CN113444695A - 一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术畜禽养殖大肠杆菌防控领域，具体涉及一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M 2020664。本发明中的噬菌体GDCP17发酵效率高，在最佳感染复数M=0.01时发酵6h效价就能达到2.3×10¹²PFU/ML。其对养殖中常见的21种血清型的大肠杆菌具有裂解作用，尤其对近年来时常发生的引起蛋鸡感染的大肠杆菌O78具有良好的杀灭效果，可有效防治大肠杆菌O78对蛋鸡引起的感染，一周内可有效减少80%死亡率，为食品安全要求下蛋鸡的养殖提供了新的防治方法。

Description

一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)在发现之初，一直被当做非致病性细菌，被认为是正常肠道菌群的组成部分。直到20世纪中期,研究者才逐渐认识到一些特殊血清型的大肠杆菌可以引起人和动物严重腹泻和败血症,尤其针对婴儿和幼畜幼禽更加严重。近年来随着规模化集约化养殖的大力发展与推广,病原性大肠杆菌对畜禽养殖业所造成的经济影响已日益明显,甚至威胁到畜牧业的健康可持续发展。细菌性疾病发病情况的调查表明，作为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一的大肠杆菌,已经成为致病率最高的病原菌，家禽养殖中大肠杆菌病更是屡见不鲜，困扰着养殖人员。

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)的一种，可引起禽的大肠杆菌病，多发于春初秋末及梅雨季节，常与其他呼吸道疾病混合感染，导致禽类的全身性感染和特征性纤维性病变，如肝周炎、心包炎、气囊炎及卵黄性腹膜炎等一系列病症，严重者可引起败血症导致禽类死亡，给养禽业造成不可弥补的经济损失。相关研究表明大肠杆菌O抗原血清型共有196种，我国报道中鸡大肠杆菌的主要流行的血清型有O1、O2、O5、O7、O78、 O103等。张召兴等的研究表明，河北地区蛋鸡源大肠杆菌血清型以O78型(74.2％)、O2型(11.7％)和O89型(9.2％)为主要流行的血清型。贾雪波等报道，安徽和山东部分地区分离的大肠杆菌中25％为血清型O78、12.5％的O1血清型、15％的血清型O2和47.5％其他未定血清型。徐政平报道指出从江苏、山东、浙江、上海和安徽等5省市不同地区分离到的120株鸡源大肠杆菌流行的优势血清型为O78和O88。刁有江等报道山东部分地区的分离到的96株禽致病性大肠杆菌以078、O2、O15、O18、O143和O88等血清型为主。AP EC的血清型众多，且不同国家和地区流行的血清型存在一定的差异，给该病的疫苗免疫带来了极大的挑战。目前，禽大肠杆菌病的防治通常通过抗生素或抗菌药物进行治疗。但该方法常受到细菌耐药性的变化及其对人类的潜在威胁等因素制约，有效性一直不稳定。此外，抗生素的使用已经带来了一系列的食品安全问题，我国在蛋鸡养殖中已经禁用了大多数的抗生素。因此临床上亟需开发一种新的高效防治该病的生物制剂。

近年来，人类发现在病毒家族中，有一类病毒专门以细菌为宿主，造成细菌死亡。敏锐的科学家立即意识到，或许我们可以利用这种病毒来对抗超级细菌。这类病毒就是噬菌体，是感染细菌的病毒，它常分离自污水或粪便等自然环境样本中，并且它具有严格的宿主特异性，只侵袭一种或几种细菌，所以噬菌体对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。噬菌体可以分为温和噬菌体与烈性噬菌体两大类，其中烈性噬菌体可以在短时间内造成敏感细菌裂解。噬菌体疗法在1915年就被发现，在杀菌效果方面，烈性噬菌体能裂解细菌并具有指数增殖特性，可开发成具有杀菌作用的生物制剂。张培东的研究发现大肠杆菌噬菌体Bp6悬液对雏鸡是安全的，在感染致病性大肠杆菌前3h给雏鸡气囊接种6×108pfu 噬菌体，雏鸡的死亡率由90％降至20％。吴伟胜的研究表明在感染前6h内或者感染时口服或者腹腔注射大肠杆菌噬菌体Bp5对大肠杆菌的感染具有一定的预防和治疗作用。

申请CN111053790A公开了一株致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法，该大肠杆菌噬菌体口服制剂所述噬菌体菌株对于产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac具有较强的裂解作用，未见报道其对其他血清型大肠杆菌菌株有裂解作用。

申请CN112662635A公开了一株耐高温型大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031及其应用，该噬菌体具有较高的温度耐受性，在60℃条件下处理30min和60min，其效价仅下降1个数量级。感染复数为0.1时培养8h后效价达到1.16×1012。该噬菌体未见用于实验室裂解细菌及临床治疗细菌性疾病。

申请CN106591241A公开了一种新型肠出血性大肠杆菌O157噬菌体，主要用于防治污水排放中0157的污染或因O157引起的感染。

申请CN110129283A公开了一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体，该噬菌体对大肠杆菌具有较好的裂解作用，对食品及养殖环境中的大肠杆菌具有良好的消杀作用，同时也可以防治大肠杆菌引起的疾病，用于雏鸡2周内可减少70％的死亡。

申请CN106754751A公开了一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体对EHEC 具有高效杀菌能力。

申请CN112680423A公开了一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，所述大肠杆菌噬菌体除对大肠杆菌有较高的裂解率，还对沙门氏菌、阴沟肠杆菌和志贺氏菌具有良好的裂解效果，但其未说明对何种血清型大肠杆菌的作用。

申请CN107164336B公开了一种大肠杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体对空间环境中肠出血性大肠杆菌，特别是mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌具有较好的消杀效果。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株大肠杆菌噬菌体，所述噬菌体的保藏编号为CCTCCNO：M 2020664。

本发明的另一个目的在于提供了一株大肠杆菌噬菌体在制备大肠杆菌消杀剂中的应用。

本发明的另一个目的在于提供了一株大肠杆菌噬菌体在制备治疗或预防蛋鸡大肠杆菌 O78感染的生物药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人自湖北某养鸡场附近水样中，分离出一株大肠杆菌噬菌体GDCP17，该噬菌体已于2020年10月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2020664，分类命名：大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GDCP17。

该噬菌体具有常规大肠杆菌噬菌体的形态特性，但是具备很高的发酵活力，在MOI＝0.01 时，培养6h效价达到最高2.3x10¹²PFU/ml。

一株大肠杆菌噬菌体在制备大肠杆菌消杀剂中的应用，所述的噬菌体可用于多种血清型大肠杆菌的裂解，具有强力和广谱的裂解效果特别是针对大肠杆菌O78血清型菌株。

一株大肠杆菌噬菌体在制备治疗或预防蛋鸡大肠杆菌O78感染的生物药物中的应用，是将本发明的大肠杆菌噬菌体，作为有效成分或有效成分之一，用于蛋鸡的口服，可减少蛋鸡大肠杆菌O78感染引起的死亡。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

现有发明专利中涉及到的大肠杆菌噬菌体大多应用于环境消杀和大肠杆菌防治，但其未有专门针对大肠杆菌O78血清型的噬菌体制剂。本发明中的噬菌体GDCP17发酵效率高，在最佳感染复数M＝0.01时发酵6h效价就能达到2.3×10¹²PFU/ML。其对养殖中常见的21种血清型的大肠杆菌具有裂解作用，尤其对近年来时常发生的引起蛋鸡感染的大肠杆菌O78 具有良好的杀灭效果，可有效防治大肠杆菌O78对蛋鸡引起的感染，一周内可有效减少80％死亡率，为食品安全要求下蛋鸡的养殖提供了新的防治方法。

具体实施方式

下面结合实施案例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

大肠杆菌噬菌体GDCP17分离纯化：

采集自湖北某养鸡场附近水样6份，每份20mL，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的2×TSB液体培养基及1mL处于对数期的大肠杆菌菌液(10⁸cfu/mL)均匀混合，于37℃下180rpm过夜培养，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液100uL与其宿主大肠杆菌菌液300uL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入 4mL冷却至50℃的TSB半固体琼脂培养基，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养8-12h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL TSB液体培养基中，加入100uL相应的宿主大肠杆菌菌液并混匀，37℃下180rpm过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。

最后获得一株噬菌体，命名为噬菌体GDCP17，该噬菌体已于2020年10月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M2020664，分类命名：大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GDCP17。

实施例2：

不同感染复数及不同感染时间下大肠杆菌噬菌体GDCP17的效价测定

挑取宿主大肠杆菌单个菌落，接种到盛有3ml TSB培养液的试管中，37℃摇床中180rpm振荡培养过夜，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到l0ml TSB培养液， 37℃180rpm振荡培养至对数前期。将噬菌体GDCP17及其宿主大肠杆菌分别稀释至一定的浓度并计数，按照不同的感染复数比例混合培养(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB 液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中180rpm振荡培养12h，每3h无菌取出5mL 培养液进行5000rpm离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，12h后结束培养。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。

结果如表1所示，噬菌体GDCP17在MOI＝0.01时，培养6h效价达到最高(2.3x10¹²PFU/ml)。噬菌体GDCP17感染大肠杆菌的最佳MOI为0.01，且感染时间为6h时效价达到最高，随后随着感染时间增加效价呈现下降趋势，但整体数量级未发生较大波动，提示该噬菌体大规模生产发酵时间短，仅约6小时就能达到很高的发酵水平。

表1不同感染复数下大肠杆菌噬菌体GDCP17的效价

实施例3：

大肠杆菌噬菌体GDCP17的pH稳定性试验

取无菌细菌瓶分别加入不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的TSB培养基 9mL后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液，于 25℃环境中静置4h。分别于第1h、2h和4h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。

结果如表2所示，大肠杆菌噬菌体GDCP17在pH为3-11范围内处理1h其效价无明显变化，4h后仍具有较高效价。

表2反应不同时间后大肠杆菌噬菌体GDCP17的pH值稳定性

实施例4

大肠杆菌噬菌体GDCP17的稳定性试验

取若干支无菌50mL离心管，各加入45mL TSB后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液，于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、 85℃的温度中作用1h、24h、48h、1W、4W、8W、12W、24W和52W。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。

结果如表3所示，实验组中大肠杆菌噬菌体GDCP17在温度为65℃以下较易存活，在65℃水浴1h后仍有较高的效价，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。

表3噬菌体GDCP17于不同温度下存放不同时间后的效价(起始效价：5.0x10⁹PFU/mL)

实施例5

大肠杆菌噬菌体GDCP17毒力基因或不良基因缺失检测

选取42种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表4)，通过测定大肠杆菌噬菌体GDCP17全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。

结果显示，供试噬菌体不含有下列42种毒力基因中的任何一种。供试噬菌体无不良基因。因此在临床使用中该噬菌体不存在毒力基因隐患。

表4病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因

实施例6

大肠杆菌噬菌体GDCP17对大肠杆菌裂解范围试验

取效价约为5.0x10⁸PFU/mL大肠杆菌噬菌体GDCP17的原液，分别采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。

挑取分离自全国不同地区包含O78在内21种不同血清型的154株大肠杆菌的单克隆，分别接种于盛有3mL TSB的离心管中，37℃180rpm培养8h，制得各株细菌菌悬液。取300uL 菌悬液分别与TSB半固体培的养基混合铺于已制备好的TSA平板上，取10uL噬菌体GDCP17培养液滴于平板上。待自然风干后37℃培养8-12h，观察结果。试验重复三次。同时以实验室前期分离到的一株与本发明的噬菌体GDCP17有类似裂解谱的噬菌体phage B作为对照。

结果如表5所示，大肠杆菌噬菌体GDCP17可裂解154株大肠杆菌中的130株，包含所有的21种血清型，裂解率为84.4％；对其中的57株大肠杆菌O78的裂解率为93％；大肠杆菌噬菌体phage B可裂解154株大肠杆菌中的133株，包含所有的21种血清型，裂解率为86.4％；对其中的57株大肠杆菌O78的裂解率为94.7％。说明噬菌体GDCP17和噬菌体phageB均具有较宽的宿主谱且在防治大肠杆菌O78引起的蛋鸡感染方面具有极大的应用潜力。

表5大肠杆菌噬菌体GDCP17裂解谱测定结果

“-”表示不裂解；“+”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑较为清晰；“+++”表示裂解，裂解斑非常清晰。

实施例7

大肠杆菌噬菌体GDCP17对非致病性细菌和有益菌的裂解试验

挑取包括大肠杆菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌等在内的39株非致病性细菌和有益菌单菌落分别接种于盛有3mL TSB的离心管中，180rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300uL菌悬液分别与TSB半固体培养基混合铺于TSA平板上。取10uL噬菌体培养液滴于平板上。待自然风干后37℃培养5-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表7所示，在本研究中，大肠杆菌噬菌体GDCP17不可裂解上述39株非致病菌中的38株，说明该噬菌体在临床应用上具有相对安全性，不会对受试非致病菌和有益菌产生影响。

表7大肠杆菌噬菌体对非致病性细菌和有益菌的作用

“-”表示不裂解；“+”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑较为清晰；“+++”表示裂解，裂解斑非常清晰。

实施例8

噬菌体GDCP17发酵制备

挑取宿主大肠杆菌单个菌落，接种到盛有3ml TSB培养液的试管中，37℃摇床中180rpm 振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml TSB培养液中，37℃ 180rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。发酵制备的体系为6L，发酵培养基为 TSB培养基。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中接入噬菌体和宿主沙门菌。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。

由表7可知，噬菌体GDCP17在发酵6h后效价有大幅度提高，达到5.5x1012PFU/ml。因此，可利用发酵法对该噬菌体进行大规模工业制备，且发酵时间短发酵效率高，节约成本。

表7大肠杆菌噬菌体GDCP17的发酵动态

实施例9

噬菌体GDCP17临床使用效果

取140只2周龄的蛋鸡，随机分为4组，每组35只。分别是治疗组(GDCP17)、phageB组、攻毒组及空白组。治疗组、phageB组及攻毒组每只给予0.2ml浓度为109cfu/ml的致病性大肠杆菌(血清型为O78)，空白组给予0.2ml PBS，隔离饲养。攻毒24h后每组随机挑选5只解剖统计肝脏细菌载量，同时治疗组和phageB组给予相应的噬菌体治疗，噬菌体浓度为108PFU/ML，每天饮水3h，连续饮4天。攻毒组及空白组正常饲喂。治疗结束后第1 天统计各组雏鸡存活情况及肝脏载菌量，结果见表8。

表8噬菌体GDCP17对致病性大肠杆菌治疗效果

a.噬菌体GDCP17对雏鸡存活率影响

b.噬菌体GDCP17对雏鸡肝脏载菌量影响

时间	治疗组	Phage B组	攻毒组	空白组
					2d	≥9.2x10<sup>3</sup>	≥6.9x10<sup>3</sup>	≥1.2x10<sup>4</sup>	0
6d	≤45	≤57	≥3.9x10<sup>6</sup>	0

表8结果显示，虽然噬菌体GDCP17及phage B具有相似的裂解谱及裂解率，但在治疗大肠杆菌O78引起的感染中两株噬菌体有显著差异，说明即使噬菌体裂解谱和裂解率相同或者相似，在用于临床上也存在不同的效果。

Claims (3)

1.一株分离的大肠杆菌噬菌体（Escherichia phage），所述噬菌体的保藏编号为CCTCCNO：M 2020664。

2.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体在制备大肠杆菌消杀剂中的应用。

3.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体在制备治疗或预防蛋鸡大肠杆菌O78感染的生物药物中的应用。