CN111925995B

CN111925995B - 一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法

Info

Publication number: CN111925995B
Application number: CN202010633982.3A
Authority: CN
Inventors: 何四龙; 胡怿林; 徐旭凌; 丛郁; 谢晓莉; 乔欢; 陈海; 费文斌; 黄杰; 刘墨; 靳菊
Original assignee: Phagelux Nanjing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Phagelux Nanjing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-04
Filing date: 2020-07-04
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-07-04
Also published as: CN111925995A

Abstract

本发明公开了一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，属于微生物制剂技术领域，其技术方案要点是微生态制剂为噬菌体和益生菌混合物,或噬菌体和益生菌代谢产物的混合物，及其制备过程。本发明使用噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法能够高效利用发酵培养基营养成分，可同批获得水剂和或粉剂，减少废物排放，降低生产成本，同时所制备的微生态制剂强化了噬菌体和益生菌协同抑菌或杀菌的效果。本发明整体工艺简单方便，可操作性强，具有普适性和经济性。

Description

一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及微生物制剂技术领域，更具体地说，它涉及一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法。

背景技术

抗生素滥用已成为全球性的问题，随着越来越多耐药致病菌的出现，也推动了研究者们加快替抗减抗方案的开发研究。噬菌体和益生菌作为绿色新型的减抗替抗方案，近年来一直备受关注。

噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对宿主菌具有高度的专一性，当烈性噬菌体侵染致病菌时，可在致病菌中快速繁殖大量的子代噬菌体后裂解致病菌，释放出的子代噬菌体继续侵染其它致病菌，从而引起致病菌的大量死亡，但其对非宿主菌无侵染能力，同时，噬菌体也具有高效性、专一性、无毒性残留、无应激反应等特点。

益生菌是活的微生物，摄入充足的数量后，对宿主产生一种或多种特殊且经论证的健康益处，在食品、医药、饲料等领域已有较广泛的应用。益生菌的作用机制不仅体现在通过活菌定植后改善微生态环境，还体现在通过其代谢产物来抑菌或杀菌(如细菌素)、增强免疫调节(如胞外多糖、短链脂肪酸、共轭脂肪酸)、提供有益物质(如B族维生素)等，益生菌具有无耐药性、无毒性、无污染、无残留等特点。

目前在我国，多种益生菌的联合培养，制作成的制剂在预防或治疗疾病方面显示了良好的前景。但是现阶段大多数机构研究规模小，方法学有待提高，而且益生菌产品类别多，临床应用不够明确。对于将这些益生菌进行新组合以提供一系列有益处的用途，仍有很多机会。

实现噬菌体和益生菌作为替代抗生素的方案，最关键是通过发酵工艺来获取高效价的噬菌体和具有功能性的益生菌，同时强化两者之间的协同作用。然而，对于噬菌体和益生菌的相关研究还是处于独立开展状态，尚无两者联合发酵的相关研究报道。

现有公开号为CN107686832A、CN107779439A、CN104845940B、CN108103032A、CN108103031A、CNCN109136194A等专利分别公开了副溶血性弧菌噬菌体、葡萄球菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体等噬菌体的制备方法和应用。

现有公开号为CN106721082A、CN108048347A、CN1670184A、CN103014078A、CN101475920、CN104561227A等专利，分别公开了枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、多粘类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌等的发酵代谢物质中含抑菌生物活性物，如脂肽、表面活性素、丰原素等细菌素，通过破坏致病菌菌的生物膜完整的结构，或产生非特异性免疫调节因子，起到抑菌或杀菌作用，提高机体的免疫力。

但是上述技术均未在噬菌体与益生菌耦合发酵方向展开深入研究，在这一方面存在空白。

发明内容

针对现有技术存在的空缺，本发明的目的在于围绕噬菌体和益生菌耦合发酵为技术突破口，提供一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，工艺可操作性强，具有普适性和经济性。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种噬菌体与益生菌耦合发酵制备的微生态制剂，微生态制剂为噬菌体和益生菌混合物，或噬菌体和益生菌代谢产物的混合物，噬菌体和益生菌的剂型分别为水剂或粉剂。

通过采用上述技术方案，在噬菌体和益生菌耦合发酵后制备的微生态制剂，这样的微生态制剂强化了噬菌体和益生菌的协同作用，具有更高的抑菌或杀菌效果，并且可以应用在大部分细菌病害中，同时也高效利用了发酵培养基营养成分，减少废物排放，降低了生产成本。通过采用上述技术方案，所述噬菌体包括埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体的一种或几种。

通过采用上述技术方案，所述噬菌体包括副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体或产气荚膜梭菌噬菌体的一种或几种。

通过采用上述技术方案，所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体 VP46(VibrioparahaemolyticusphageVP46)、副溶血性弧菌噬菌体 VP48(VibrioparahaemolyticusphageVP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(VibrioparahaemolyticusphageVP7)，其中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(VibrioparahaemolyticusphageVP46)的保藏编号为CCTCC NO:M 2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphageVP48)的保藏编号为CCTCC NO:M 2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticusphageVP7)保藏编号为CCTCC NO:M2016289。

通过采用上述技术方案，所述益生菌包括链球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、梭菌属和酵母菌。

通过采用上述技术方案，所述链球菌属包括嗜热链球菌；

所述芽孢杆菌属包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、和解淀粉芽孢杆菌；

所述乳杆菌属包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌、约氏乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、清酒乳杆菌和唾液乳杆菌；所述乳球菌属包括乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌双乙酰亚种；

所述肠球菌属包括粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸肠球菌；

所述片球菌属包括乳酸片球菌和戊糖片球菌；

所述明串珠菌属包括肠膜明串珠菌和柠檬明串珠菌；所述丙酸杆菌属包括产丙酸丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌谢氏亚种；

所述葡萄球菌属包括小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌；

所述梭菌属包括丁酸梭菌；

所述酵母菌包括酿酒酵母、毕赤酵母、产朊假丝酵母、马克斯克鲁维酵母、海洋红酵母、啤酒酵母、季也蒙假丝酵母和布拉氏酵母。

一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，其步骤如下：

步骤1，种子液制备：将活化后的宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为1～20％，培养温度25～40℃，转速20～240rpm，培养时间4～30h，获得宿主菌种子液；将活化后的益生菌菌种，接入种子培养基，接种比例为1～20％，培养温度25～40℃，转速20～240rpm，培养时间4～30h，获得益生菌种子液。

步骤2，发酵培养：将噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵4～30h，获得噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将益生菌种子液接入到无菌噬菌体发酵液中，发酵6～120h，获得噬菌体和益生菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用絮凝、离心或膜过滤中的一种或多种分离工艺，获得发酵除菌清液和菌体。

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得噬菌体和益生菌代谢产物混合物的水剂；向步骤3中的菌体添加菌体量1～10倍量的保护剂和/或载体，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得噬菌体和益生菌混合物的粉剂。

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂和或粉剂，置于-30～30℃的温度条件下进行储存保藏。

上述技术方案，其中所述步骤2的发酵培养基，为含有微生物所需的碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；

其中碳源为葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、淀粉或糖蜜中的一种或多种，添加比例0～10％；

氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为尿素、硫酸铵、氯化铵或硝酸铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏(粉)、牛肉膏(粉)、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉或玉米浆中的一种或多种，添加比例0～10％；无机盐为钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐、锰盐、钼盐、钴盐、硫酸盐、磷酸盐或氯化物中的一种或多种，添加比例0～10％。

进一步的，其中所述步骤2的发酵培养基：配制后的培养基先用5～50％的氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸铵、磷酸、硫酸、硝酸或醋酸中的一种或几种作为中和剂调节初始 pH为5～9，然后在115～121℃，0.05-0.12MPa高温高压条件下，灭菌15～30min，获得无菌培养基。

进一步的，其中所述的步骤2具体过程如下：第一步，将噬菌体和宿主菌接入到装液量为20～80％的发酵罐中，噬菌体与宿主菌的感染复数MOI值为1～1×10^-6，宿主菌接种比例为0.1～20％，发酵温度为25～40℃，搅拌转速为20～600rpm，溶氧5～100％，罐压0.03- 0.05MPa，发酵过程用5～50％的氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸铵、磷酸、硫酸、硝酸或醋酸中的一种或几种作为中和剂，控制发酵pH为5～9，发酵4～30h，获得噬菌体和宿主菌的发酵液；第二步，用无菌压缩空气或氮气，将发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为0.05～0.3MPa；第三步，向已经除菌的噬菌体培养基中接入益生菌种子液，益生菌接种比例为1～20％，发酵温度为25～40℃，搅拌转速为20～600rpm，溶氧5～100％，罐压0.03-0.05MPa，发酵过程用5～50％的氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸铵、磷酸、硫酸、硝酸或醋酸中的一种或几种作为中和剂，控制发酵pH为5～9，发酵6～120h，获得噬菌体和益生菌的发酵液。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.本发明通过噬菌体与益生菌耦合发酵，能够强化噬菌体和益生菌的协同作用，提高针对致病性细菌的抑菌或杀菌效果。

2.本发明通过噬菌体与益生菌耦合发酵制备的微生态制剂的制备方法，改制备方法能够同批获得水剂和粉剂，起到物料高效利用、废物低量排放、生产缩短周期、降低生产成本等效果。

3.本发明的微生物生态制剂在细菌病害防治中，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明微生物制剂的制备方法流程框图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。

副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为 2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016290。

副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为 2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016291。

副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phageVP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为 2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016289。

大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia coli phageCL1)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2018年12月 28日；保藏编号为CCTCC NO：M2018936。

茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearumphage GP3)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为 2016年11月10日；保藏编号为CCTCC NO：M2016635。

溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phage VAP21)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2018年 11月09日；保藏编号为CCTCC NO：M 2018768。

金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcus aureus phageBP-13A)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为 2016年9月28日、保藏编号CCTCC NO：M 2016535。

以下实例中，供试菌株为市场购买获得，该供试菌种处于公开状态，科学工作者可以向相关单位索取。

枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC AB 90008；屎肠球菌保藏编号为CICC 20430；植物乳杆菌保藏编号为CGMCC No.14531；地衣芽孢杆菌保藏编号为CICC 23584；短小芽孢杆菌保藏编号为CICC 9003；丁酸梭菌保藏编号为CICC 23592。

噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂的制备方法参见图1，其步骤如下：

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得噬菌体和益生菌代谢产物混合物的水剂；向步骤3中的菌体添加菌体量1～10倍量的保护剂和或载体，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得噬菌体和益生菌混合物的粉剂。

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂和/或粉剂，置于-30～30℃的温度条件下进行储存保藏。

以下为不同噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法的应用实施实施例1：

一种副溶血性弧菌噬菌体与枯草芽孢杆菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，其步骤如下：步骤1，种子液制备：将活化后的副溶血性弧菌宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为 1％，培养温度30℃，转速100rpm，培养时间18h，获得副溶血性弧菌种子液；将活化后的枯草芽孢杆菌菌种，接入种子培养基，接种比例为2％，培养温度37℃，转速220rpm，培养时间24h，获得枯草芽孢杆菌种子液。

步骤2，发酵培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵8h，获得副溶血性弧菌噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将枯草芽孢杆菌种子液接入到无菌副溶血性弧菌噬菌体发酵液中，发酵30h，获得副溶血性弧菌噬菌体和枯草芽孢杆菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用离心分离工艺，8000rpm离心15min，获得发酵除菌清液和菌体。

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得副溶血性弧菌噬菌体和枯草芽孢杆菌代谢产物混合物的水剂，水剂中副溶血性弧菌噬菌体的效价为7.9×10¹⁰PFU/mL；向步骤3中的菌体添加菌体量8倍量的保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉 10％、甘油2％、谷氨酸钠4％、蔗糖8％，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得副溶血性弧菌噬菌体和枯草芽孢杆菌混合物的粉剂，粉剂中枯草芽孢杆菌活菌数为3.6× 10¹⁰CFU/g，副溶血性弧菌噬菌体的效价为1.3×10⁸PFU/g；

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂置于4℃，粉剂置于25℃的温度条件下进行储存保藏。

其中步骤2的发酵培养基，为含有微生物所需的碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；其中碳源为葡萄糖5％、麦芽糖0.01％、蔗糖0.5％；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为尿素0.02％、硫酸铵0.5％，有机含氮化合物为蛋白胨1.5％、酵母膏0.2％、牛肉粉0.3％；无机盐为磷酸氢二钾0.2％、氯化钠0.5％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.02％。配制后的培养基先用10％氢氧化钠和10％硫酸作为中和剂调节初始pH为7.3，然后在121℃，0.12MPa高温高压条件下，灭菌20min，获得无菌培养基。

其中步骤2具体过程如下：第一步，将副溶血性弧菌噬菌体和副溶血性弧菌宿主菌接入到装液量为65％的发酵罐中，MOI值为1×10^-4，宿主菌接种比例为2.2％，发酵温度为35℃，搅拌转速为180rpm，溶氧20％，罐压0.04MPa，发酵过程用10％氢氧化钠和10％硫酸作为中和剂，控制发酵pH为7.3，发酵8h，获得副溶血性弧菌噬菌体发酵液；第二步，用无菌压缩空气，将副溶血性弧菌噬菌体发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为0.12MPa；第三步，向已经除菌的副溶血性弧菌噬菌体培养基中接入枯草芽孢杆菌种子液，接种比例为10％，发酵温度为36℃，搅拌转速为220rpm，溶氧30％，罐压0.04MPa，发酵过程用10％氢氧化钠和10％硫酸作为中和剂，控制发酵pH为7.1，发酵30h，获得副溶血性弧菌噬菌体和枯草芽孢杆菌的发酵液。

本实施例中的副溶血性弧菌噬菌体保藏编号为CCTCC NO：M2016290，枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC AB 90008。

实施例2：

一种金黄色葡萄球菌噬菌体与屎肠球菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，其步骤如下：

步骤1，种子液制备：将活化后的金黄色葡萄球菌宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为0.5％，培养温度32℃，转速200rpm，培养时间6h，获得金黄色葡萄球菌宿主菌种子液；将活化后的屎肠球菌菌种，接入种子培养基，接种比例为3％，培养温度37℃，转速190rpm，培养时间18h，获得屎肠球菌种子液。

步骤2，发酵培养：将金黄色葡萄球菌噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵10h，获得金黄色葡萄球菌噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将屎肠球菌种子液接入到无菌金黄色葡萄球菌噬菌体发酵液中，发酵9h，获得金黄色葡萄球菌噬菌体和屎肠球菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用絮凝和离心的分离工艺，絮凝剂配比为：聚丙烯酰胺0.2％，5000rpm离心15min，获得发酵除菌清液和菌体。

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得金黄色葡萄球菌噬菌体和屎肠球菌代谢产物混合物的水剂，水剂中金黄色葡萄球菌噬菌体的效价为2.9×10¹¹PFU/mL；向步骤3中的菌体添加菌体量3倍量的保护剂，保护剂配比为：海藻糖5％、甘油3％、明胶2％、谷氨酸钠3％、蔗糖4％、麸皮2％，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得金黄色葡萄球菌噬菌体和屎肠球菌混合物的粉剂，粉剂中屎肠球菌活菌数为2.1 ×10¹¹CFU/g，金黄色葡萄球菌噬菌体的效价为9.2×10⁹PFU/g。

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂置于5℃，粉剂置于-20℃的温度条件下进行储存保藏。

其中步骤2的发酵培养基，为含有微生物所需的碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；其中碳源为葡萄糖2％、乳糖0.2％、糖蜜1.5％；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为氯化铵0.48％，有机含氮化合物为蛋白胨1％、酵母粉0.75％、豆饼粉1％、玉米浆0.55％；无机盐为磷酸氢二钾0.4％、磷酸二氢钾0.25％、氯化钠0.3％、氯化镁0.6％、硫酸锰0.003％。配制后的培养基先用15％的氨水和10％的醋酸作为中和剂调节初始 pH为6.85，然后在115℃，0.07MPa高温高压条件下，灭菌15min，获得无菌培养基。

其中步骤2具体过程如下：第一步，将金黄色葡萄球菌噬菌体和金黄色葡萄球菌接入到装液量为80％的发酵罐中，MOI值为8×10^-6，宿主菌接种比例为3％，发酵温度为 37℃，搅拌转速为190rpm，溶氧20％，罐压0.035MPa，发酵过程用15％的氨水和10％的醋酸作为中和剂，控制发酵pH为6.9，发酵10h，获得金黄色葡萄球菌噬菌体发酵液；第二步，用无菌压缩空气，将金黄色葡萄球菌噬菌体发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为0.12MPa；第三步，向已经除菌的金黄色葡萄球菌噬菌体培养基中接入屎肠球菌种子液，接种比例为7％，发酵温度为38℃，搅拌转速为200rpm，溶氧35％，罐压0.035MPa，发酵过程用10％氢氧化钠和10％硫酸作为中和剂，控制发酵pH为6.85，发酵9h，获得金黄色葡萄球菌噬菌体和屎肠球菌的发酵液。

本实施例中的金黄色葡萄球菌噬菌体保藏编号为CCTCCNO：M2016535，屎肠球菌保藏编号为CICC 20430。

实施例3：

一种大肠杆菌噬菌体与植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，其步骤如下：

步骤1，种子液制备：将活化后的大肠杆菌宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为 15％，培养温度34℃，转速210rpm，培养时间8h，获得大肠杆菌宿主菌种子液；将活化后的植物乳杆菌菌种，接入种子培养基，接种比例为12％，培养温度36℃，转速80rpm，培养时间12h，获得植物乳杆菌和种子液；将活化后的地衣芽孢杆菌菌种，接入种子培养基，接种比例为14％，培养温度34℃，转速180rpm，培养时间19h，获得地衣芽孢杆菌种子液。

步骤2，发酵培养：将大肠杆菌噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵24h，获得大肠杆菌噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌种子液接入到无菌大肠杆菌噬菌体发酵液中，发酵22h，获得大肠杆菌噬菌体和植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用膜过滤的分离工艺，50nm陶瓷膜，获得发酵除菌清液和菌体。

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得大肠杆菌噬菌体和植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌代谢产物混合物的水剂，水剂中大肠杆菌噬菌体的效价为3.7×10¹⁰PFU/mL；向步骤3中的菌体添加菌体量1.8倍量的保护剂，保护剂配比为：明胶8％、海藻糖4％、甘油4％、谷氨酸钠1.5％，，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得大肠杆菌噬菌体和植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌混合物的粉剂，粉剂中植物乳杆菌的活菌数为4.3 ×10¹⁰CFU/g，地衣芽孢杆菌的活菌数为3.1×10¹¹CFU/g，大肠杆菌噬菌体的效价为1.6×10⁸PFU/g。

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂置于10℃，粉剂置于-25℃的温度条件下进行储存保藏。

其中步骤2的发酵培养基，为含有微生物所需的碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；其中碳源为葡萄糖1.1％、蔗糖0.1％、乳糖1％、淀粉1.8％、糖蜜2.7％；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为尿素0.85％和硝酸铵1.2％，有机含氮化合物为蛋白胨0.7％、酵母膏1.9％和花生饼粉2.3％；无机盐为磷酸氢二钾0.87％、氯化钠0.35％、硫酸镁0.47％、硫酸锌0.008％和硫酸锰0.0006％。配制后的培养基先用17％的碳酸铵和2％磷酸作为中和剂调节初始pH为6.9，然后在121℃，0.12MPa高温高压条件下，灭菌10min，获得无菌培养基。

其中步骤2具体过程如下：第一步，将大肠杆菌噬菌体和宿主菌接入到装液量为70％的发酵罐中，MOI值为3×10^-5，宿主菌接种比例为3.8％，发酵温度为34℃，搅拌转速为185rpm，溶氧23％，罐压0.05MPa，发酵过程用17％的碳酸铵和2％磷酸作为中和剂，控制发酵pH为6.9，发酵24h，获得大肠杆菌噬菌体发酵液；第二步，用无菌氮气，将大肠杆菌噬菌体发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为0.12MPa；第三步，向已经除菌的大肠杆菌噬菌体培养基中接入植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌种子液，接种比例分别为7％和 11％，发酵温度为35℃，搅拌转速为150rpm，溶氧15％，罐压0.035MPa，发酵过程用17％的碳酸铵和2％磷酸作为中和剂，控制发酵pH为6.65，发酵22h，获得大肠杆菌噬菌体与植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵液。

本实施例中大肠杆菌噬菌体保藏编号为CCTCCNO：M2018936，植物乳杆菌保藏编号为CGMCC No.14531，地衣芽孢杆菌保藏编号为CICC 23584。

实施例4：

一种茄科雷尔氏菌噬菌体与短小芽孢杆菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，其步骤如下：步骤1，种子液制备：将活化后的茄科雷尔氏菌宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为 9％，培养温度28℃，转速130rpm，培养时间20h，获得茄科雷尔氏菌种子液；将活化后的短小芽孢杆菌菌种，接入种子培养基，接种比例为13％，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间16h，获得短小芽孢杆菌种子液。

步骤2，发酵培养：将茄科雷尔氏菌噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵30h，获得茄科雷尔氏菌噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将短小芽孢杆菌种子液接入到无菌茄科雷尔氏菌噬菌体发酵液中，发酵36h，获得茄科雷尔氏菌噬菌体和短小芽孢杆菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用离心分离工艺，7500rpm离心18min，获得发酵除菌清液和菌体。

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得茄科雷尔氏菌噬菌体和短小芽孢杆菌代谢产物混合物的水剂，水剂中茄科雷尔氏菌噬菌体的效价为6.3×10¹⁰PFU/mL；向步骤3中的菌体添加菌体量2.2倍量的保护剂，保护剂配比为：明胶4.5％、海藻糖4％、甘油2.5％、谷氨酸钠3％，蔗糖2％，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得茄科雷尔氏菌噬菌体和短小芽孢杆菌混合物的粉剂，粉剂中短小芽孢杆菌活菌数为7.4 ×10¹⁰CFU/g，茄科雷尔氏菌噬菌体的效价为8.7×10⁷PFU/g；

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂置于5℃，粉剂置于25℃的温度条件下进行储存保藏。

其中步骤2的发酵培养基，为含有微生物所需的碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；其中碳源为葡萄糖1.9％、木糖3.3％和淀粉0.6％；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为硫酸铵0.49％，有机含氮化合物为蛋白胨0.3％、酵母膏1.2％、牛肉粉1％、玉米浆0.1％；无机盐为磷酸二氢钾0.55％、硝酸钠0.36％、氯化镁0.46％、氯化钙0.27％、硫酸亚铁0.00049％、硫酸锌0.00017％。配制后的培养基先用23％碳酸钠和20％醋酸作为中和剂调节初始pH为7.1，然后在118℃，0.09MPa高温高压条件下，灭菌18min，获得无菌培养基。

其中步骤2具体过程如下：第一步，将茄科雷尔氏菌噬菌体和茄科雷尔氏菌宿主菌接入到装液量为80％的发酵罐中，MOI值为2×10^-1，宿主菌接种比例为6％，发酵温度为 29℃，搅拌转速为150rpm，溶氧25％，罐压0.036MPa，发酵过程用23％碳酸钠和2％硫酸作为中和剂，控制发酵pH为7.1，发酵30h，获得茄科雷尔氏菌噬菌体发酵液；第二步，用无菌压缩空气，将茄科雷尔氏菌噬菌体发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为 0.25MPa；第三步，向已经除菌的茄科雷尔氏菌噬菌体培养基中接入短小芽孢杆菌种子液，接种比例为12％，发酵温度为36.5℃，搅拌转速为220rpm，溶氧32％，罐压0.036MPa，发酵过程用23％碳酸钠和20％醋酸作为中和剂，控制发酵pH为7.0，发酵36h，获得茄科雷尔氏菌噬菌体和短小芽孢杆菌的发酵液。

本实施例中的茄科雷尔氏菌噬菌体保藏编号为CCTCC NO：M 2016633，短小芽孢杆菌保藏编号为CICC 9003。

实施例5：

一种溶藻弧菌噬菌体与丁酸梭菌耦合发酵的微生态制剂及制备方法，其步骤如下：

步骤1，种子液制备：将活化后的溶藻弧菌宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为1％，培养温度25℃，转速50rpm，培养时间12h，获得溶藻弧菌宿主菌种子液；将活化后的丁酸梭菌菌种，接入种子培养基，接种比例为5％，培养温度30℃，转速175rpm，培养时间22h，获得丁酸梭菌种子液。

步骤2，发酵培养：将溶藻弧菌噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵12h，获得溶藻弧菌噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将丁酸梭菌种子液接入到无菌溶藻弧菌噬菌体发酵液中，发酵28h，获得溶藻弧菌噬菌体和丁酸梭菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用离心的分离工艺，10000rpm离心10min，获得发酵除菌清液和菌体；

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得水剂，水剂中溶藻弧菌噬菌体的效价为6.9×10¹⁰PFU/mL；向步骤3中的菌体添加菌体量6倍量的保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10％、海藻糖2％、甘油1.5％、谷氨酸钠5％，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得粉剂，粉剂中丁酸梭菌的活菌数为5.3×10¹¹CFU/g，溶藻弧菌噬菌体的效价为2.2×10⁸PFU/g；

步骤5，储存保藏：将步骤4获得的水剂置于7℃，粉剂置于-22℃温度条件下进行储存保藏。

其中步骤2的发酵培养基，为含有微生物所需的碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；其中碳源为葡萄糖2.3％、麦芽糖0.05％、甘露糖0.004％、半乳糖1.7％、淀粉1.6％；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为硫酸铵0.61％，有机含氮化合物为蛋白胨2％、牛肉膏0.8％、鱼粉0.3％；无机盐为氯化钾0.39％、磷酸氢二钠0.55％、硫酸镁0.37％、碳酸钙0.005％、硫酸亚铁0.0001％、硫酸钴0.00005％。

其中步骤2的发酵培养基，配制后的培养基先用18％的碳酸钠和15％磷酸作为中和剂调节初始pH为7.1，然后在110℃，0.06MPa高温高压条件下，灭菌26min，获得无菌培养基。

其中步骤2具体过程如下：第一步，将溶藻弧菌噬菌体和宿主菌接入到装液量为75％的发酵罐中，MOI值为2×10^-4，宿主菌接种比例为3.5％，发酵温度为31℃，搅拌转速为110rpm，溶氧10％，罐压0.04MPa，发酵过程用18％的碳酸钠和15％磷酸作为中和剂，控制发酵pH为7.1，发酵12h，获得溶藻弧菌噬菌体发酵液；第二步，用无菌氮气，将溶藻弧菌噬菌体发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为0.2MPa；第三步，向已经除菌的溶藻弧菌噬菌体培养基中接入丁酸梭菌种子液，接种比例分别为9％，发酵温度为35℃，搅拌转速为50rpm，溶氧0％，罐压0.035MPa，发酵过程用18％的碳酸钠和15％磷酸作为中和剂，控制发酵pH为6.88，发酵28h，获得溶藻弧菌噬菌体和丁酸梭菌的发酵液。

本实施例中溶藻弧菌噬菌体保藏编号为CCTCC NO：M 2018768，丁酸梭菌保藏编号为CICC 23592。

实施例6：

一种副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A与枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌耦合发酵的微生态制剂的制备方法

步骤1，种子液制备：将活化后的供试菌宿主菌菌种，分别接入TSB培养基，接种比例为 1％，培养温度25℃-37℃，转速50rpm，培养时间12h，获得供试菌宿主菌种子液；将活化后的供试益生菌菌种，分别接入种子培养基，接种比例为5％，培养温度30℃，转速175rpm，培养时间22h，获得益生菌种子液。

步骤2，发酵培养：分别将供试噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵12h，获得供试菌噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将益生菌种子液接入到无菌供试菌噬菌体发酵液中，发酵28h，获得供试菌噬菌体和益生菌的发酵液。

步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用离心的分离工艺，1×10³rpm离心10min，获得发酵除菌清液和菌体；

步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得水剂，水剂中供试菌噬菌体的效价为6.9×10¹⁰PFU/mL；向步骤3中的菌体添加菌体量6倍量的保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10％、海藻糖2％、甘油1.5％、谷氨酸钠5％，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得粉剂，粉剂中益生菌的活菌数为5.3×10¹¹CFUcfu/g，供试菌噬菌体的效价为2.2 ×10⁸PFU/g；

其中步骤2具体过程如下：第一步，将供试菌噬菌体和宿主菌接入到装液量为75％的发酵罐中，MOI值为2×10^-4，宿主菌接种比例为3.5％，发酵温度为31℃，搅拌转速为110rpm，溶氧10％，罐压0.04MPa，发酵过程用18％的碳酸钠和15％磷酸作为中和剂，控制发酵pH为7.1，发酵12h，获得供试菌噬菌体发酵液；第二步，用无菌氮气，将供试菌噬菌体发酵液进行压滤除菌，膜孔径为0.22μm，压力为0.2MPa；第三步，向已经除菌的供试菌噬菌体培养基中接入益生菌种子液，接种比例分别为9％，发酵温度为35℃，搅拌转速为50rpm，溶氧0％，罐压0.035MPa，发酵过程用18％的碳酸钠和15％磷酸作为中和剂，控制发酵pH为6.88，发酵28h，获得供试菌噬菌体和益生菌的联合发酵液，即微生物制剂。

本实施例中副溶血性弧菌噬菌体VP46保藏编号为CCTCC NO：M 2016290；大肠杆菌噬菌体保藏编号为CCTCC NO：M 2018936；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3保藏编号为 CCTCCNO：M 2016633；金黄色葡萄球菌BP-13A保藏编号CCTCC NO：M 2016535；枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC AB 90008；屎肠球菌保藏编号为CICC 20430；植物乳杆菌保藏编号为CGMCCNo.14531。

其中，副溶血性弧菌噬菌体VP46也可以替换为副溶血性弧菌噬菌体 VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)，其中副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrioparahaemolyticus phage VP48)的保藏编号为CCTCC NO:M 2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)保藏编号为CCTCC NO:M 2016289。

实施例7：

一种副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A与枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌耦合发酵的微生态制剂的pH值稳定性

取无菌EP管分别加入不同pH(1-12)的TSB培养基900μL后将上述EP管置于25℃ 的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μL微生态制剂纯培养液(实施例6制得)，室温下静置1h。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定微生态制剂中的噬菌体效价。之后分别于4h、8h、24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。同时设置四个对照组CK1、CK2、CK3、CK4，对照组CK1、CK2、CK3、CK4分别给予单独制备的终浓度为3.6×10⁸PFU/mL的副溶血性弧菌噬菌体VP46、终浓度为6.2×10⁸PFU/mL大肠杆菌噬菌体CL1、终浓度为1.0×10⁹PFU/mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、终浓度为5.0×10⁸ PFU/mL的金黄色葡萄球菌BP-13A。

表1微生态制剂中噬菌体的pH稳定性

结果如表1所示，副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体 GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A均在pH为5-10范围内处理96h后其效价无明显变化。将微生态制剂中的副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A效价分别与其单独制备的对照处理进行对比，发现各pH处理下微生态制剂中的各噬菌体效价均较其对照组高，说明微生态制剂中制备的噬菌体具有较高的pH稳定性。

实施例8：

一种副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A与枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌耦合发酵的微生态制剂热稳定性试验

取l00μL微生态制剂纯培养液(实施例6制得)分装于无菌EP管中，分别置于25℃(CK)、50℃、60℃、70℃水浴中进行处理，分别于1h及2h进行取样，取样后立即将样品置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。同时设置四个对照组CK1、CK2、CK3、CK4，对照组CK1、CK2、CK3、CK4分别给予单独制备的终浓度为2.1×10¹⁰PFU/mL的副溶血性弧菌噬菌体VP46、终浓度为6.2×10¹⁰PFU/mL大肠杆菌噬菌体CL1、终浓度为3.9×10¹⁰PFU/mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、终浓度为5.0 ×10¹⁰PFU/mL的金黄色葡萄球菌BP-13A。

表2微生态制剂中噬菌体的热稳定性

结果如表2所示，副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体 GP3和金黄色葡萄球菌BP-13A最适存活温度均为50℃。4株噬菌体均具有良好的热稳定性，在60℃水浴2h后仍具较高效价。将微生态制剂中的副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A效价分别与其单独制备的对照组进行对比，发现各温度处理下微生态制剂中的各噬菌体效价均较其对照组高，说明微生态制剂中制备的噬菌体具有较高的热稳定性。

实施例9：

一种副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A与枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌耦合发酵的微生态制剂存活稳定性试验

取5mL微生态制剂的纯培养液(实施例6制得)分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、 30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。同时设置四个对照组CK1、 CK2、CK3、CK4，对照组CK1、CK2、CK3、CK4分别给予终浓度为7.0×10⁹PFU/mL的副溶血性弧菌噬菌体VP46、终浓度为1.0×10¹⁰PFU/mL大肠杆菌噬菌体CL1、终浓度为1.17×10¹⁰PFU/mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、终浓度为1.0×10¹⁰PFU/mL的金黄色葡萄球菌BP-13A。

表3微生态制剂中噬菌体于不同保存温度下的存活稳定性

结果如表3所示，4℃条件下副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A存放50周效价降低未超过一个数量级；25℃条件下副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、黄色葡萄球菌BP-13A均可在20周内维持10⁸PFU/mL及以上效价；30℃条件下4株噬菌体均可在14周内维持10⁸PFU/mL及以上效价；各保存温度下微生态制剂的4株噬菌体均对宿主菌具有较强裂解能力。微生态制剂中的4株供试噬菌体适宜4℃下存放。相对于单独制备的噬菌体，耦合益生菌共同制备的噬菌体可存放的时间更久。

实施例10：

一种副溶血性弧菌噬菌体VP46、大肠杆菌噬菌体CL1、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、金黄色葡萄球菌BP-13A与枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌耦合发酵的微生态制剂的热度及压力稳定性试验

取100μL微生态制剂纯培养液(实施例6制得)分装于无菌EP管中，分别使用弗氏细胞压碎器使噬菌体置于极高压力条件下(1000psi)作用5min。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。同时设置四个对照组CK1、CK2、CK3、CK4，对照组CK1、CK2、CK3、CK4分别给予终浓度为1.2×10⁷PFU/mL的副溶血性弧菌噬菌体VP46、终浓度为6.2×10⁷PFU/mL大肠杆菌噬菌体CL1、终浓度为1.8×10⁷PFU/mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP3、终浓度为6.4×10⁷ PFU/mL的金黄色葡萄球菌BP-13A。

表4微生态制剂中噬菌体的压力稳定性

噬菌体	压力(1000psi)
		微生态制剂中vP46/CK1	2.7×10<sup>7</sup>/1.7×10<sup>7</sup>
微生态制剂中CL1/CK2	5.2×10<sup>7</sup>/4.7×10<sup>7</sup>
		微生态制剂中GP3/CK3	1.3×10<sup>7</sup>/7.1×10<sup>6</sup>
微生态制剂中BP-13A/CK4	5.2×10<sup>7</sup>/3.6×10<sup>7</sup>

结果如表4所示，微生态制剂中的4株噬菌体均对压力具有较好的耐受性，在压力为 1000psi时仍有较高效价；耦合益生菌共同发酵的微生态制剂中的各噬菌体在不同压力下相对于其单独制备的噬菌体具有较高的压力耐受性。

本具体实施例1-10，仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂，其特征在于：将噬菌体与益生菌耦合发酵后进行固液分离，分离的液体用于制备水剂，分离的固体用于制备粉剂；所述噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46保藏编号为CCTCC NO：M 2016290，大肠杆菌噬菌体保藏编号为CCTCC NO：M 2018936，茄科雷尔氏菌噬菌体GP3保藏编号为 CCTCCNO：M 2016633；所述有益菌为金黄色葡萄球菌BP-13A保藏编号为CCTCC NO：M 2016535，枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC AB 90008，屎肠球菌保藏编号为CICC 20430和植物乳杆菌保藏编号为CGMCCNo.14531。

2.如权利要求1所述的一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂在pH为5-10范围内处理96h后其效价无明显变化。

3.如权利要求1所述的一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂中各噬菌体具有50°热稳定性。

4.如权利要求1所述的一种噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂中各噬菌体具有耐1000psi高压性。

5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的噬菌体与益生菌耦合发酵的微生态制剂的方法，其特征在于：其步骤如下：步骤1，种子液制备：将活化后的宿主菌菌种，接入TSB培养基，接种比例为1～20%，培养温度25～40℃，转速20～240rpm，培养时间4～30h，获得宿主菌种子液；将活化后的益生菌菌种，接入种子培养基，接种比例为1～20%，培养温度25～40℃，转速20～240rpm，培养时间4～30h，获得益生菌种子液；步骤2，发酵培养：将噬菌体和宿主菌种子液接种到发酵培养基中，发酵4～30h，获得噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，将益生菌种子液接入到无菌噬菌体发酵液中，发酵6～120h，获得噬菌体和益生菌的发酵液；步骤3，分离提取：将步骤2中的发酵液通过采用絮凝、离心或膜过滤中的一种或多种分离工艺，获得发酵除菌清液和菌体；步骤4，无菌包装：将步骤3中的发酵除菌清液无菌包装，获得噬菌体和益生菌代谢产物混合物的水剂；向步骤3中的菌体添加菌体量1～10倍量的保护剂和/或载体，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得噬菌体和益生菌混合物的粉剂。