CN114958778A

CN114958778A - 一株副溶血弧菌裂解性噬菌体gvp-p20及其在中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治应用

Info

Publication number: CN114958778A
Application number: CN202210108456.4A
Authority: CN
Inventors: 王喜亮; 黄金梅; 田甲; 张秀玲; 徐岳; 张晓东; 李越; 胡雄
Original assignee: Wuhan Grenon Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Grenon Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114958778B

Abstract

本发明提供一株副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP‑P20及其在中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治应用，所述副溶血弧菌裂解性噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M 20211479，分类命名为Vibrio parahaemolyticus phage GVP‑P20，本发明中的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP‑P20具有宿主范围广、特异性强、安全高效的特点，副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP‑P20对中华绒螯蟹中副溶血弧菌引起的疾病具有良好的预防或治疗的作用。

Description

一株副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20及其在中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治应用

技术领域

本发明属于微生物技术应用领域，特别涉及一株副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20及其在中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治应用。

背景技术

中国水产养殖近年来发展迅猛，中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是其中的支柱性养殖产品之一，有着不可估量的经济价值；然而随着养殖规模的不断，养殖强度的不断加大，同时也出现一系列问题，其中蟹病、蟹害的发生率也越来越严重。副溶血弧菌能引起中华绒螯蟹患病，病幼蟹感染该菌症状表现为游动无力、头胸甲发红、色素加深、背刺常折断、摄食减少和变态停滞等，24h内死亡率高达 90％以上；成蟹表现症状为不能正常脱壳、行动迟缓、进食减少、体内大量腹水，死亡率可达30～50％；副溶血弧菌不仅给水产动物健康带来高风险，也给水产养殖产业造成严重的经济损失。早期随着大量大量抗生素、化学复合物的滥用，之后使得越来越多的病原微生物产生耐药性，寻找一种安全、无害、有效的生物预防或治疗方法迫在眉睫。

噬菌体是指感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，其结构简单，特异性强，能高效裂解宿主病原菌；副溶血弧菌裂解性噬菌体体能有效裂解副溶血弧菌裂解性噬菌体，在水产养殖预防和治疗上具有非常巨大的优势和潜力，是一类具有应用前景的生物预防或治疗途径。

本发明通过筛选得到的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20，通过研究其生物学特性，为中华绒螯蟹中副溶血弧菌的生物控制提供新的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株副溶血弧菌裂解性噬菌体(Vibrioparahaemolyticus phage)；

本发明的目的之二是将所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体(Vibrioparahaemolyticus phage)应用于防治中华绒螯蟹的副溶血弧菌病。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

申请人在江苏南通某水产养殖水塘，分离出一株副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20，所述噬菌体在2021年11月23日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学；保藏编号为CCTCC NO： M 20211479，分类命名为Vibrio parahaemolyticus phageGVP-P20。

进一步地，所述副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20具有较宽的裂解谱，对分离自全国不同省份的117株致病性副溶血弧菌裂解率达 91.2％(107/117)，其中对6种血清型副溶血弧菌裂解率高于90％，分别为O1血清型裂解率90.5％，O2血清型裂解率95.5％，O3血清型裂解率93.3％，O4血清型裂解率94.7％，对O8血清型裂解率100％， O11血清型裂解率100％(10/10)。

进一步的，所述副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20能用于工业生产发酵及对水产养殖的预防与治疗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所述副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在工业上有巨大经济效益和对中华绒螯蟹的副溶血弧菌的防治应用。

2、本发明所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20裂解谱宽，对不同血清型副溶血弧菌均有较高的裂解率。

3、本发明所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在最佳感染复数MOI＝0.01时，发酵效价为2.95×10¹⁰PFU/mL。

4、本发明所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在pH为5-9范围内处理8h其效价无明显变化，pH为3-11处理1h后仍具有较高效价。

5、本发明所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在温度为65℃以下较易存活，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。

6、本发明所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在发酵制备6h时，效价达到最高，为2.02×10¹⁰PFU/ml，在6h至12h时间段，效价稳定在10¹⁰PFU/mL；因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。

7、本发明所述的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在对中华绒螯蟹中副溶血弧菌疾病的治疗实验中，噬菌体治疗效果与抗生素治疗效果相当，低、中和高剂量噬菌体治疗的中华绒螯蟹存活率分别为76％、 78％和86％；噬菌体治疗组的载菌与抗生素治疗组检出率相当，均比攻毒组下降了90％。

8、本发明中的副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20具有宿主范围广、特异性强、安全高效的特点，副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20对中华绒螯蟹中副溶血弧菌引起的疾病具有良好的预防或治疗的作用，能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源和大规模发酵生产的生物预防措施。

附图说明

图1为本发明副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20噬菌斑；

图2为本发明副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20电镜图；

图3为本发明不同感染复数下副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20 的效价；

图4为本发明反应不同时间后副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20 的pH值稳定性；

图5为本发明副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20于不同温度下存放不同时间后的效价；

图6为本发明溶藻弧菌噬菌体GVP-P20的工业发酵动态；

图7为本发明不同浓度副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20对中华绒螯蟹中副溶血弧菌疾病的治疗实验结果。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：

副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20的分离纯化

在江苏南通某水产养殖水塘采集水样3份，每份50mL，6000rpm /min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，取5mL处理后上清液与0.5mL副溶血弧菌(浓度为5×108CFU/mL左右)混合均匀，静止吸附15min后，放置于28℃培养箱中150rpm/min振荡发酵培养过夜；取发酵后液体6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22 μm滤器除菌，得种子滤液，取滤液100μL与300μL副溶血弧菌(浓度为5×108CFU/mL左右)混合均匀，静止吸附15min后，将混合物与2％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)混合均匀，浇筑在2％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。记录培养皿噬菌体的效价，在培养皿上挑取噬菌斑透而亮的斑点，于 1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL2％氯化钠TSB液体培养基中，加入100uL相应的宿主副溶血弧菌菌液并混匀，静止吸附15min，37℃下150rpm/min过夜培养，5000rpm/min离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。

所分得副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为3mm。该噬菌体GVP-P20已于2021年11月2 3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为GVP-P20，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 20211479。

实施例2：

副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20对副溶血弧菌裂解范围实验

采用双层点滴法来测定噬菌体的裂解谱。准备好足量的盛有3mL 的2％氯化钠TSB的EP管，355株副溶血弧菌接种于该培养基中，37℃恒温200rpm/min振荡7h，得到355份副溶血弧菌菌液；准备好足量的TSA底板，将0.9ml副溶血弧菌菌液与50℃左右的6mlTSB半固体培养基(含0.65％琼脂)混合均匀，缓慢平铺于TSA底板之上；待平板培养基凝固至常温后，取副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20溶液7 μL滴于双层板中心，等溶液自然风干后，放置于37℃恒温生化培养箱中培养7h左右，观察结果。每组实验重复3次。

结果如表所示，副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20具有高裂解率，在117株副溶血弧菌裂解实验中，能裂解其中107株，裂解率为 91.2％，说明副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20裂解谱较宽，在防治水产养殖中副溶血弧菌病具有巨大应用潜力；其中对O1血清型裂解率为90.5％，对O2血清型裂解率为95.5％，对O3血清型裂解率为93. 3％，对O4血清型裂解率为94.7％，对O5血清型裂解率为88.2％，对 O6血清型裂解率为50.0％，对O8血清型裂解率为100％，对O9血清型裂解率为66.7％，对O10血清型裂解率为50.0％，对O11血清型裂解率为100％，该噬菌体为防治不同血清型副溶血弧菌的治疗提供参考方法。

表1副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20对117株副溶血弧菌裂解结果

实施例3：不同感染复数及不同感染时间下副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20 的效价测定

准备副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20的宿主菌副溶血弧菌VPL N1，准备好装有3mL 2％氯化钠TSB的EP管，挑取副溶血弧菌单菌落接种于培养基中，在37℃条件下振荡培养8h，得到宿主菌菌液。按接种量1％接种菌液至100mL TSB培养基中，待副溶血弧菌生长至对数初始期时(浓度1×107CFU/mL)，随后将副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20接种于该培养基中，按照不同的感染复数(multiplicit y of infection，MOI；MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，每组实验3个平行。在28℃摇床中150rpm振荡培养12h。每2h取出部分培养液进行8000rpm/min离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，12h后结束培养。

实验结果如图3所示，在MOI＝0.01时，发酵6h，效价最高，为 2.95×10¹⁰PFU/mL。

实施例4

副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20的pH稳定性试验

取无菌细菌瓶分别加入不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13)的2％氯化钠TSB培养基9mL后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液(起始效价： 2.24×108PFU/mL)，于25℃环境中静置240min。分别于第1h、2h、 4h和8h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。

结果如图4所示，副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在pH为5-9 范围内处理8h其效价无明显变化，pH为3-11处理1h后仍具有较高效价。

实施例5：

副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20的温度稳定性试验

取若干支无菌50mL离心管，各加入45mL TSB后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液(起始效价： 5.40×10⁸PFU/mL)，于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、 85℃的温度中作用1h、24h、48h、1W、4W、8W、12W、24W和48W。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。

结果如附图5所示，实验组中副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20 在温度为65℃以下较易存活，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。

实施例6：

副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20的工业发酵制备

从宿主菌副溶血弧菌平板上挑取单菌落，接种于3mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm/min培养8h，得到宿主菌液。将菌悬液以1％接种量接种于100mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm/min培养至对数期前期。发酵体系为6L，发酵培养基为普通TSB培养基，初始PH值为7.0；采用火焰法按1％接种量接种副溶血弧菌，以最佳感染复数MOI＝0.01向发酵体系加入噬菌体，发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心 15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。

由图6可知，副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20在发酵制备6h 时，效价达到最高，为4.62×10¹⁰PFU/mL，在6h至12h时间段，效价稳定在10¹⁰PFU/mL；因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。

实施例7：

不同浓度副溶血弧菌裂解性噬菌体GVP-P20对中华绒螯蟹中副溶血弧菌疾病的治疗实验

实验中华绒螯蟹由湖北省荆州市某中华绒螯蟹养殖场提供，所选中华绒螯蟹外观正常健康，个体均重在50±0.5g；实验前将中华绒螯蟹统一放置于150L水族箱中适应饲养14d，水体pH值为7.2±0.1，温度为25℃～28℃，溶解氧为6.6±0.1mg/L，待蟹死亡率稳定在0％～5％以内时，进行实验。将实验分为5个组，分别为对照组(每只注射 0.2mL无菌生理盐水)、攻毒组(每只注射0.2mL的1×10⁶CFU/mL副溶血弧菌菌液)、治疗1组(每只注射0.2mL的1×10⁶CFU/mL副溶血弧菌菌液，治疗噬菌体浓度10⁷PFU/L)、治疗2组(每只注射0.2mL 的1×10⁶CFU/mL副溶血弧菌菌液,治疗噬菌体浓度10⁸PFU/L)、治疗 3组(每只注射0.2mL的1×10⁶CFU/mL副溶血弧菌菌液,治疗噬菌体浓度10⁹PFU/L)、抗生素组(每只注射0.2mL的1×10⁶CFU/mL副溶血弧菌菌液,氧哌嗪青霉素浓度1mg/L)，每组50只，攻毒均为第3足注射，连续攻毒3天，出现症状后停止攻毒，立即进行治疗。治疗组连续治疗4天，每天换水1/2，并记录蟹的症状及死亡情况，治疗结束后观察继续7天，对存活蟹的载菌率进行检测。

实验结果如表2及图7所示，14d后，空白组存活率为96％，攻毒组中华绒螯蟹存活率为20％；治疗1组存活率为76％，治疗2组存活率为78％，治疗3组存活率为86％，抗生素组存活率为88％；存活蟹载菌率抗生素组与治疗3组均为10％，治疗1组与治疗2组分别为20％和16％，攻毒组载菌率为100％，说明噬菌体GVP-20对副溶血弧菌有非常明显的杀灭效果，对副溶血性弧菌病具有良好的治疗作用，可以作为一种生物抗菌剂用于中华绒螯蟹的副溶血弧菌的预防和治疗。表2不同浓度噬菌体GVP-P20对中华绒螯蟹副溶血弧菌病的治疗效果

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一株副溶血弧菌裂解性噬菌体(Vibrio parahaemolyticus phage)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M 20211479，分类命名为Vibrio parahaemolyticus phage GVP-P20。

2.权利要求1所述副溶血弧菌裂解性噬菌体(Vibrio parahaemolyticusphage)的应用，其特征在于，应用于中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治。