性
Figure BDA0001070528400000212
c.副溶血性弧菌噬菌体VP7的热稳定性
Figure BDA0001070528400000213
实施例6副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的存活稳定性试验
各取5m副溶血性弧菌l噬菌体VP46、VP48及VP7的纯培养液分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
结果如表7-表9所示，4℃条件下副溶血性弧菌噬菌体VP46存放50周效价未降低，副溶血性弧菌噬菌体VP48与VP7存放18周效价未降低，18周后仍有109PFU/ml效价；25℃下噬菌体VP48与VP7存放16周后效价仍为109PFU/ml，而VP46存放12周内效价未降低(109PFU/ml)；30℃下噬菌体VP46、VP48及VP7均可在12周内维持108PFU/ml及以上效价；各保存温度下3株噬菌体均对宿主菌具有较强裂解能力。3株供试噬菌体适宜4℃下存放。
表7副溶血性弧菌噬菌体VP46于不同保存温度下的存活稳定性
Figure BDA0001070528400000214
Figure BDA0001070528400000221
表8副溶血性弧菌噬菌体VP48于不同保存温度下的存活稳定性
Figure BDA0001070528400000222
Figure BDA0001070528400000231
表9副溶血性弧菌噬菌体VP7于不同保存温度下的存活稳定性
Figure BDA0001070528400000232
Figure BDA0001070528400000241
实施例7副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的毒力基因或不良基因缺失检测试验
选取65种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表10)，通过测定副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。
结果显示，3株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。供试噬菌体无不良基因。
表10病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
Figure BDA0001070528400000242
Figure BDA0001070528400000251
Figure BDA0001070528400000261
实施例8副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7对携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌裂解范围试验及副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7组合物的制备
采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别取效价为1x108PFU/ml副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的1:1:1的鸡尾酒组合。挑取24株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌的单菌落分别接种于盛有3ml TSB(2％NaCl)的试管中，150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取10μl噬菌体培养液及VP46、VP48及VP7的鸡尾酒组合液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后30℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表11所示，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7具有较宽的宿主范围。VP46可裂解22株携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌，VP48对携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌的裂解率达96％，VP7则可裂解全部24株供试菌株。而VP46、VP48及VP7(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合液可识别所有供试副溶血性弧菌。说明这些噬菌体具有较宽的宿主谱，同时噬菌体鸡尾酒组合可弥补噬菌体单一应用时宿主谱的局限性，在噬菌体治疗方面具有极大的应用潜力。
表11副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的裂解谱测定结果
Figure BDA0001070528400000262
Figure BDA0001070528400000271
注：++：完全裂解，噬菌斑十分透亮；+：完全裂解，噬菌斑透亮；-：未裂解
实施例9副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7对非致病性细菌的裂解试验
挑取包括无PirA、PirB基因的副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌等在内的211株非致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml TSB的试管中，150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有VP46、VP48及VP7(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后30℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表12所示，在本研究中，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7分别可裂解196株无PirA、PirB基因的副溶血性弧菌菌株中的23株、23株及20株；其鸡尾酒组合仅可识别无PirA、PirB基因的副溶血性弧菌中的24株；所有噬菌体均无法识别金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及嗜水气单胞菌。即，VP46对188株供试细菌无裂解性；VP48对188株供试细菌无裂解性；VP7对191株供试细菌无裂解性。这类交互反应对于噬菌体疗法的应用具有极大帮助。
表12副溶血性弧菌噬菌体及鸡尾酒与211株非致病性细菌的交互反应
Figure BDA0001070528400000281
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Figure BDA0001070528400000331
Figure BDA0001070528400000341
注：++：完全裂解，噬菌斑十分透亮；+：完全裂解，噬菌斑透亮；+/-：微弱裂解，具噬菌斑；-：未裂解。
实施例10副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7与非宿主性致病性细菌的互作试验
挑取39株非宿主性致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml TSB的试管中，150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取10μl噬菌体培养液及含有副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
将噬菌体与非宿主性致病性细菌进行交互反应，结果显示，VP46、VP48及VP7无法识别39株供试非宿主性致病性细菌(表13)。
表13副溶血性弧菌噬菌体及鸡尾酒组合与39株致病性细菌的交互反应
Figure BDA0001070528400000351
Figure BDA0001070528400000361
注：-：未裂解。
实施例11副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的发酵制备
挑取无PirA、PirB基因的副溶血性弧菌HN49单菌落，接种到盛有3mlTSB(2％NaCl)培养液的试管中，30℃摇床中150rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml TSB(2％NaCl)培养液，30℃150rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7发酵制备的体系为8L，发酵培养基为TSB培养基。3株噬菌体发酵培养基的初始pH值均为7。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中分别接入50ml的噬菌体(108PFU/ml)和对数期宿主菌液(109CFU/ml)。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml噬菌体与宿主菌的混合液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
由表14可知，副溶血性弧菌噬菌体VP46与VP48均于发酵12h时效价达最高，分别为4.2x109PFU/ml与8x109PFU/ml；噬菌体VP7则于发酵10h时效价最高(1.3x108PFU/ml)；其后VP7的效价虽有所下降，但整体数量级未发生变化。12h发酵结束后各噬菌体效价均由初始的106PFU/ml升高至108PFU/ml及以上，提高了2个数量级。因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
表14副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48及VP7的发酵动态
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Claims (8)

1.新的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticusphage VP48）或副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticus phage VP7），其中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）的保藏编号为CCTCCNO. M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）的保藏编号为CCTCC NO. M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticus phage VP7）保藏编号为CCTCC NO. M2016289。
2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；或副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticus phage VP7）的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
3.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）或副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticusphage VP7）不含毒力基因或不良基因。
4.权利要求1-3任一所述副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phageVP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）或副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticus phage VP7）在制备裂解携带PirA、PirB基因的副溶血性弧菌药剂或试剂中的应用。
5.权利要求1-3任一所述副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phageVP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）或副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticus phage VP7）制备治疗或预防由携带PirA、PirB基因副溶血性弧菌引起的南美白对虾肝胰腺坏死综合征的药剂或试剂中的应用。
6.一种噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）和副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticusphage VP7）中的任意两种或三种的组合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述噬菌体组合物包括副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）和副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticusphage VP7）。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物中副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46）、副溶血性弧菌噬菌体VP48（Vibrio parahaemolyticus phage VP48）和副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticusphage VP7）的生物量比为1：1：1。
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