CN114958779B - 一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体lpcpa6及应用 - Google Patents

一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体lpcpa6及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114958779B
CN114958779B CN202210623114.6A CN202210623114A CN114958779B CN 114958779 B CN114958779 B CN 114958779B CN 202210623114 A CN202210623114 A CN 202210623114A CN 114958779 B CN114958779 B CN 114958779B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
clostridium perfringens
lpcpa6
bacteriophage
pfu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210623114.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114958779A (zh
Inventor
李锦铨
任丽
廖水姣
邹更
赵雯琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Publication of CN114958779A publication Critical patent/CN114958779A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114958779B publication Critical patent/CN114958779B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
    • A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
    • A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B4/22—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C3/00—Preservation of milk or milk preparations
    • A23C3/08—Preservation of milk or milk preparations by addition of preservatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10331—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及食品安全和生物技术领域，公开了一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体LPCPA6及应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M2022035。本发明中的产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6可裂解A型和C型产气荚膜梭菌，裂解率为86.67%。同时具有很强且持续的抑菌作用，在12 h内能完全抑制产气荚膜梭菌的生长，具有很好的pH耐受性（pH 2‑12），37oC条件下培养1 h，效价仍保持在107 PFU/mL。本发明还公开了该噬菌体作为生物控制剂能够抑制牛奶和鸡胸肉中由产气荚膜梭菌引起的污染，从而保证食品的安全卫生；本发明公开的噬菌体具有对产气荚膜梭菌感染导致的动物肠道疾病进行生物防控的潜力。

Description

一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体LPCPA6及应用
技术领域
本发明涉及食品安全和生物技术领域，具体涉及一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体LPCPA6及应用，特别是在控制食品源和禽类动物致病性产气荚膜梭菌感染中的应用。
背景技术
产气荚膜梭菌是一种产芽孢厌氧的革兰阳性粗大杆菌。广泛分布于土壤、污水、食品、粪便等环境中，引起动物和人的感染甚至猝死。不仅严重危害禽类养殖业，而且是人类食源性细菌的第三大病因，当人类食用被产气荚膜梭菌污染的食物(主要为鸡胸肉和牛奶)后，会导致腹泻、胃肠道感染和气性坏疽。该菌能够产生六种主要的致病毒素(α、β、ε、ι、β2和肠毒素)，根据这些毒素是否存在，将产气荚膜梭菌分为从A至G七种类型，其中A型和C型是两种最主要的致病型。A型产气荚膜梭菌主要引起人类食物中毒和动物坏死性肠炎疾病，C型产气荚膜梭菌主要引起动物的肠炎和肠毒血症(通常是新生儿)。
在禽类养殖业中，产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎和亚临床感染严重影响了动物的生长性能，造成了巨大的经济损失。动物的坏死性肠炎通常由添加到饲料中的抗生素来预防，然而自从全面禁用饲料中抗生素促生长剂后，产气荚膜梭菌感染大幅度反弹，因此，抗生素的禁用迫切需要新的抗生素替代产品及应用方案防控产气荚膜梭菌。噬菌体是特异性裂解细菌的病毒，具有特异性强、治疗所需剂量小、研发周期短等优势，在替代抗生素防治产气荚膜梭菌感染方面有巨大的潜力。
目前，通过NCBI的PubMed数据库检索到186条与产气荚膜梭菌噬菌体相关数据。分离的产气荚膜梭菌噬菌体有69株，已知基因组信息的有19株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产气荚膜梭菌噬菌体，所述噬菌体的保藏编号为：CCTCC NO：M2022035。
本发明的另一个目的在于提供产气荚膜梭菌噬菌体在抑制产气荚膜梭菌中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人从河南省动物粪便中筛选出一株可裂解A型和C型产气荚膜梭菌的噬菌体，同时裂解性能强，在12h内，MOI分别为0.01-100的条件下，均可完全分别抑制4株产气荚膜梭菌(LCP6、LCP20、LCP28、LCP63)的生长。噬菌体的基因组全长为18554bp，其中编码基因总长度为17931bp，GC含量为30.56％，有26个开放阅读框(ORFs)。将该噬菌体LPCPA6的基因组在NCBI上进行核酸序列比对，结果如图4所示，噬菌体LPCPA6与数据库中已经公布的噬菌体Clostridium phage susfortuna比对结果为Query cover 21％，Iden t 73.83％；与噬菌体Clostridium phage CPD7的比对结果为Query cover 15％，Ident 73.66％；与其他噬菌体的比对结果Query cover均为0％，说明LPCPA6是一种新型噬菌体。由于该噬菌体的宿主为产气荚膜梭菌，因此将其命名为产气荚膜梭菌噬菌体。该噬菌体已于2022年01月07日送至中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号：CCTCCNO：M2022035，分类命名：产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridiu m perfringens phage)LPCPA6。
噬菌体LPCPA6，头部对称呈二十面体，包裹着核酸，属于有尾噬菌体目。
噬菌体LPCPA6酸碱耐受范围较宽，在pH 2-12的范围内，37℃条件下培养1h，效价仍保持在107PFU/mL；对温度有良好的耐受性，经60℃处理60min，效价仍保持在105PFU/mL，经80℃处理30min，效价保持在102PFU/mL；在37℃条件下，噬菌体LPCPA6对食品中产气荚膜梭菌的抑菌试验表明，噬菌体LPCPA6能够快速高效地防控由产气荚膜梭菌引起的食品污染。表明噬菌体LPCPA6有成为治疗产气荚膜梭菌感染动物肠道疾病生物制剂的潜力。
本发明的保护范围还包括：产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringensphage)LPCPA6在抑制产气荚膜梭菌中的应用，包括用于食品中产气荚膜梭菌的抑制剂，或是用于制备产气荚膜梭菌感染引起的疾病的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的噬菌体LPCPA6可裂解A型和C型产气荚膜梭菌，同时裂解性能强，在12h内，MOI分别为0.01-100的条件下均可完全抑制产气荚膜梭菌的生长。
(2)噬菌体LPCPA6具有很好的pH耐受性(pH 2-12)，37℃条件下培养1h，效价仍保持在107PFU/mL，表明噬菌体LPCPA6有成为治疗产气荚膜梭菌感染动物肠道疾病生物制剂的潜力。
(3)本发明的噬菌体抑菌时间持久，至少为12h。
(4)噬菌体LPCPA6在牛奶和鸡肉中对产气荚膜梭菌具有显著的抑菌作用。
附图说明
图1为本发明噬菌体LPCPA6的双层平板噬菌斑图。
图2为本发明噬菌体LPCPA6在不同MOI下对不同产气荚膜梭菌的抑菌效果；
其中：A为本发明噬菌体LPCPA6对宿主菌LCP6的裂解曲线示意图，B为本发明噬菌体LPCPA6对产气荚膜梭菌LCP20的裂解曲线示意图，C为本发明噬菌体LPCPA6对产气荚膜梭菌LCP28的裂解曲线示意图，D为本发明噬菌体LPCPA6对产气荚膜梭菌LCP63的裂解曲线示意图。
图3为本发明噬菌体LPCPA6的电镜图。
图4为本发明噬菌体LPCPA6的核酸序列比对结果图。
图5为本发明噬菌体LPCPA6的酸碱稳定性示意图。
图6为本发明噬菌体LPCPA6的热稳定性示意图。
图7为本发明噬菌体LPCPA6的最佳感染复数示意图。
图8为本发明噬菌体LPCPA6的吸附速率示意图。
图9为本发明噬菌体LPCPA6的生长曲线示意图。
图10为噬菌体LPCPA6在37℃下在牛奶中的抑菌效果。
图11为噬菌体LPCPA6在37℃下在鸡肉中的抑菌效果。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
产气荚膜梭菌噬菌体的分离制备及纯化
1、噬菌体的分离
申请人从河南省动物粪便，取适量样品放于7mL SM缓冲液4℃静置过夜，10000×g离心10min，取上清液用0.22μm滤器过滤得到滤液。取5mL滤液、2.5mL对数期的菌液以及10mL液体硫乙醇酸盐培养基(FT)混合，在37℃厌氧条件下，过夜培养，使噬菌体增殖。
将培养结束后的悬液于4℃下10000×g离心10min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液。然后用点斑法初步验证：有明显空斑样品进一步采用双层平板法，经梯度稀释，观察噬菌斑形态，最终利用宿主菌LCP6分离出了噬菌体LPCPA6。
2、噬菌体的增殖和纯化
挑取单个噬菌斑置于1mL含有100μL宿主菌菌液的FT液体培养基中，37℃，厌氧条件下培养6h左右。4℃下10000×g离心10min，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，这一步得到的滤液即为增殖后的噬菌体原液。然后进行双层平板法实验，具体步骤为：将噬菌体原液进行10倍梯度稀释，取100μL一定稀释度的噬菌体稀释液、100μL宿主菌菌液以及4mL 0.7％LB半固体培养基混匀，迅速倾倒在下层琼脂(LA)上，37℃厌氧条件下，过夜培养，再次获得长有噬菌体的双层平板。重复上述纯化步骤3至4次。采用双层平板法，对纯化后的噬菌体进行效价测定(图1所示)，效价为2.25×109PFU/mL。
3、噬菌体电镜观察
首先对噬菌体进行浓缩，具体步骤为：将噬菌体LPCPA6进行固体增殖，挑选长满噬菌斑的平板，用无菌棉棒将上层琼脂刮取到15mL的FT液体培养基中，37℃条件下，200r/min震荡培养3h。4℃下10000×g离心10min。取上清，用0.22μm滤膜过滤。在真空环境下40000r/min超速离心l.5h，弃上清，加入500μL醋酸铵溶液，得到效价1010PFU/mL的噬菌体原液。在制备好高效价的噬菌体原液后，开始进行制样，具体步骤为：用无菌水清洗铜网，然后将铜网浸入高效价的噬菌体原液中，在冰上放置5min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的PTA染液染色10min，待其自然干燥后采用透射电镜在80kV下观察。用图像处理软件ImageJ进行长度测量。
结果如图3所示，噬菌体头部对称呈二十面体，包裹着核酸，属于有尾噬菌体目。
4、噬菌体基因组测序
取1mL噬菌体原液，加入20μL DNA酶和RNA酶，涡旋2min，37℃温育40min；加入20μL2mol/L氯化锌溶液，37℃温育7min；10000×g离心1min，弃上清，加入500μL TES buffer，吹吸。65℃温育15min，加入5μL蛋白酶K，56℃温育l.5h，每隔10min上下颠倒一下。温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L CH3C00K(提前放4℃，用醋酸调pH至5.2)，冰上放置15min。13201×g离心10min，4℃。取上清，加入600μL苯酚/氯仿/异戊醇，上下轻柔反复颠倒，13201×g离心10min；取上清，加入1倍体积的异丙醇在-20℃沉淀DNA，上下颠倒后，有絮状物即是DNA。4℃下13201×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的70％乙醇洗一次，在13201×g离心10min，弃上清，待乙醇挥发后，再加20μL无菌水在常温下溶解DNA，置于-20℃下保存。将DNA样品交于测序公司完成。
该噬菌体的基因组全长为18554bp，其中编码基因总长度为17931bp。GC含量为30.56％，有26个开放阅读框(ORFs)。将该噬菌体LPCPA6的基因组在NCBI上进行核酸序列比对，结果如图4所示，噬菌体LPCPA6与数据库中已经公布的噬菌体Clostridium phagesusfortuna比对结果为Query cover 21％，Ident73.83％；与噬菌体Clostridium phageCPD 7的比对结果为Query cover 15％，Ident 73.66％％；与其他噬菌体的比对结果Querycover均为0％，说明LPCPA6为一株新型噬菌体，SEQ ID NO.1显示该株噬菌体的主要的一段特异性序列。
另外，对其基因组进行毒力因子和耐药基因的分析，没有发现编码与毒力或耐药性相关的基因，结果表明将该噬菌体应用于食品中产气荚膜梭菌及禽类动物致病性产气荚膜梭菌感染的防控中没有潜在的安全风险。上述结果说明LPCPA6是一种新型噬菌体。由于该噬菌体的宿主为产气荚膜梭菌，因此将其命名为产气荚膜梭菌噬菌体。
该噬菌体已于2022年01月07日送至中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M2022035，分类命名：产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage)LPCPA6。
实施例2：
产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage)LPCPA6裂解谱测定
实验选择产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6对15株产气荚膜梭菌进行裂解谱测定。其中，2株C型产气荚膜梭菌，13株A型产气荚膜梭菌。具体如下：
1)2株C型产气荚膜梭菌：LCP1和LCP14(CVCC1159，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；
2)13株A型产气荚膜梭菌：LCP2、LCP6、LCP9、LCP16、LCP20、LCP23、LCP27、LCP28、LCP37、LCP39、LCP49、LCP63、LCP75。
分别培养上述菌株至对数期，取100μL培养至对数期的菌液与4mL 0.7％LA半固体培养基混合，混匀后倒入预先制备好的LA固体琼脂平板上，待凝固且表面干燥后，取5μL不同梯度的稀释液分别滴加至下层琼脂表面，待其晾干后37℃厌氧条件下，过夜培养，观察噬菌体对受试菌株的裂解情况。
如表1所示，噬菌体LPCPA6可裂解A型和C型产气荚膜梭菌，裂解率为86.67％，表现出较宽的裂解范围。
表1 LPCPA6对15株产气荚膜梭菌的裂解谱
注：“+”表示噬菌体对菌株的裂解程度，“+”越多，表示裂解程度越高。
实施例3：
在MOI＝100，10，1，0.1，0.01时，噬菌体LPCPA6对4株不同产气荚膜梭菌的裂解曲线
分别接种LCP6、LCP20、LCP28、LCP63于FT中过夜培养，然后取100μL菌液转接至新鲜的FT培养基中，37℃条件下培养3h，取1mL菌液在4℃条件下10000×g离心10min，用PBS重悬菌体后采用平板计数法测量菌数，并将菌液梯度稀释至106CFU/mL。将噬菌体原液梯度稀释至不同的稀释度，备用。在96孔板中，分别按照MOI＝100、10、1、0.1、0.01加入不同稀释度的噬菌体100μL，并与100μL l06 CFU/mL的菌液混匀。另设对照组：加入200μL FT培养基；阳性对照组：加入100μL 106CFU/mL产气荚膜梭菌菌液和100μL FT培养基；酶标仪参数设定：测定波长设置为600nm，温度设置为37℃，每隔l h测定A600值。
结果如图2中的A、B、C、D所示，分别与不加噬菌体的阳性对照组相比，12h后，在不同MOI下所测的A600值都相对稳定在较低水平，LCP6、LCP20、LCP28、LCP63的生长均受到了抑制，说明该噬菌体具有较好的抑菌效果。噬菌体LPCPA6在不同MOI值下对4株产气荚膜梭菌(LCP6、LCP20、LCP28、LCP63)均表现出较好的抑菌能力。
实施例4：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6的pH稳定性的测定
以FT液体培养基为介质，用NaOH和HCl调节pH值(1-14)。取已知效价(108PFU/mL)的噬菌体原液500μL，加入到500μL不同pH值的FT液体培养基中，37℃水浴1h后测定各离心管中噬菌体的效价。
由图5可以看出，在pH 2-12的范围内，37℃培养1h，效价仍保持在107PFU/mL，在pH为8时，效价最高，在pH＝2以及pH＝12时，噬菌体仍保持较高的活性，这说明噬菌体LPCPA6有较好的耐酸碱性能。这在噬菌体治疗疾病过程中有很好的应用价值，噬菌体LPCPA6在通过消化系统的时候，可以有效保存其活性，不会因为酸碱的原因降低其活性，这可以保证有足够数量的噬菌体通过消化道，在肠道中裂解相应的产气荚膜梭菌。
实施例5：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6的热稳定性的测定
将噬菌体原液稀释至108PFU/mL，并分装于无菌离心管中，每管各500μL，将离心管分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中，分别在30min和60min后测效价。
结果如图6所示，该噬菌体在30℃-50℃效价稳定保持在108PFU/mL以上，经60℃处理60min后，效价仍保持在105PFU/mL以上，经80℃处理30min，效价保持在102PFU/mL以上。以上结果表明噬菌体LPCPA6在30℃-50℃内稳定，表现出良好的稳定性。
实施例6：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6的最佳感染复数的测定
按一定的MOI值(0.01，0.1，1，10，100)将500μL噬菌体液与500μL宿主菌菌液(108CFU/mL)混合，37℃下培养6h，10000×g离心10min，弃沉淀，用双层平板法测定不同MOI值样品中上清液的噬菌体效价，效价高的代表最佳MOI。
结果如图7所示，当MOI为0.01时，效价最高，为2.9×1011PFU/mL，即LPCPA6的最佳MOI为0.01。
实施例7：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6的吸附速率的测定
在最佳MOI＝0.01条件下，将106PFU/mL的噬菌体液与108CFU/mL的宿主菌菌液各5mL混合于已灭菌的50mL离心管中，涡旋混匀后置于37℃下震荡培养45min。每隔5min从中吸取300μL液体，在4℃的条件下，10000×g离心30s后，做连续十倍梯度稀释，用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。
结果如图8所示，吸附速率结果显示噬菌体在5min内有65％的噬菌体吸附至宿主菌上，在10min内有95％的噬菌体即可吸附至宿主菌上。
实施例8：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6的生长曲线的绘制
将噬菌体和宿主菌按最佳MOI值(MOI＝0.01)，即1mL菌数为108CFU/mL宿主菌悬液，1mL效价为106PFU/mL的噬菌体。37℃孵育10min，在4℃条件下，10000×g离心5min，弃上清，用1mL FT液体培养基重悬2次，弃上清。再和10mL FT液体培养基混匀，37℃下厌氧培养，每隔10min取样300μL，10000×g离心30s。噬菌体做连续十倍梯度稀释，取合适的稀释梯度，用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。
结果如图9所示，一步生长曲线结果显示噬菌体感染宿主菌的潜伏期约为10min，爆发期约90min，平均裂解量约为49PFU/cell。
实施例9：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6的在牛奶中对产气荚膜梭菌LCP6的抑菌效果探究
于900μL巴氏杀菌纯牛奶中加入100μL对数期的LCP6菌液，最终活菌数为4log10CFU/mL。然后加入100μL稀释的噬菌体悬液LPCPA6，最终滴度分别为6log10PFU/mL(MOI＝100)和7log10PFU/mL(MOI＝1000)。对照组中加入100μL PBS缓冲液。样品在37℃厌氧条件下孵育。孵育0h、2h、4h、6h、9h、12h后，取牛奶样品稀释到合适的浓度在脑心浸出液琼脂培养基(BHI)平板上计数细菌。每组设置三个平行。
实验结果如图10所示：在37℃条件下，MOI＝100和MOI＝1000时，与对照组相比实验组中菌数在6h时下降显著，均下降了4.58log10CFU/mL。在12h内，相比对照组(6.60log10CFU/mL)左右，实验组中菌数一直维持在较低的水平，菌数都在2.5log10CFU/mL以下。说明在37℃条件下噬菌体LPCPA6对牛奶中的产气荚膜梭菌有较好的抑菌效果。
实施例10：
产气荚膜梭菌噬菌体LPCPA6在鸡肉中对产气荚膜梭菌LCP6的抑菌效果探究
将鸡胸肉样品(1cm×1cm×0.5cm)置于无菌培养皿中央，取10μL对数期的LCP6菌液滴加在肉的表面，最终活菌数为3log10CFU/mL。在37℃厌氧条件下孵育1h。然后滴加10μL稀释的噬菌体悬液，最终滴度分别为5log10PFU/mL(MOI＝100)和6log10 PFU/mL(MOI＝1000)。对照组中加入PBS缓冲液。样品在37℃厌氧条件下孵育。孵育0h、2h、4h、6h、9h、12h后，将样品用无菌研磨棒研碎，稀释到合适的浓度在BHI平板上计数细菌。每组设置三个平行。
实验结果如图11所示：在37℃条件下，MOI＝100和MOI＝1000时，与对照组相比实验组中菌数在6h时下降显著，分别下降了3.55log10CFU/mL和3.73log10CFU/mL。在12h内，相比于对照组(6.87log10CFU/mL)，实验组中菌数一直维持在较低的水平，菌数都在3.30log10CFU/mL以下。
以上结果表明，在37℃下，噬菌体LPCPA6在牛奶和鸡肉中对产气荚膜梭菌LCP6均有较好的抑菌效果。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体LPCPA6及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggttaata ttgattacta cagtaatatt gaaataattc aaggcgaaaa tatgaatatt 60
actttaaaag ctaatgatta taaattcatt tctagtgaca aaataatctt tgttataagc 120
gataaaagta ataaatgttt agttaaaaaa gaatttaatt tatttgaagg taataaatgt 180
tttatagaat ttatttctat agaaacttta aactttccag ttggtgagtt tagttattct 240
attataggtt attttgatag cgaccaagtt tcttacttaa tagaagacaa taaaattatt 300
ataaaggagg ggttaaattg cctaaaataa 330

Claims (3)

1. 一株产气荚膜梭菌噬菌体，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO. M2022035。
2.权利要求1所述的噬菌体在制备产气荚膜梭菌抑菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的噬菌体在制备食品产气荚膜梭菌抑菌剂中的应用。
CN202210623114.6A 2022-01-21 2022-06-01 一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体lpcpa6及应用 Active CN114958779B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022100714330 2022-01-21
CN202210071433 2022-01-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114958779A CN114958779A (zh) 2022-08-30
CN114958779B true CN114958779B (zh) 2023-09-22

Family

ID=82959037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210623114.6A Active CN114958779B (zh) 2022-01-21 2022-06-01 一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体lpcpa6及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114958779B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015662B (zh) * 2021-12-14 2024-06-25 青岛润达生物科技有限公司 具有强裂解作用的产气荚膜梭菌噬菌体及其应用
CN118109343B (zh) * 2024-01-15 2024-10-01 青岛润达生物科技有限公司 一株对氧气具有耐受性的产气荚膜梭菌及其应用
CN118086222B (zh) * 2024-02-01 2024-08-06 青岛润达生物科技有限公司 一株适用于口服的产气荚膜梭菌噬菌体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110719953A (zh) * 2017-02-24 2020-01-21 尹特荣生物科技株式会社 新型产气荚膜梭菌噬菌体Clo-PEP-2及其用于抑制产气荚膜梭菌增殖的用途
CN111662880A (zh) * 2020-05-25 2020-09-15 江苏省农业科学院 一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110719953A (zh) * 2017-02-24 2020-01-21 尹特荣生物科技株式会社 新型产气荚膜梭菌噬菌体Clo-PEP-2及其用于抑制产气荚膜梭菌增殖的用途
CN111662880A (zh) * 2020-05-25 2020-09-15 江苏省农业科学院 一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114958779A (zh) 2022-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109825479B (zh) 一种宽谱沙门氏菌噬菌体lpstll及应用
CN114958779B (zh) 一株能够裂解产气荚膜梭菌的噬菌体lpcpa6及应用
CN108546685B (zh) 一种肠炎沙门氏菌噬菌体lpse28及其在食品中的应用
CN108103031B (zh) 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法
CN112063594B (zh) 一株耐高温沙门氏菌噬菌体rdp-sa-18056及其微胶囊的制备工艺
CN115948348B (zh) 一种宽谱禽源沙门菌噬菌体及其应用和组合物
CN113583971A (zh) 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
CN112708600A (zh) 一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体rdp-kp-20005及其应用
CN115612675A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体nct1及其应用
CN110656093A (zh) 一种新型沙门氏菌噬菌体库及其应用
CN117586966B (zh) 一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005及其应用
CN111057681B (zh) 一株噬菌体及其应用
CN113293143A (zh) 一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其应用
CN117431219A (zh) 耐高温型产气荚膜梭菌噬菌体及其应用
CN106795498B (zh) 噬菌体、包括其的组合物及其用途
CN114703150B (zh) 环境耐受的嗜水气单胞菌噬菌体zpah34及应用
CN114196637B (zh) 一种沙门氏菌噬菌体JNwz02及其用途
CN113444695B (zh) 一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用
CN115747172A (zh) 一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株及其应用
CN111053790B (zh) 一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法
CN114292822A (zh) 大肠杆菌噬菌体zjrp5及其应用和杀菌剂、药物
CN117737001B (zh) 一种防治犬细菌性腹泻的大肠杆菌噬菌体及其应用
CN113215111B (zh) 一种噬菌体及在防治肉鸡心内膜炎中的医用用途
CN115851617B (zh) 一种大肠杆菌噬菌体lhe83及其应用
CN118147090B (zh) 一株同时裂解多株大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant