CN113293143A - 一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术畜禽养殖沙门氏菌防控领域，公开了一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M 2020661。本发明中的噬菌体GSMP2233发酵效率高，在MOI=0.01时，培养6h效价达到8.9x10¹⁰ PFU/ml对鸡白痢沙门氏菌具有良好的净化作用，可有效降低种鸡白痢沙门氏菌的垂直传播，为沙门氏菌净化提供了一种安全、无毒副作用且可大规模发酵生产的生物防控措施。

Description

一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬 菌体及其应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种重要的人兽共患病原菌，主要寄居于人和动物的肠道中， 研究表明由沙门菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高、危害最广的一种。大 多数普遍存在的沙门菌的血清型，对动物和人类都有致病性，它们可以引起人畜共患病。世 界卫生组织(WHO)调查表明全球每年有上亿例人类胃肠炎是由沙门菌感染引起，其中死亡 病例高达300万。家禽被认为是沙门菌的主要储库。近年来，由于鸡白痢沙门氏菌的垂直传 播导致种蛋被污染而使雏鸡出现高发病率和高死亡率的例子屡见不鲜，多造成2-3周龄雏鸡 死亡，死亡率很高。并且还会导致育成鸡发病死亡，产蛋鸡产蛋量下降，在影响饲养效益的 同时阻碍养鸡业健康发展，给养鸡业带来了巨大的损失，用各种药物治疗均不理想。另外由 于孵化厅的污染造成更多的死亡，损失巨大。该病可以垂直传播和水平传播，主要传染源是 病鸡和带菌鸡。因此，要孵育出健康的雏鸡，种蛋应该保证无母源性沙门氏菌垂直污染。为 了避免种蛋携带沙门氏菌，除了平时加强饲养管理和卫生消毒工作，还应该对鸡群进行净化。

赵影等的研究表明，沙门氏菌噬菌体在预防及治疗沙门氏菌对小鼠造成的感染实验中表 现出良好的效果，可作为一种生物抑菌剂用于鼠伤寒沙门氏菌的防治。张庆美的研究证明， 噬菌体SaFB14对感染沙门氏菌CS20130523－001－1的小鼠有治疗效果。李梦哲的研究发 现，在体内抑菌实验中，给鸡口服鼠伤寒沙门氏菌，噬菌体治疗两周后鸡体内沙门氏菌比攻 毒组降低了1个数量级，具有极显著降低效果。诸多的研究表明沙门氏菌噬菌体在防治沙门 氏菌对鸡群造成的感染中具有良好的应用前景。

申请CN202010924602.1公开了一种耐高温宽裂解普的沙门氏菌噬菌体及其组合物，所 述沙门氏菌噬菌体具有良好的耐高温特性，其组合物对沙门氏菌的裂解率达98％以上，可治 疗鸡白痢沙门氏菌引起的感染。

申请CN 108359644 B公开了一种宽谱沙门氏菌噬菌体及其应用，该噬菌体对沙门氏菌 具有较强的裂解作用，还可以降低感染鸡白痢的雏鸡的死亡率。

申请CN201910936485.8公开了一种沙门氏菌噬菌体SEE-1及其应用，所述噬菌体SEE-1 在裂解肠炎沙门氏菌的实验中表现出快速高效的裂解作用，可用于污水处理系统中防治肠炎 沙门氏菌或耐药性肠炎沙门氏菌。

申请CN109825479A公开了一种宽谱沙门氏菌噬菌体LPSTLL及应用，该噬菌体为烈性噬 菌体，裂解普较宽广，能裂解鼠伤寒、肠炎及鸡白痢等13种血清型的沙门氏菌，且能裂解 多株具有耐药性的沙门氏菌。该噬菌体可作为生物控制制剂在食品贮藏中的抑菌应用，尤其 能够抑制牛奶和鸡肉中由沙门氏菌增值引起的污染，从而保证食品的安全卫生。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株沙门氏菌噬菌体，所述噬菌体的保藏编号为CCTCCNO： M 2020661。

本发明的另一个目的在于提供了沙门氏菌噬菌体在制备防治蛋鸡沙门氏菌垂直传播生 物药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人自湖北某养鸡场附近水样中筛选出一株沙门氏菌噬菌体，该噬菌体已于2020年 10月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：沙门氏菌噬菌体(Salmonella spp phage)GSMP2233，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2020661。

该噬菌体具有常规沙门氏菌噬菌体的形态特性，但是具备很高的发酵活力，在MOI＝0.01 时，培养6h效价达到8.9x10¹⁰ PFU/ml。

沙门氏菌噬菌体在制备防治蛋鸡沙门氏菌垂直传播生物药物中的应用，包括以保藏编号 为CCTCC NO：M 2020661的沙门氏菌噬菌体为有效成分或唯一有效成分，制备成蛋鸡口 服生物药物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

现有沙门氏菌噬菌体大多用于食品领域或者养殖环境消杀，而未见报道用于畜禽养殖中 控制沙门氏菌垂直传播。本发明中的噬菌体GSMP2233不仅发酵效率高，尤其对鸡白痢沙门 氏菌具有良好的净化作用，可有效降低种鸡白痢沙门氏菌的垂直传播，为沙门氏菌净化提供 了一种安全、无毒副作用且可大规模发酵生产的生物防控措施。

具体实施方式

下面结合实施案例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表 述的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特 别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

沙门氏菌噬菌体GSMP2233分离纯化

采集湖北某养鸡场附近水样3份，每份30mL，5000rpm离心10min后取15mL上清液过滤除菌，滤液与15mL 2×TSB液体培养基及1mL处于对数期的沙门氏菌菌液(10⁸cfu/mL)均匀混合，于37℃下180rpm过夜培养，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心10min， 取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液100uL与其宿主沙门 氏菌菌液300uL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加 入4mL冷却至50℃的TSB半固体琼脂培养基，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待 琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用 无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除 菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL TSB液体培养基中，加入100uL相应的宿主沙门氏菌菌 液并混匀，37℃下180rpm过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用 双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。

自湖北某鸡场污水样本中分离得到沙门氏菌噬菌体GSMP2233噬菌体在沙门氏菌菌苔 上均产生单一的圆形噬菌斑，中心透亮，直径为3mm。该噬菌体已于2020年10月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：沙门氏菌噬菌体(Salmonella spp phage)GSMP2233，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2020661。

实施例2：

不同感染复数及不同感染时间下沙门氏菌噬菌体GSMP2233的效价测定

挑取宿主沙门氏菌(Salmonella Pullorum)单个菌落，接种到盛有3ml TSB培养液的试 管中，37℃摇床中180rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到 l0ml TSB培养液，37℃180rpm振荡培养至对数前期。将噬菌体GSMP2233及其宿主沙门氏菌分别稀释至一定的浓度并计数，按照不同的感染复数比例混合培养(MOI＝噬菌体数量/ 细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中180rpm振荡培养12h。 每2h取出部分培养液进行10000g离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，12h后结束培 养。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。

结果如表1所示，噬菌体GSMP2233在MOI＝0.01时，培养6h效价达到最高(8.9x10¹0PFU/ml)，随后随着感染时间增加效价呈现下降趋势，但整体数量级未发生较大波动，提示该噬菌体大规模生产发酵时间约为6小时较为合适。

表1不同感染复数下沙门氏菌噬菌体的效价

实施例3：

沙门氏菌噬菌体GSMP2233的pH稳定性试验

取无菌细菌瓶分别加入不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的TSB培养基 9mL后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液，于 25℃环境中静置240min。分别于第1h、2h和4h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定 噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。

结果如表2所示，沙门氏菌噬菌体GSMP2233在pH为3-10范围内处理1h其效价无明显变化，pH为4-10处理4h后仍具有较高效价。

表2反应不同时间后沙门氏菌噬菌体的pH值稳定性(起始效价：5.2x10⁸PFU/mL)

注：ND：未测定。

实施例4：

沙门氏菌噬菌体GSMP2233的温度稳定性试验

取若干支无菌50mL离心管，各加入45mL TSB后置于相应温度的恒温水浴中，待温度 平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液，于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、 85℃的温度中作用1h、24h、48h、1W、4W、8W、12W、24W和52W。作用时间结束后取 出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作 双份复管培养取平均值，实验重复3次。

结果如表3所示，实验组中沙门氏菌噬菌体GSMP2233在温度为65℃以下较易存活，在65℃水浴24h后仍有较高的效价，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。

表3沙门氏菌噬菌体于不同温度下存放不同时间后的效价(起始效价：1.5x10⁹PFU/mL)

实施例5:

沙门氏菌噬菌体GSMP2233毒力基因或不良基因缺失检测

选取42种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表4)，通过测定沙门氏菌 噬菌体GSMP2233全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。

结果显示，供试噬菌体不含有下列42种毒力基因中的任何一种。供试噬菌体无不良基 因。噬菌体LPSTLL基因组中没有发现编码与毒力和耐药有关的基因，

表4病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因

实施例6:

沙门氏菌噬菌体GSMP2233对沙门氏菌裂解范围试验

实验用效价均约为1.0x10⁸PFU/mL沙门氏菌噬菌体GSMP2233和LPSTLL(公开号为CN109825479A)，分别采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。

挑取分离自临床的51株包含11种血清型的沙门氏菌单克隆，分别接种于盛有3mLTSB 的离心管中，37℃180rpm培养8h，制得各株细菌菌悬液。取300uL菌悬液分别与TSB 半固体培养基混合铺于已制备好的TSA平板上，取5uL噬菌体培养液滴于平板上。待自然 风干后37℃培养5-8h，观察结果。试验重复三次。

表5沙门氏菌噬菌体GSMP22333裂解谱测定结果

“-”表示不裂解；“+”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑较为 清晰；“+++”表示裂解，裂解斑非常清晰。

结果如表5所示，在所述11种血清型的51株沙门氏菌中，噬菌体GSMP22333可裂解8种血清型的42株沙门氏菌；噬菌体LPSTLL可裂解10种血清型的46株沙门氏菌。但 噬菌体GSMP22333可裂解全部的24株鸡白痢沙门氏菌，说明该噬菌体在防治鸡白痢沙门 氏菌引起的感染方面具有极大的应用潜力。

实施例7：

沙门氏菌噬菌体GSMP2233对非致病性细菌和有益菌的裂解试验

挑取包括大肠杆菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌等在内的31株非致病性 细菌和有益菌单菌落分别接种于盛有3mL TSB的离心管中，180rpm培养8h，制得各株细菌 菌液。取300uL菌悬液分别与TSB半固体培养基混合铺于TSA平板上。分别取10uL噬菌体培养液滴于平板上。待自然风干后37℃培养5-8h，观察结果。试验重复三次(结果见表6)。LPSTLL噬菌体对下述非致病性的裂解情况与沙门氏菌噬菌体GSMP2233相同。

表6沙门氏菌噬菌体GSMP2233对非致病性细菌和有益菌的作用

“-”表示不裂解；“+”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑较为 清晰；“+++”表示裂解，裂解斑非常清晰。

表6结果所示，在本研究中，沙门氏菌噬菌体GSMP2233不可裂解上述31株非致病性细菌及有益菌。

实施例8：

噬菌体GSMP2233发酵制备：

挑取宿主沙门氏菌单个菌落，接种到盛有3ml TSB培养液的试管中，37℃摇床中180rpm 振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml TSB培养液中，37℃ 180rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。发酵制备的体系为6L，发酵培养基为 TSB培养基。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中接入噬 菌体和宿主沙门菌。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为10h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液 过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发 酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。

表7沙门氏菌噬菌体GSMP2233的发酵动态

由表7可知，噬菌体GSMP2233于发酵6h时效价达最高5.6x10¹¹ PFU/ml。其后噬菌体的效价虽有所下降，但整体数量级未发生变化，因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。

实施例9：

噬菌体GSMP2233对鸡白痢沙门氏菌垂直传播净的化作用

选取40只沙门氏菌抗体阴性的180日龄的产蛋期母鸡，随机分成4组(GSMP2233组、LPSTLL组、攻毒组和空白组)，每组10只，预饲3天后噬菌体组给予10⁵cfu/kg的鸡白痢 沙门氏菌和10⁸pfu/kg噬菌体，攻毒组给予10⁵cfu/kg的鸡白痢沙门氏菌，空白组给予等量 PBS缓冲液。给药后第3天开始收集鸡蛋，连续收集5天，取蛋黄检测沙门氏菌，每只鸡5 枚蛋中有1枚检出沙门氏菌即为阳性，5枚蛋均未检出沙门氏菌则为阴性。结果见表9。

表9噬菌体对鸡白痢沙门氏菌垂直传播净化效果

分组	GSMP2233	LPSTLL	攻毒组	空白组
					沙门氏菌阳性率	10％	30％	100％	0

表9结果显示：沙门氏菌噬菌体GSMP2233及LPSTLL可有效降低鸡白痢沙门氏菌的垂直传播，且噬菌体GSMP2233对鸡白痢的净化作用优于噬菌体LPSTLL。

Claims (2)

1.一株分离的沙门氏菌噬菌体（Salmonella sp. phage），所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M 2020661。

2.权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体在制备防治蛋鸡沙门氏菌垂直传播生物药物中的应用。