CN107760638A - 一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法及蛭弧菌培养基 - Google Patents

一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法及蛭弧菌培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法及蛭弧菌培养基，属于发酵领域。这种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法包括：在养殖户需要使用蛭弧菌的0.5～15天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基与水混合，得到蛭弧菌培养液；再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液；以及将蛭弧菌发酵液于18～36℃、与空气接触下静置培养12～72h。该制备方法，扩大了蛭弧菌的培养环境，使得蛭弧菌的培养简单、易实施，可以满足蛭弧菌的现用现培养，从而避免现有的蛭弧菌水剂产品在储存或运输过程中的高衰亡率，同时又能降低蛭弧菌纯冻干粉的使用成本。

Description

一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法及蛭弧 菌培养基
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体而言，涉及一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法及蛭弧菌培养基，培养基可以为液态，也可制成粉剂。
背景技术
蛭弧菌(Bdellovibrio)是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌。它比通常的细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌种的作用。其菌种大小为0.2～0.5μm×0.8～1.2μm，是养殖水体环境致病菌滋生的天然生物控制因子，能够有效的控制养殖水体的化学耗氧量以及硫化物和氨氮的含量，对开拓水产动物病害生物防治新途径具有极其重要的意义。
目前，我国市售的蛭弧菌产品由水剂和粉剂两种，水剂的发酵工艺简单，但其含量低(一般在105～109PFU/mL)、保存时间短(一个月后含量衰减高达95％)；而冻干粉制剂，保存时间长，运输方便，但具有制备成本高昂的缺点，目前纯蛭弧菌冻干粉剂价格在500元/公斤以上。现有的蛭弧菌的发酵工艺繁琐，通常需要经过十几道工序才能得到，这也是蛭弧菌产品价格高昂的一大原因。目前，水产养殖常用的菌种，比如乳酸菌、EM菌、光合细菌和芽孢杆菌，均有其简单培养方法，唯独蛭弧菌没有，这也极大的限制了蛭弧菌的应用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法，该制备方法，扩大了蛭弧菌的培养环境，使得蛭弧菌的培养简单、易实施，可以满足蛭弧菌的现用现培养，从而避免现有的蛭弧菌水剂产品在储存或运输过程中的高衰亡率，同时又能降低蛭弧菌纯冻干粉的使用成本。
本发明的第二目的在于提供一种蛭弧菌培养基，这种蛭弧菌培养基可以让水产养殖户采用上述方法制备新鲜的蛭弧菌。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法，其包括：
在养殖户需要使用蛭弧菌的0.5～15天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基与水混合，得到蛭弧菌培养液，蛭弧菌培养液中宿主菌的浓度为105～109CFU/mL；
再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，蛭弧菌发酵液中蛭弧菌的浓度为103～105PFU/mL；以及
将蛭弧菌发酵液于18～36℃、与空气接触下静置培养12～72h。
一种蛭弧菌培养液，该蛭弧菌培养液的制备方法包括：将培养好的宿主菌离心后，用生理盐水重悬菌泥使宿主菌的浓度为109～1014PFU/mL，于100～140℃下放置15～40min灭活。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本发明提供的这种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法，通过将蛭弧菌培养基与蛭弧菌菌种与水混合静置培养，采用一般的敞口容器与空气接触就能实现蛭弧菌的简单培养，而无需额外通氧气，也无需使用发酵罐搅拌和培养瓶摇瓶等专用设备，简化了传统方法中蛭弧菌的培养工序以及培养设备。该培养方法简单、易实施，能够让水产养殖户随时随地实现对蛭弧菌的培养，得到新鲜的蛭弧菌菌液以满足水产养殖需求，从而避免了现有的蛭弧菌水剂产品在储存或运输过程中的高衰亡率的问题，同时又能够降低蛭弧菌纯冻干粉的使用成本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本实施方式提供一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法，其包括：
步骤S1:在养殖户需要使用蛭弧菌的0.5～15天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基与水混合，得到蛭弧菌培养液，蛭弧菌培养液中宿主菌的浓度为105～109CFU/mL；
在本实施方式中，宿主菌为无致病性、且能被蛭弧菌吞噬的革兰氏阴性菌。进一步的，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、沼泽红假单胞菌、迟缓爱德华菌、哈维氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌等。
蛭弧菌培养基为包含有宿主菌的培养液或者干粉剂，为了更为便捷的使水产养殖户在使用时培养新鲜的蛭弧菌，本实施方式中采用的蛭弧菌培养基中宿主菌的浓度为109～1014CFU/mL，这种蛭弧菌培养基中宿主菌的浓度大，在水产养殖户使用时，可直接用大量的水稀释，即可得到宿主菌浓度为105～109CFU/mL的蛭弧菌培养液。较为优选的，可直接用养殖池塘中的水对蛭弧菌培养基进行稀释，通过这种方法得到的蛭弧菌培养液，在与蛭弧菌菌种混合后，可快速激活休眠期的蛭弧菌，使其更能适应当地的水温等水质环境，培养效果佳。
进一步的，为了提高蛭弧菌培养基的安全性，蛭弧菌培养基中的宿主菌处于灭活状态，灭活蛭弧菌培养基的温度为100～140℃，或者为110～130℃，或者为115～125℃，或者为117～123℃，或者为120℃；灭活时间为15～40min；或者为16～35min，或者为17～25min，或者为18～23min，或者为20min。
进一步的，蛭弧菌培养基的制备方法包括：将培养好的宿主菌离心后，用生理盐水重悬菌泥使宿主菌的浓度为109～1014PFU/mL，灭活后封装，可直接封装成水剂，也可以经喷雾干燥、烘干、冻干等干燥工艺处理后做出粉剂，该粉剂可单独包装，也可与蛭弧菌菌种的冻干粉混合一起包装。更为具体地，用生理盐水重悬菌泥使宿主菌的浓度为109～1014PFU/mL后，分装到5mL、8mL、10mL等规格的西林瓶中，将西林瓶中的宿主菌在高温高压下灭活后，将装有灭活宿主菌的西林瓶压盖封存。
步骤S2:再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，蛭弧菌发酵液中蛭弧菌的浓度为103～105PFU/mL。
将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，能够迅速激活处于休眠期的蛭弧菌菌种，使其进行大量增殖，得到有活性的蛭弧菌。
进一步的，蛭弧菌菌种包括蛭弧菌菌液或蛭弧菌冻干粉。
其中，蛭弧菌菌液的制备方法包括：将宿主菌与蛭弧菌混合培养，得到蛭弧菌浓度为108～1010PFU/mL的蛭弧菌菌液。
蛭弧菌冻干粉的制备方法包括：将宿主菌与蛭弧菌混合培养，得到蛭弧菌浓度为108～1010PFU/mL的蛭弧菌菌液；再将蛭弧菌菌液与冻干保护剂混合，冻干。
进一步的，冻干保护剂包括脱脂乳粉、蔗糖和甘油。
步骤S3:将蛭弧菌发酵液于18～36℃、与空气接触下静置培养12～72h。
蛭弧菌发酵液在发酵时，直接将容器敞口放置即可，即这种发酵液在发酵时无需额外通入氧气，也无需发酵罐搅拌或者培养瓶、摇床等专业设备。通常条件下仅需直接在室温下敞口放置0.5～15天，即可完成发酵过程得到新鲜的蛭弧菌。
进一步的，蛭弧菌发酵液的发酵温度为18～36℃，或者为20～34℃，或者为22～30℃，或者为24～27℃，或者为25～26℃；静置培养的时间为12～72h，或者为18～48h，或者为24～36h，或者为27～33h。培养结束后，可在2～8℃下保藏0.5～90天。
这种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，通过将一定比例的宿主菌和蛭弧菌混合，在室温下敞口放置即可实现蛭弧菌的培养。宿主菌可以通过富集好以后灭活密封保存(即蛭弧菌培养基，可以为水剂或者干粉剂)、蛭弧菌可以通过真空冷冻干燥后密封保存，当然也可以将蛭弧菌培养基的冻干粉与蛭弧菌菌种粉剂混合做成产品。因此宿主菌和蛭弧菌不必现用现生产。这两种必须成分可以在养殖户需要用到新鲜的蛭弧菌时，随时混合培养，这就极大的简化了蛭弧菌的培养工艺，使蛭弧菌的培养简单化、平民化。采用这一养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，可避免传统蛭弧菌水剂产品在储存或运输过程中的高衰亡率，又降低了蛭弧菌纯冻干粉的使用成本。
本实施方式还提供一种蛭弧菌培养基，蛭弧菌培养基的制备方法包括：将培养好的宿主菌离心后，用生理盐水重悬菌泥使宿主菌的浓度为109～1014CFU/mL，于100～140℃下放置15～40min灭活后封装。
这种蛭弧菌培养基中宿主菌的浓度大、且经灭活后安全性高，在采用上述方法制备新鲜的蛭弧菌时，仅需将这种蛭弧菌培养基与水混合，以稀释宿主菌至适宜蛭弧菌培养的浓度，以得到蛭弧菌培养液，便于蛭弧菌的快速培养。这种蛭弧菌培养基，既可以是水剂，也可以是干粉剂，其可批量化生产，养殖户在需要使用时，无需再培养宿主菌，便于上述养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法的推广使用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种蛭弧菌培养基N1，其包括：
a.培养大肠杆菌作为宿主菌：将大肠杆菌接种于普通营养肉汤中，摇床振荡培养。
b.培养结束后，将宿主菌离心分离后，用生理盐水重悬菌泥，使宿主菌的浓度为109CFU/mL，将其分装到不同规格的西林瓶中。
c.将上述装有宿主菌的西林瓶在140℃下，灭活15min后，压盖封存，即得蛭弧菌培养基N1，其为水剂。
实施例2
本实施例提供一种蛭弧菌培养基N2，其包括：
a.培养沼泽红假单胞菌作为宿主菌：将沼泽红假单胞菌接种于培养基中，摇床振荡培养。
b.培养结束后，将宿主菌离心分离后，用生理盐水重悬菌泥，使宿主菌的浓度为1012CFU/mL，将其分装到不同规格的西林瓶中。
c.将上述装有宿主菌的西林瓶在140℃下，灭活15min后，采用冷冻干燥法冻干成粉状，压盖封存，即得蛭弧菌培养基N2，即干粉剂。
实施例3
本实施例提供一种蛭弧菌培养基N3，其包括：
a.培养大肠杆菌作为宿主菌：将大肠杆菌接种于普通营养肉汤中，摇床振荡培养。
b.培养结束后，将宿主菌离心分离后，用生理盐水重悬菌泥，使宿主菌的浓度为1014CFU/mL，将其分装到不同规格的西林瓶中。
c.将上述装有宿主菌的西林瓶在120℃下，灭活20min后，压盖封存，即得蛭弧菌培养基N3。
实施例4
本实施例提供一种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，其包括：
a.在养殖户需要使用蛭弧菌的4天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基N1与水混合，得到蛭弧菌培养液，蛭弧菌培养液中宿主菌的浓度为105CFU/mL；
b.再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，蛭弧菌发酵液中蛭弧菌的浓度为103PFU/mL；
c.将蛭弧菌发酵液于36℃、与空气接触下静置培养12h，即得浓度为107PFU/mL。
实施例5
本实施例提供一种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，其包括：
a.在养殖户需要使用蛭弧菌的15天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基N2与水混合，得到蛭弧菌培养液，蛭弧菌培养液中宿主菌的浓度为107CFU/mL；
b.再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，蛭弧菌发酵液中蛭弧菌的浓度为104PFU/mL；
c.将蛭弧菌发酵液于18℃、与空气接触下静置培养48h，即得浓度为108PFU/mL。
实施例6
本实施例提供一种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，其包括：
a.在养殖户需要使用蛭弧菌的2天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基N3与水混合，得到蛭弧菌培养液，蛭弧菌培养液中宿主菌的浓度为108CFU/mL；
b.再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，蛭弧菌发酵液中蛭弧菌的浓度为105PFU/mL；
c.将蛭弧菌发酵液于25℃、与空气接触下静置培养24h，即得浓度为109PFU/mL。
实施例7
本实施例提供一种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，其包括：
a.在养殖户需要使用蛭弧菌的1.5天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基N3与水混合，得到蛭弧菌培养液，蛭弧菌培养液中宿主菌的浓度为109CFU/mL；
b.再将蛭弧菌培养液与蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，蛭弧菌发酵液中蛭弧菌的浓度为104PFU/mL；
c.将蛭弧菌发酵液于20℃、与空气接触下静置培养36h，即得浓度为109PFU/mL。
综上所述，本发明提供的这种养殖户制备新鲜蛭弧菌的方法，通过将蛭弧菌培养基与蛭弧菌菌种与水混合静置培养，采用一般的敞口容器与空气接触就能实现蛭弧菌的简单培养，而无需额外通氧气，也无需使用发酵罐搅拌和培养瓶摇瓶等专用设备，简化了传统方法中蛭弧菌的培养工序以及培养设备。该培养方法简单、易实施，能够让水产养殖户随时随地实现对蛭弧菌的培养，得到新鲜的蛭弧菌菌液以满足水产养殖需求，从而避免了现有的蛭弧菌水剂产品在储存或运输过程中的高衰亡率的问题，同时又能够降低蛭弧菌纯冻干粉的使用成本。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种直接在蛭弧菌的使用场地制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，其包括：
在养殖户需要使用蛭弧菌的0.5～15天前，将含有宿主菌的蛭弧菌培养基与水混合，得到蛭弧菌培养液，所述蛭弧菌培养液中所述宿主菌的浓度为105～109CFU/mL；
再将所述蛭弧菌培养液与所述蛭弧菌菌种混合，得到蛭弧菌发酵液，所述蛭弧菌发酵液中所述蛭弧菌的浓度为103～105PFU/mL；以及
将所述蛭弧菌发酵液于18～36℃、与空气接触下静置培养12～72h。
2.根据权利要求1所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述蛭弧菌培养基中所述宿主菌的浓度为109～1014CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述蛭弧菌培养基中的所述宿主菌处于灭活状态，灭活所述蛭弧菌培养基的温度为100～140℃，灭活时间为15～40min。
4.根据权利要求1所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述蛭弧菌培养基的制备方法包括：将培养好的宿主菌离心后，用生理盐水重悬菌泥使所述宿主菌的浓度为109～1014CFU/mL或CFU/g，灭活后做成水剂或制成干粉剂分装。
5.根据权利要求1所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述蛭弧菌菌种包括蛭弧菌菌液或蛭弧菌冻干粉。
6.根据权利要求5所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述蛭弧菌菌液的制备方法包括：将宿主菌与蛭弧菌混合培养，得到蛭弧菌浓度为108～1010PFU/mL的蛭弧菌菌液。
7.根据权利要求5所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述蛭弧菌冻干粉的制备方法包括：将宿主菌与蛭弧菌混合培养，得到蛭弧菌浓度为108～1010PFU/mL的蛭弧菌菌液；再将所述蛭弧菌菌液与冻干保护剂混合，冻干。
8.根据权利要求7所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、蔗糖和甘油。
9.根据权利要求1～8任一项所述的制备新鲜蛭弧菌的方法，其特征在于，所述宿主菌为无致病性、且能被蛭弧菌吞噬的革兰氏阴性菌。
10.一种蛭弧菌培养基，其特征在于，所述蛭弧菌培养基的制备方法包括：将培养好的宿主菌离心后，用生理盐水重悬菌泥使所述宿主菌的浓度为109～1014PFU/mL，于100～140℃下放置15～40min灭活。
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