CN118165940B - 一株耐酸碱空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22001及工业化生产工艺和其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株空肠弯曲杆菌噬菌体RDP‑CJ‑22001，其保藏编号为CGMCC NO 45405。本发明还公开了一种噬菌体组合物，包括如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP‑CJ‑22001。本发明还公开了如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP‑CJ‑22001或者如上所述的噬菌体组合物在制备以下至少一种产品中的应用：(1)杀灭或抑制空肠弯曲杆菌的产品；(2)预防和/或治疗空肠弯曲杆菌所引起的家禽疾病的产品；(3)预防和/或治疗空肠弯曲杆菌引起的炎症反应的产品。本发明还公开了一种噬菌体制剂。本发明还公开了一种如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP‑CJ‑22001的工业化生产工艺。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐酸碱空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001及工业化生产工艺和其应用。
背景技术
空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)为革兰氏阴性菌杆菌，呈弧形或螺旋形，宽0.2～0.5μL，长1.5～5.0μL，当2个细胞形成短链，会形成S形或海鸥展翅形。不产生荚膜和芽胞。有极端单鞭毛，在菌体的一端，运动活泼，呈螺旋性滚动。传代多次后菌形会变为球状，丧失动力，在不适宜的条件下放置1～2天，亦可变成球状。空肠弯曲菌的培养条件苛刻，是严格的微需氧菌，适于在低氧环境(5％氧气、10％二氧化碳和85％氮气)中生长。空肠弯曲菌可在37-42℃下生长，最适生长温度为41.5℃，30℃以下不能生长。最适pH为6.5-7.5，如果pH高于9.0、低于4.9则不会生长。
空肠弯曲杆菌是一种人兽共患病病原体，是在全球范围内引起人类腹泻的主要细菌性病原菌之一。也是一种食源性病原微生物，影响着公共健康安全，成为公共卫生关注的新焦点。自上世纪80年代以来，该菌就受到国内外的广泛重视，有专家认为，该菌对人的危害不亚于沙门氏菌和志贺氏菌。空肠弯曲杆菌可在多种动物肠道内定植，感染动物并没有明显症状，却可以长期排菌，污染周围的环境和水源。家禽是空肠弯曲杆菌群的主要宿主，是弯曲菌病的主要感染来源。
空肠弯曲杆菌广泛分布在多种动物体内，被感染动物常不表现临床症状，却长期带菌，并通过粪便排菌，污染环境，继而污染水源和动物源产品，由此引发的食品安全和食源性疾病的问题日益突出,严重威胁人畜健康。空肠弯曲杆菌病主要会引起人的空肠弯曲杆菌肠炎，少数严重的会引起格利巴利综合症，一种自身免疫学周围神经性疾病。世界卫生组织(WHO)在1980年，将空肠弯曲杆菌感染做为最常见的食源性疾病之一。近十几年来，国内外科研人员对该菌的生物学特性、血清学特性、感染范围、流行病学、耐药机制和致病机制等进行了大量研究，对该菌有了比较深入的了解。国内主要采用抗生素防治家禽中空肠弯曲杆菌的传播和感染，但是，对从家禽中分离到的空肠弯曲杆菌进行耐药性测试，空肠弯曲杆菌分离株对抗生素，尤其是对喹诺酮类抗菌药的耐药性，在持续增强，急需寻求新型抗菌制剂。
自从20世纪初第一次发现噬菌体以来，运用噬菌体防控致病菌的研究便逐步兴起。噬菌体是一种细菌病毒，它可以依赖尾丝蛋白特异性识别并感染宿主细菌，在其体内大量复制，最终裂解宿主菌释放子代噬菌体。与抗生素相比，噬菌体产品具有使用简便、特异性强、增殖迅速、抗菌能力强等许多优点。虽然国外对空肠弯曲菌噬菌体已研究多年，并取得一定成果，但至今还未有合适的药剂开发出来。而国内对于空肠弯曲菌噬菌体的研究较少。
目前还未出现能有效预防和治疗空肠弯曲杆菌病的安全、稳定遗传且耐酸碱的噬菌体产品，因此，亟待开发一种安全、稳定遗传且耐酸碱的噬菌体产品用于防治空肠弯曲杆菌病，也亟待开发一种噬菌体液体制剂规模化的生产方法。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株耐酸碱空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001及工业化生产工艺和其应用。本发明旨在探究空肠弯曲杆菌噬菌体分离方法，并尝试从鸡粪便中分离裂解性空肠弯曲杆菌噬菌体，分析其生物学特性和裂解能力，为空肠弯曲杆菌噬菌体的分离和应用提供科学依据，为治疗和防控抗生素耐药空肠弯曲杆菌提供新思路。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一株空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001，该噬菌体是从鸡肠道内容物、粪便中分离得到的，于2023年1月6日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCCNO.45405，并被分类命名为空肠弯曲杆菌噬菌体。
通过电镜观察到：该噬菌体有一个二十六面体立体对称的头部，包裹着核酸，该噬菌体长度150nm，其中头部宽度80nm，尾长120nm，尾部为螺旋对称，具有伸缩性尾鞘。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，该噬菌体的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体科，并被命名为RDP-CJ-22001。
进一步的，该噬菌体RDP-CJ-22001在pH4-10的条件下，42℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，大多效价仍保持在108PFU/mL以上，说明该噬菌体有较好的耐酸碱性能。
进一步地，该噬菌体RDP-CJ-22001在30～50℃的温度范围内，效价稳定，尤其在50℃条件下处理30min和60min，效价仍然在108PFU/mL以上，说明该噬菌体对温度有较好的耐受性。
进一步地，该噬菌体RDP-CJ-22001连续传30代后，其效价稳定在108PFU/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。
进一步地，该噬菌体RDP-CJ-22001可有效感染空肠弯曲杆菌，其最佳感染复数为1:10。
进一步地，该噬菌体RDP-CJ-22001在稀释106倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。
第二方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种噬菌体组合物，包括如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001。
第三方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者如上所述的噬菌体组合物在制备以下至少一种产品中的应用：(1)杀灭或抑制空肠弯曲杆菌的产品；(2)预防和/或治疗空肠弯曲杆菌所引起的家禽疾病的产品；(3)预防和/或治疗空肠弯曲杆菌引起的炎症反应的产品。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体或者噬菌体组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体或者噬菌体组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。优选的，所述空肠弯曲杆菌选自鸡源空肠弯曲杆菌。
第四方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种噬菌体制剂，所述噬菌体制剂的有效成分包括如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者如上所述的噬菌体组合物。可选的，所述噬菌体制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
第五方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分包括如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者如上所述的噬菌体组合物。优选的，饲料添加剂中噬菌体的效价至少108PFU/mL。
第六方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种消毒剂，所述消毒剂的有效成分包括如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者如上所述的噬菌体组合物。优选的，消毒剂中噬菌体的效价至少108PFU/mL。上述消毒剂还包含其他用于环境中细菌抑制或者消灭的活性成分或其他助剂等。
第七方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种如上所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的工业化生产工艺，包括以下步骤：
S1.种子制备，包括宿主种子制备和噬菌体种子制备，其中，
(1)宿主种子制备：无菌条件下，挑取单菌落划线于固体培养基，42℃培养微氧条件下培养36-48h，然后用10mL无菌生理盐水洗涤平板上的菌落，收集菌悬液，以1％的接种量接种于液体培养基中，42℃培养微氧条件下培养24h；做好的种子液置于4℃冰箱保存备用；
(2)噬菌体种子制备：将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，42℃培养微氧条件下培养36-48h，然后用10mL生理盐水洗涤上层培养基，将洗涤液10000rpm，10min离心，然后过0.22μm的滤膜除菌，将收集到的过滤液至于4℃冰箱中保存备用；
噬菌体和宿主分别以1％和5％的比例接种于液体培养基中，42℃培养微氧条件下培养18-24h；
S2.噬菌体增殖：在种子罐中接种2％的宿主菌，培养12-14h后，OD600在0.3-0.4，再以1％的接种量接种噬菌体种子，培养12-14h，pH趋于稳定为止；
将准备好的宿主菌以5％的接种量，接种到大发酵罐中，培养12-14h，然后再以5％的接种量接入噬菌体种子，培养12-14h，pH升高，趋于稳定，结束增殖；
优选的，所述步骤S2中，培养基成分：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、牛肉膏0.1％、甘油0.5％、氯化钠0.5％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钙20ppm、氯化镁20ppm，以上为质量比；该培养基经过优化，可以满足宿主菌的生长繁殖，有效提高噬菌体效价。
优选的，所述步骤S2中，气体成分：5％氧气、10％二氧化碳和85％氮气；可以满足宿主菌的生长繁殖。
优选的，所述步骤S2中，种子罐参数：100-150rpm，42℃，通气量0.1-0.2vvm；发酵罐参数：60-80pm，42℃，通气量0.1-0.2vvm；发酵参数经过优化，有利于提高噬菌体的效价。
S3.液体制剂工艺：
(1)过滤：分别采用采用1000nm和400nm的陶瓷膜进行过滤，以去除细胞碎片和未裂解的宿主菌，过滤压力小于0.4mpa；
(2)除菌：采用三级过滤除菌，所述三级过滤分别为聚丙烯1.00μm、聚醚砜0.45μm、聚醚砜0.22μm；
(3)浓缩：采用100kd的卷式膜进行浓缩，以提高噬菌体效价；
(4)加入稳定剂，搅拌至完全溶解，即得噬菌体液体制剂，优选的，所述稳定剂的成分为甘油5％、海藻糖3％、聚山梨醇酯3％、磷酸二氢钠3％、磷酸钠2％，以上均为质量比。优选的，将噬菌体液体制剂置于4℃条件下储存。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001具有较宽的裂解谱和较强的裂解作用，可以有效的预防或者治疗空肠弯曲杆菌所引起的家禽疾病，动物实验表明，该空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001具有较好的治疗效果，可以有效治疗空肠弯曲杆菌引起的疾病，为工业化生产噬菌体用于预防或者治疗空肠弯曲杆菌病的防治提供了噬菌体来源。
2、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001及其噬菌体组合物可作为有效活性成分用于制备预防和治疗空肠弯曲杆菌病的制剂、饲料添加剂、消毒剂等，可广泛应用于家禽养殖、家禽加工生产过程等各个环节。
3、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001在30～50℃的温度范围内，效价稳定，尤其在50℃条件下处理30min和60min，效价仍然在108PFU/mL以上；经55℃处理30min和60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在107PFU/mL，说明该空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001对温度有较好的耐受性；本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001在pH4-10的条件下，42℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，大多效价仍保持在108PFU/mL以上，说明该空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001有较好的耐酸碱性能，该特性在治疗疾病过程中有很好的应用价值，RDP-CJ-22001本身具有高的活性，且对酸碱具有较好的耐受性，这可以保证有足够数量的噬菌体到达肠道发挥杀菌作用。
4、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001，稀释106倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。
5、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的工业化生产工艺，工艺成本低，效价高，制备的噬菌体液体制剂稳定性好，便于大规模推广应用。
附图说明
图1为空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的噬菌斑照片；
图2为空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的电镜图片；
图3为空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的酸碱稳定性曲线；
图4为空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的热稳定性曲线；
图5为空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的遗传稳定性曲线；
图6为空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的一步生长曲线；
图7为本发明实施例11空肠弯曲杆菌阳性率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
实施例1空肠弯曲菌的分离鉴定
(1)样品来源：青岛某大型蛋鸡养殖场，采集新鲜的盲肠、粪便和肝脏。
(2)空肠弯曲杆菌的分离：用棉拭子蘸取样品接种到弯曲杆菌CCDA培养基上，42℃微氧环境培养48h。同时取肉汤增菌液划线接种于CCDA平板上，42℃微氧环境培养48h。挑取具有弯曲杆菌特征的菌落，同时三区划线接种在CCDA琼脂平板上，42℃微氧环境继续培养36-48h，连续纯化2-3次，至菌落形态大小均一为止，从中分离得到疑似菌株9株。
(3)空肠弯曲杆菌的鉴定：再次挑取具有明显弯曲杆菌特征的疑似菌落采用煮沸法提取DNA模板，通过弯曲菌属16SrRNA、空肠弯曲菌MapA基因、结肠菌ceuE基因的多重PCR进一步鉴定。PCR反应体系见表1，PCT反应程序见表2。
表1PCR反应体系
表2PCR反应程序
PCR产物用10G/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照。采用三重PCR鉴定后，其中一株为空肠弯曲菌，进一步对16SRNA测序后，经鉴定确定为空肠弯曲杆菌，将其命名为BSJ-22001，采用20％的甘油保藏与-80℃冰箱中。
实施例2空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的分离纯化
1、样品处理：
①将鸡肠道内容物、粪便用生理盐水浸泡8-12小时。
②离心12000rpm，10min，用0.45μm的膜过滤除菌，收集过滤菌液，备用。
2、共培养：
取200μL过滤菌液与200μL过滤液置于5mL液体培养基中，42℃，微氧条件下培养48h。
3、噬菌体分离和纯化：
采用双层平板法，将共培养液12000rpm，10min离心，过0.22μm的膜，收集过滤清液，备用。
取200μL过滤清液与200μL菌液置于上层培养基中，铺双层平板，42℃，微氧条件下培养48h。抠取较大较亮的噬菌斑进一步纯化，直至噬菌斑大小均匀为止。噬菌斑照片如图1所示。
4、噬菌体的保藏：
抠取纯化好的噬菌斑，置于灭菌后的生理盐水中，浸泡20-30min，过0.22μm的滤芯除菌，10倍稀释过滤液，取适当浓度的稀释液100μL与200μL菌液置于上层培养基中，铺双层平板，42℃，微氧条件下培养48h。选取云雾状的平板，用生理盐水浸泡平板，然后刮取上层至50mL离心管中，振荡5-10min，5000rpm，10min，离心，用注射吸取清液，过0.22μm的膜，然后与冻干保护剂(16％脱脂奶粉，2％甘露醇，0.5％维生素C，以上为质量比)1：1混合均匀，分装于安瓿管中，置于冻干机中预冻4-6h后，然后真空冷冻干燥36-48h，对冻干后的样品，抽真空封存。
5、透射电镜观察噬菌体的形态：
(1)实验方法：
取高于105PFU/mL噬菌体样品50μL滴于微孔铜网上，沉淀1min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加50μl的1％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。
(2)实验结果及分析：
如图2所示，电镜条件测定得到，该噬菌体有一个二十六面体立体对称的头部，包裹着核酸，该噬菌体长度150nm，其中头部宽度80nm，尾长120nm，尾部为螺旋对称，具有伸缩性尾鞘。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，该噬菌体的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体科，并被命名为RDP-CJ-22001。
6、基因组分析：
通过对全基因分析，发现该噬菌体不含有毒力基因和溶原性基因，从分子水平上证明噬菌体的安全性，进一步发现，基因中含有2个裂解酶基因，可以更有效的裂解病原菌，增强噬菌体的杀菌效果。
实施例3空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的酸碱稳定性
1、实验方法：
用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×108PFU/mL，将稀释液在42℃，水浴1h，用生理盐水10倍稀释后铺双平板测定效价，42℃微氧(85％N2，10％CO2,O25％，以上为体积比)条件下培养48h。结果如图3所示。
2、实验结果：
实验结果显示，从图3可以看出，在pH4-10的条件下，42℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，大多效价仍保持在108PFU/mL以上，在pH3-11他条件下，处理1h，其效价仅下降3个数量级，说明RDP-CJ-22001有较好的耐酸碱性能。该特性在治疗疾病过程中有很好的应用价值，RDP-CJ-22001本身具有高的活性，且对酸碱具有较好的耐受性，这可以保证有足够数量的噬菌体到达肠道发挥杀菌作用。
实施例4空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001热稳定性
1、实验方法：
将噬菌体原液分装到50mL灭菌离心管中，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃和90℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍梯度稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图4所示。
2、实验结果：
实验结果显示，从图4可以看出，随温度的升高和时间的延长，噬菌体效价逐渐下降，尤其在50℃条件下处理30min和60min，效价仍然在108PFU/mL以上；经55℃处理30min和60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在107PFU/mL，RDP-CJ-22001对温度具有较好的耐受性。该特性在噬菌体的生产、运输和存储中有非常重要的意义。
实施例5空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001遗传稳定性
1、实验方法：
将RDP-CJ-22001连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-CJ-22001和BCJ-22001，每代培养时间36h，然后铺双平板，测定其效价。结果如图5所示。
2、实验结果：
实验结果显示，从图5可以看出，将RDP-CJ-22001连续传30代后，测定其效价，其效价稳定在108PFU/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。
实施例6空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001最佳感染复数
1、实验方法：
按照感染复数为10：1、1：1、1：10、1：100、1：1000、1：10000的比例将噬菌体增殖液和宿主加入液体培养基中，并且确保培养体系的总体积相同。42℃，微氧条件下培养12h，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。42℃，微氧(85％N2，10％CO2,O25％，以上为体积比)条件下培养48h，观察噬菌斑。结果如表3所示。
2、实验结果：
实验结果显示，从表3可以看出，当感染复数为1：10时，培养12h后，此时效价最高，说明RDP-CJ-22001的最佳感染复数为1：10。
表3最佳感染复数实验结果表
实施例7空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001一步生长曲线
1、实验方法：
取对数生长期的菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种空肠弯曲菌BSJ-22001和噬菌体RDP-CJ-22001，在42℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用液体培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于42℃的液体培养基中，迅速置于42℃微氧环境下。定点取样测定其效价，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝爆发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。
2、实验结果：
实验结果显示，如图6所示，该噬菌体感染宿主菌后，40min效价没有明显变化，说明其潜伏期约为40min；噬菌体侵染宿主菌后的40-120min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的裂解期约为80min；在随后的360min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。最后计算出平均裂解量为126PFU/感染细胞。
实施例8空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001RTD实验
1、实验方法：
在平板上划分区域，将一滴宿主菌(约100μL)滴加到区域中心处，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，42℃，微氧条件下培养48h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为CL浓度(CL浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案)。
2、实验结果：
实验表明，RDP-CJ-22001在稀释106倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。
实施例9空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001裂解率实验
1、实验方法：
无菌条件下，分别取1mL样品和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)，32℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10-1-10-3个梯度，每个梯度取100μL涂布于固体平板上，42℃，微氧条件下培养48h。每个梯度重复两次。同时取1mL生理盐水和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)作为空白对照，重复以上步骤。选取30-300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。
噬菌体裂解率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％。
2、实验结果：
实验表明，RDP-CJ-22001的裂解率达98.6％，对宿主菌有较好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。
实施例10空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001裂解谱实验
1、实验方法：
选择实验室已鉴定好的30株空肠弯曲菌，采用双层平板的方法，将空肠弯曲杆菌与上层融化好的培养基，混合后铺上层平板，冷却凝固后，然后再将噬菌体RDP-CJ-22001滴在平板上，晾干，42℃，微氧条件下培养48h，观察裂解情况。结果如表4所示。
2、实验结果：
从表4可以看出，空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001可以裂解30株空肠弯曲杆菌中的27株，裂解率90.00％，具有较宽的裂解谱，生物学性能较好，应用价值较大。
表4空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001裂解表
备注：++表示噬菌斑透亮，较大；+表示噬菌斑模糊；-表示不能裂解
实施例11空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001功效实验
1、实验方法：
实验选用30只1日龄雏鸡，分别设置空白组、攻毒组和治疗组，每组10只。空白组不做处理；攻毒组和治疗组雏鸡5日龄开始攻毒空肠弯曲菌BCJ-22001，每只鸡灌服200μL含有1×109CFU/mL的空肠弯曲杆菌；造模成功后，治疗组在6日龄到8日龄连续灌服100μL空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001(效价1×108PFU/mL)，然后连续收集粪便，测定其空肠弯曲杆菌的阳性率，检测方法采用实施例1中的方法，结果如图7所示。
阳性率＝阳性值/鸡群总数*100％
2、实验结果：
实验结果显示，从图7中可以看出，在5日龄攻毒后，检测攻毒组的阳性率为100％，说明攻毒造模成功；治疗组灌服噬菌体后，治疗组阳性率迅速下降，在第20日龄阳性率降低至0％，在随后的检测中，阳性率一直为0％；而攻毒组阳性率为80-95.00％。通过该动物实验可以得出，空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001具有较好的治疗效果，可以有效治疗空肠弯曲杆菌引起的疾病。
实施例12空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001工业化生产工艺
S1、种子制备：
(1)宿主种子制备：无菌条件下，挑取单菌落划线于固体培养基，42℃培养微氧条件下培养36-48h，然后用10mL无菌生理盐水洗涤平板上的菌落，收集菌悬液，以1％的接种量接种于液体培养基中，42℃培养微氧条件下培养24h，宿主菌浓度约1×107CFU/mL，做好的种子液置于4℃冰箱保存备用。
(2)噬菌体种子制备：将保存的噬菌体RDP-CJ-22001种子适当稀释后(浓度1×106PFU/mL)，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，42℃培养微氧条件下培养36-48h，然后用10mL生理盐水洗涤上层培养基，将洗涤液10000rpm，10min离心，然后过0.22μm的滤膜除菌，将收集到的过滤液至于4℃冰箱中保存备用。
噬菌体和宿主分别以1％和5％的比例接种于液体培养基中，42℃培养微氧条件下培养18-24h。
S2、噬菌体增殖：
在种子罐中接种2％的宿主菌，培养12-14h后，OD600在0.3-0.4，再以1％的接种量接种噬菌体种子，培养12-14h，pH趋于稳定为止。
将准备好的宿主菌以5％的接种量，接种到大发酵罐中，培养12-14h，然后再以5％的接种量接入噬菌体种子，培养12-14h，pH升高，趋于稳定，结束增殖。
种子罐参数：100-150rpm，42℃，通气量0.1-0.2vvm。发酵罐参数：60-80pm，42℃，通气量0.1-0.2vvm。
培养基成分：酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，牛肉膏0.1％，甘油0.5％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，氯化钙20ppm，氯化镁20ppm，以上为质量比。
气体成分：5％氧气、10％二氧化碳和85％氮气，以上为体积比。
S3、液体制剂工艺：
(1)过滤：分别采用采用1000nm和400nm的陶瓷膜进行过滤，以去除细胞碎片和未裂解的宿主菌，过滤压力小于0.4mpa，减小剪切力对噬菌体的损伤。
(2)除菌：采用三级过滤(聚丙烯1.00μm，聚醚砜0.45μm，聚醚砜0.22μm)除菌。
(3)浓缩：采用100kd的卷式膜进行浓缩，以提高噬菌体效价。
(4)稳定剂：加入甘油5％，海藻糖3％，聚山梨醇酯3％，磷酸二氢钠3％，磷酸钠2％，以上为质量比；搅拌至完全溶解，即得噬菌体液体制剂，通过双层平板法，测定其效价，效价≥1×108PFU/mL。
(5)将过滤除菌的噬菌体液体制剂置于4℃条件下储存。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一株空肠弯曲杆菌噬菌体（Campylobacter jejuni phage）RDP-CJ-22001，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO45405。
2.一种组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001。
3.根据权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者权利要求2所述的组合物在制备杀灭或抑制空肠弯曲杆菌的产品中的应用。
4.一种噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂的有效成分包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者权利要求2所述的组合物。
5.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂的有效成分包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者权利要求2所述的组合物。
6.一种消毒剂，其特征在于，所述消毒剂的有效成分包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001或者权利要求2所述的组合物。
7.一种如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的工业化生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.种子制备，包括宿主种子制备和噬菌体种子制备，其中，
（1）宿主种子制备：无菌条件下，挑取单菌落划线于固体培养基，42℃培养微氧条件下培养36-48h，然后用10mL无菌生理盐水洗涤平板上的菌落，收集菌悬液，以1%的接种量接种于液体培养基中，42℃培养微氧条件下培养24h；做好的种子液置于4℃冰箱保存备用；所述微氧条件为85%N2，10%CO2，O25%，以上为体积比；
（2）噬菌体种子制备：将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，42℃培养微氧条件下培养36-48h，然后用10mL生理盐水洗涤上层培养基，将洗涤液10000rpm，10min离心，然后过0.22μm的滤膜除菌，将收集到的过滤液至于4℃冰箱中保存备用；
噬菌体和宿主分别以1%和5%的比例接种于液体培养基中，42℃培养微氧条件下培养18-24h；
S2.噬菌体增殖：在种子罐中接种2%的宿主菌，培养12-14h后，OD600在0.3-0.4，再以1%的接种量接种噬菌体种子，培养12-14h，pH趋于稳定为止；
将准备好的宿主菌以5%的接种量，接种到大发酵罐中，培养12-14h，然后再以5%的接种量接入噬菌体种子，培养12-14h，pH升高，趋于稳定，结束增殖；
S3.液体制剂工艺：
（1）过滤：分别采用采用1000nm和400nm的陶瓷膜进行过滤，以去除细胞碎片和未裂解的宿主菌，过滤压力小于0.4mpa；
（2）除菌：采用三级过滤除菌，所述三级过滤分别为聚丙烯1.00μm、聚醚砜0.45μm、聚醚砜0.22μm；
（3）浓缩：采用100kd的卷式膜进行浓缩，以提高噬菌体效价；
（4）加入稳定剂，搅拌至完全溶解，即得噬菌体液体制剂。
8.根据权利要求7所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤S2噬菌体增殖中，种子罐参数：100-150rpm，42℃，通气量0.1-0.2vvm；发酵罐参数：60-80pm，42℃，通气量0.1-0.2vvm。
9.根据权利要求7所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22001的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤S3液体制剂工艺中，所述稳定剂的成分为：甘油5%、海藻糖3%、聚山梨醇酯3%、磷酸二氢钠3%、磷酸钠2%，以上均为质量比。
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