CN110184222B - 一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂，采用多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。还公开了制剂的制备方法以及应用。本发明制剂对多种水产病原菌有裂解作用、高效且安全，解决了传统采用单一活性病原菌作为宿主菌所产生的噬菌蛭弧菌噬菌单一性及环境污染问题，保证了噬菌蛭弧菌的噬菌多样性的同时，还提高了其裂解活性。

Description

一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其应用

技术领域

本发明涉及海水养殖的技术领域，具体涉及一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂和应用。

背景技术

养殖水体的质量往往决定着水产动物能否健康生长，而水体各种病原菌的侵扰会使水产动物抗病力下降甚至导致死亡。常用的水体消毒一般使用化学制剂或抗生素，长期的使用会造成环境水体污染与不断增强病原菌耐药性。

噬菌蛭弧菌是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌，主要为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与弧菌等阴性病原菌，且对人与动物无害，近年来蛭弧菌相关制剂的研究，越来越受到人们的青睐。

噬菌蛭弧菌不生成芽孢、且对环境温度要求较为苛刻。一般的液体蛭弧菌制剂容易导致产品本身pH改变、杂菌增多，有毒有害物质因子积累，最终导致蛭弧菌数下降。因此，常温下液体制剂蛭弧菌保质期只有短短三四个月左右。所以人们开始逐渐由液体转向粉剂制剂方向研究。

通过调研蛭弧菌相关专利文献，发现大部分冻干蛭弧菌制剂一般采用活宿主菌大肠杆菌培养，其中存在几点缺陷：一方面培养结束后需要分离未裂解大肠杆菌，操作繁琐；另一方面活宿主菌若分离不干净，则存在安全隐患，可能会破坏环境，引入病原菌，不利于大规模使用蛭弧菌制剂；又一方面使用一种宿主菌培养长时间可能导致蛭弧菌功能缺失，对其他种病原菌侵染能力下降或散失。而本发明的一种噬菌蛭弧菌冻干粉，其制备生产工艺通过巧妙合理设计，使得上述问题都得到很好的解决，同时制备获得的蛭弧菌制剂具有高活性，对多种病原菌能高效裂解、安全环保等特点。

发明内容

本发明目的是为了克服采用单一宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且能保证无外入病原菌污染水体，而提供一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂和应用。

本发明人经过深入研究之后发现，单一活性菌株宿主菌多次培养噬菌蛭弧菌后，会造成噬菌蛭弧菌侵染能力变的较为单一，且病原宿主菌若去除不干净造成水体污染。而若一直采用死宿主菌培养噬菌蛭弧菌，则可能会造成噬菌蛭弧菌对活宿主菌无侵染能力。

故本发明采用多种宿主病原菌混合培养噬菌蛭弧菌，先采用活宿主菌培养后，过滤除病原菌，再采用灭活宿主病原菌混合扩大培养。基于此，完成了本发明。

具体地，本发明的解决方案是：所述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂，采用多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。

优选地，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：大肠杆菌BL21、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌与铜绿假单胞菌其中的3种或者3种以上。

优选地，所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*10¹⁰PFU/g以上。

优选地，所述冻干保护剂为甘油1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。

优选地，所述冷冻干燥处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。

优选地，所述多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。

本发明还提供了一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的制备方法，该方法包括将多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。

优选地，所述制备的方法包括以下步骤：

(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，10g/L氯化钠，pH7.0-7.5的发酵液中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；

(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌海水稀释，使菌浓在10⁸-10¹⁰CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；

(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌海水稀释后，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；

(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得混合灭活宿主菌，用灭菌海水调节菌浓，使菌浓在10⁸-10¹⁰CFU/mL，后按2-5wt％接种量接入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌菌液，活菌数在3-6*10¹⁰PFU/mL；

(5)噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤(3)灭活宿主菌按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。

优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m³/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；

优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为大肠杆菌BL21、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌与铜绿假单胞菌其中的3种或者3种以上。

优选地，步骤(5)所述载体按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备；

优选地，步骤(5)所述冷冻干燥处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；

最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。

采用上述方案后，本发明至少有以下优点：

一、本发明为防止噬菌蛭弧菌表现出一定的特异性(专一性)，采用多种病原宿主菌混合共培养；

二、本发明采用60-80℃，水浴10-30min，进行灭活宿主病原菌，既能有效保持宿主菌形态的完整性，利于噬菌蛭弧菌的生长繁殖，而且又能保证无活宿主菌给环境造成污染；

三、本发明噬菌蛭弧菌培养，都采用灭菌海水培养，既能保证噬菌蛭弧菌在原始培养环境，又能省去配置培养基步骤；

四、本发明在冷冻干燥预冻前再加入些许灭活宿主菌，让噬菌蛭弧菌侵入宿主菌胞内，在冷冻干燥过程中能对噬菌蛭弧菌起到双重保护作用；

五、利用本发明制备出来的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂具有高活性，高菌数(菌数可达1.0*10¹⁰PFU/g以上)，在使用上用小剂量就能达到防治病效果，使用成本低廉。

总之，本发明制剂对多种水产病原菌有裂解作用、高效且安全，解决了传统采用单一活性病原菌作为宿主菌所产生的噬菌蛭弧菌噬菌单一性及环境污染问题，保证了噬菌蛭弧菌的噬菌多样性的同时，还提高了其裂解活性。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

本发明提供了由上述方法制备得到的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂。

此外，本发明还提供了所述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在对虾养殖水体杀菌的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

所述大肠杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、创伤弧菌和沙门氏菌都是现有的常见菌种，可通过采购获得。比如，以下实施例和对比例中，大肠杆菌采购自广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.223；哈维氏弧菌采购自广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.781；溶藻弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10889；副溶血弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC23924；铜绿假单胞菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10351；嗜水气单胞菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10868；创伤弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10383；沙门氏菌采购自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GDM1.224；

实施例1海水中噬菌蛭弧菌分离试验

该实施例用于说明本发明噬菌蛭弧菌的来源及其获取方法。

从厦门集美区近海域取海水样与底泥，两者混合摇匀后于3000r/min离心5min，取上清液，用250mL三角瓶分装100mL，2小瓶，分别加入菌体浓度为10⁸CFU/mL的副溶血弧菌、溶藻弧菌富集培养，30℃，100r/min好氧培养48h。富集培养结束后采用海水琼脂双层平板分离检测，分别以副溶血弧菌、溶藻弧菌为宿主菌检验，平板在30℃培养2d，均出现多个透明噬菌斑。挑取多个上层噬菌斑培养基加入少量灭菌海水，旋涡震荡，使固体小块状培养基均匀分散于海水中，即得到噬菌蛭弧菌悬浊液。

实施例2噬菌蛭弧菌噬菌谱试验

该实施例用于说明本发明的噬菌蛭弧菌的噬菌谱及其试验方法。

分别以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、米尔伊丽莎白菌，制备成菌悬液为宿主菌，将实施例1悬浊液稀释后进行裂解实验。采用海水双层琼脂平板法，每个梯度做3个平行，30℃培养2-3天，观察平板上是否有噬菌斑形成。

表1蛭弧菌对各宿主菌的裂解效果

注：“+”表示蛭弧菌对宿主菌有裂解能力，“-”表示蛭弧菌对宿主菌无裂解能力。

实施例3噬菌蛭弧菌菌液制备

该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌菌液及其制备方法。

本实施例所述噬菌蛭弧菌由实施例1提供。

1.灭活宿主菌浓缩液制备：分别接种溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌，于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，10g/L氯化钠，pH7.0-7.5的发酵液中，30℃好氧培养24h后，离心收集菌泥，混合后于60℃，水浴30min，冷却备用。

2.噬菌蛭弧菌菌液制备：取上述步骤1未灭活的混合宿主菌用灭菌海水稀释，使菌体浓度在10⁹CFU/mL接种蛭弧菌，于30℃，好氧培养48h。所得培养液于4000r/min，温度4℃离心15min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤。得到的滤液按5％接种量接入步骤1灭活后的混合宿主菌，于30℃，好氧培养24h，即获得蛭弧菌浓度为5.4*10¹⁰PFU/mL。

实施例4噬菌蛭弧菌冻干粉1的制备

该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其制备方法。

将实施例3所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，菌体浓度约10⁶CFU/mL，好氧培养2h后，加入冻干保护剂1％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝2％:98％)按液固质量比1:1的比例混合，获得待冻干混合液。

将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-50℃条件下，预冻2h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量6％，活菌数2.4*10¹⁰PFU/mL。

实施例5噬菌蛭弧菌冻干粉2的制备

该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其制备方法。

将实施例3所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，菌体浓度约10⁶CFU/mL，好氧培养2h后，加入冻干保护剂2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝6％:94％)按液固质量比1:1的比例混合，获得待冻干混合液。

将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-40℃条件下，预冻3h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量6％，活菌数5.2*10¹⁰PFU/mL。

实施例6噬菌蛭弧菌冻干粉3的制备

该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其制备方法。

将实施例3所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，菌体浓度约10⁶CFU/mL，好氧培养2h后，加入冻干保护剂2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝10％:90％)按液固质量比1:1的比例混合，获得待冻干混合液。

将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-30℃条件下，预冻5h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量5％，活菌数3.6*10¹⁰PFU/mL。

对比例1

该对比例用于说明参比的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其制备方法。

按照实施例5的方法制备噬菌蛭弧菌冻干粉制剂，不同的是，该对比例未采用添加2％甘油，制备获得。

对比例2

该对比例用于说明参比的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其制备方法。

按照实施例5的方法制备噬菌蛭弧菌冻干粉制剂，不同的是，该对比例未采用添加6％蔗糖，而是采用94％脱脂奶粉制备获得。

对比例3

该对比例用于说明参比的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂及其制备方法。

按照实施例5的方法制备噬菌蛭弧菌冻干粉制剂，不同的是，该对比例未采用添加94％脱脂奶粉，而是用6％蔗糖制备获得。

测试例1噬菌蛭弧菌冻干粉制剂养殖水体测试试验

试验方法：在某对虾养殖场中，挑选七个养殖对虾水塘，其中水深、面积、放养量以及管理模式一致的池塘作为试验。其中三个设置为试验组，另外四个设置为对照组。在试验组中使用本发明实施例4-6所得的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂。而四组对照组中分别使用对比例1-对比例3所得的参比噬菌蛭弧菌冻干粉制剂，另一组不使用噬菌蛭弧菌冻干粉制剂(为空白对照)。1米水深的池塘中使用量为2g/亩。试验时间为5天，在试验期间，六个池塘管理模式一致。5天后对这七个池塘水质中的弧菌总数指标进行检测分析，弧菌总数采用TCBS培养基平板稀释涂布检测。投放噬菌蛭弧菌冻干粉制剂前后的结果如下所示：

由以上结果，可以看出噬菌蛭弧菌冻干粉制剂可以在5天时间内对有效降低弧菌总数，其中以实施例4-6效果最为明显。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一种噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）多种混合活宿主菌制备：多种混合活宿主菌为大肠杆菌BL21、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌与铜绿假单胞菌；挑取其中3株或3株以上，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，10g/L氯化钠，pH7.0-7.5的发酵液中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；

（2）噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤（1）所得菌泥直接用灭菌海水稀释，使菌浓在10⁸-10¹⁰CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000 r/min，温度4-8℃离心15-20min，后用无菌的5µm醋酸纤维素膜过滤，备用；

（3）多种混合灭活宿主菌制备：将步骤（1）所得菌泥直接用少量灭菌海水稀释后，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；

（4）噬菌蛭弧菌菌液制备：取上述步骤（3）所得混合灭活宿主菌，用灭菌海水调节菌浓，使菌浓在10⁸-10¹⁰CFU/mL，后按2-5wt%接种量接入步骤（2）所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌菌液，活菌数在3-6*10¹⁰PFU/mL；

（5）噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤（3）所得混合灭活宿主菌按1-50%（v/v）加入步骤（4）所得蛭弧菌菌液，好氧培养1-3h后，按加入1-2%（v/v）甘油，搅拌均匀，再按液固质量比1:0.5-1的比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。

2.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）-步骤（5）中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m³/h；步骤（2）与步骤（5）中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min。

3.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述载体按质量百分比以蔗糖2-10wt%，脱脂奶粉90-98wt%比例添加制备。

4.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述冷冻干燥处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；

最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt%。

5.根据权利要求1-4任意一项所述方法制备的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在对虾养殖水体杀菌的应用。