CN110129283A - 一种短尾大肠杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

一种短尾大肠杆菌噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌噬菌体及其应用，特别涉及一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体。上述大肠杆菌噬菌体命名为PD38，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为CGMCC No.16391。该噬菌体对大肠杆菌具有较好的裂解作用，对食品、养殖环境中的大肠杆菌具有良好的消杀作用，同时可以防治鸡大肠杆菌引起的疾病。

Description

一种短尾大肠杆菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种短尾大肠杆菌强裂解性噬菌体及其在食品杀菌、空间环境以及禽畜大肠杆菌腹泻疾病中的应用。
背景技术
大肠杆菌属于条件致病菌，致病力的强弱与大肠杆菌的血清型有关，不同动物之间也存在着差异性。鸡一旦感染大肠杆菌会引起死亡率急剧上升，引起腹泻，明显影响鸡的增重，而且还会影响蛋鸡产蛋率。鸡大肠杆菌病的主要传染源是病鸡和携带大肠杆菌的健康鸡，鸡群自身也可以通过粪便，分泌的粘液等传染给其它的健康鸡造成大面积感染，其中养殖环境中的大肠杆菌残留会造成鸡群持续发病，近几年该病一直困扰着养殖户，给养殖业带来很大的影响。
在我国，由于抗生素的普及和滥用，导致我国细菌的耐药性产生的非常普遍，大肠杆菌普遍出现交叉多重的耐药性，使得大肠杆菌病越来越难以防治。大剂量、大面积和高频率的使用抗生素，使得养殖成本不断增加，细菌的耐药性越来越严重，给养殖业的蓬勃发展造成了巨大的阻力。
烈性噬菌体，是一种可以杀死细菌的病毒。为应对细菌的耐药性，噬菌体作为细菌的天敌重新回到人们的视野。噬菌体繁殖速度比宿主菌快，在裂解周期内呈指数倍数增长繁殖，并且可随宿主菌增殖而不断的增殖。研究表明噬菌体能特异性的结合到宿主细菌表面的受体上，从而使宿主菌的耐药性突变减弱，并使其突变频率降低，从而减轻由于抗生素滥用所造成的机体菌群失调，降低耐药性的产生概率。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种短尾大肠杆菌强裂解性噬菌体。
本发明的另一目的是：针对目前养殖业中大肠杆菌导致的腹泻疾病、以及空间环境消毒和畜禽食品消毒提供一种有效防治的产品，本发明提供一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体，开发一种对大肠杆菌具有强裂解性的噬菌体制剂，该制剂可以单独或鸡尾酒使用。为大肠杆菌感染的治疗、空间环境和畜禽产品消毒提供一种安全、无毒副及无残留作用的噬菌体产品，为工业化生产噬菌体制剂提供噬菌体来源。
本发明的又一目的是：提供一种无污染、无残留的环保有效的防治手段，将所述的噬菌体PD38制备成液体、冻干粉，单独或配合其他噬菌体，经口服、喷雾等方式，用于杀灭动物体内外、养殖空间环境中的大肠杆菌。
本发明的目的是这样实现的：一种短尾大肠杆菌强裂解性噬菌体，其特征在于：保藏号为：CGMCC No.16391，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年9月26日，该噬菌体命名为PD38。该噬菌体具有呈多面体的头部结构，头部直径约75nm，具有6个短尾丝；噬菌体在双层琼脂培养基平板上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约1～2mm；该噬菌体应属于短尾噬菌体科。
在本发明中：所述的噬菌体在40～50℃中放置60min，其活性稳定，在60℃中放置20min，效价降低约2个数量级，在70～80℃中放置20min则失活；在pH 为5～11时，活性稳定；在紫外线照射110min，几乎全部失活。
在所述的噬菌体的应用中，其特征在于：在感染大肠杆菌雏鸡中应用此噬菌体，2周内可以减少70％的死亡率。
在所述噬菌体的应用中，还可以用于养殖环境中粪便喷雾消毒抑制大肠杆菌增殖以及畜禽食品表面消毒。
在所述的噬菌体的应用中，其特征在于：将纯化后的噬菌体制备成液体、冻干粉形式，单独或与其他噬菌体、抗生素复配后通过口服或喷雾等途径用于大肠杆菌感染的控制。
本发明一个方面提供了一种大肠杆菌噬菌体，其特征在于，其保藏号为： CGMCCNo.16391。
本发明另一个方面提供了所述大肠杆菌噬菌体在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的用途。
本发明另一个方面提供了所述大肠杆菌噬菌体在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的饲料添加剂中的用途。
本发明另一个方面提供了所述大肠杆菌噬菌体在屠宰加工和保鲜过程中食品添加剂的用途。
本发明另一个方面提供了所述大肠杆菌噬菌体在制备杀灭食品、药物、饲料或环境中大肠杆菌消毒剂或作为处理包含大肠杆菌的动物粪便、尸体、水源、毛皮的无害化生物试剂中的用途。
本发明另一个方面提供了一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物，其有效成分包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分。
在本发明的技术方案中，所述的药物为口服药物、喷雾制剂药物。
本发明另一个方面提供了一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的饲料添加剂，其有效成分包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为抗大肠杆菌的唯一有效成分。
本发明另一个方面提供了一种防控大肠杆菌引起的屠宰加工和保鲜过程中的食品添加剂，其有效成分包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体。
本发明另一个方面提供了一种杀灭大肠杆菌的消毒剂，其有效成分包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分。
在本发明的技术方案中，所述的大肠杆菌引起的疾病选自鸡大肠杆菌性腹膜炎、输卵管炎、气囊炎、心包炎、眼炎、大肠杆菌性腹泻。
在本发明的技术方案中，所述的环境中大肠杆菌为动物饲养、食品、药品、医疗器械厂、医院以及其他人类活动场所中的大肠杆菌。
在本发明的技术方案中，所述的环境包括饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
本发明的优点在于：分离到的大肠杆菌噬菌体具有强裂解活性，是一种环保的防治大肠杆菌疾病的产品和手段。经雏鸡安全性试验证明，该噬菌体无毒副作用，安全性高，在发病试验中服用本噬菌体组明显降低了雏鸡死亡率，且在粪便消毒和食品表面消毒中取得明显效果。
附图说明
图1PD38噬菌斑图片。
图2为PD38噬菌体的电镜图片。
图3为PD38噬菌体的热稳定性。
图4为PD38噬菌体的pH值稳定性。
图5为PD38噬菌体的一步生长曲线。
图6为粪便消毒效果图。
图7为噬菌体PD38在鸡肉表面的杀菌效果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施来进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明，而不是用来限制本发明的范围。下述实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1噬菌体PD38的分离制备及纯化
本发明中的粪液污水样品采自山东菏泽某鸡场；
宿主菌为具有致病性的鸡源大肠杆菌。
挑取宿主菌菌液，在SS琼脂培养基上三区划线，37℃的恒温箱中培养 16～24h，得到单菌落。挑取单菌落，接种于5mL的LB肉汤试管中，37℃，170rpm 振荡培养过夜，得到宿主菌液。取山东菏泽某鸡场的粪液污水50mL，加入500μL 宿主菌悬液，再加入LB肉汤至200mL，37℃浸泡孵育过夜。次日，取出5mL 的液体，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm的无菌微孔滤膜过滤，得到噬菌体原液，置于4℃保存。
利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液10倍稀释，稀释液各取100μL 与200μL宿主菌液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约50℃保温的上层琼脂 (琼脂浓度为0.8％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置培养6～8h后，获得形成噬菌斑的双层平板，噬菌体PD38在双层琼脂培养基平板上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约2-3mm(见图1)。
在形成噬菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1mL的LB 肉汤中，置于40℃水浴锅中孵育30min，得到噬菌体浸出液。取噬菌体浸出液 100μL与200μL宿主菌液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约50℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.8％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为2.0％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置培养6～8h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。如此循环3次，得到纯化后的噬菌体悬液。噬菌体PD38保藏号为：CGMCC No.16391，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日。
实施例2噬菌体的生物学特性
1、噬菌体PD38的形态学特性
噬菌体PD38在透射电镜下观察(见图2)。该噬菌体具有呈多面体的头部结构，头部直径约75nm，具有6个短尾丝。根据噬菌体分类，本研究噬菌体形态符合短尾噬菌体科的特征，属于短尾噬菌体。
2、温度对噬菌体PD38的影响
各取100μL噬菌体PD38增殖液(效价为2.00×1010PFU/mL)分装于无菌 EP管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和 60min。每一温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，通过10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体PD38热稳定性曲线。
热稳定性结果发现(图3)，噬菌体PD38在40℃～50℃作用60min后依然保持较高活性，在60℃作用40min后效价下降2个滴度，在70℃～80℃作用60min 时完全失活。说明本发明噬菌体的热稳定性较好。
3、pH对噬菌体PD38的影响
于无菌试管加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13) 的LB肉汤4.5mL，然后将上述试管置于37℃的水浴锅中，待温度平衡后各加入 500μL噬菌体增殖液混匀后，37℃水浴作用1h、2h和3h。每管样品采用双层平板法测定噬菌体效价，并且每个pH值设定2个重复。以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体pH值稳定性曲线。
如图4所示，噬菌体PD38在pH 6～11范围内3h后保持原有效价；在pH 2～3 范围内失活；pH＝4和pH＝12作用3h效价降低3个滴度；pH 13～14范围内失活，在pH 6～9噬菌体更稳定。
4、噬菌体PD38的一步生长曲线
将感染复数为10的噬菌体PD38增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸取上清，再用5mL LB肉汤洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的 LB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μL，10000rpm离心1min，吸取100μL 的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体PD38的潜伏期、爆发期。
通过图5噬菌体PD38一步生长曲线发现，噬菌体感染宿主菌后，在15min 内效价缓慢上升，效价稳定在108PFU/mL，表明噬菌体PD38潜伏期较短，噬菌体侵染宿主菌后的15～50min内，噬菌体数量急剧增加，在60min时效价增长开始趋于平稳，此时效价可达1010PFU/mL，可见噬菌体PD38的爆发期约为30min，爆发量为50。
5、噬菌体PD38的体外裂解效率
用无菌接种环挑取于-20℃保存的宿主菌的菌液，在SS琼脂培养基上三区划线，37℃的恒温箱中培养16～24h，得到单菌落。用灭菌的白色枪头挑取复苏培养的单菌落，接种盛有5mL的LB肉汤的试管中，37℃，170rpm震荡培养16h，得到单一的宿主菌悬液。调整宿主菌浓度为1×105CFU/mL，取1mL，分别用 109，108，107，106，105PFU/mL的噬菌体PD38 1mL与之混合，室温放置30min，同时设与1mL的SM液混合的对照处理。轻微混匀后，将液体稀释10-1，10-2， 10-3，10-4，每个梯度取100μL至普通平板，用无菌涂布棒涂布均匀，倒置培养 16～24h，每个做3个平行。进行平板菌落数计数。
噬菌体裂解效率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％
通过噬菌体PD38体外裂解效率测定发现，噬菌体浓度≥108PFU/mL，对宿主菌完全裂解，噬菌体浓度≤107PFU/mL时裂解率逐渐下降。
实施例3噬菌体的安全性试验
选择20只1日龄SPF雏鸡，随机分成试验组和空白对照组2组，试验组灌服噬菌体PD38增殖液2×1010PFU/mL/0.25mL/只，试验组灌服等体积无菌生理盐水，连续服7d，观察小鸡的行为表现及其生长情况，7d后每组剖检5只小鸡，观察内脏和消化道及黏膜变化情况。
结果发现试验组和对照组小鸡生长情况一致，精神状态良好、采食饮水正常，无不良反应，两组剖检的鸡内脏、消化道黏膜等未见异常，从而确定噬菌体PD38 安全无毒副作用。
实施例4噬菌体PD38的雏鸡治疗试验
选择150只健康的1日龄的雏鸡，分为3组，对照组、感染组、治疗组，每组50只。按以下方式建立感染，挑取大肠杆菌单克隆于5mL LB培养基中，培养24h，调整其浓度为1×108CFU/mL。对照组不攻菌，感染组每只小鸡腹腔注射200μL，治疗组在腹腔注射细菌同时口服0.5mL噬菌体PD38 (4.45×108PFU/mL)，感染组口服等体积PBS，连续灌服5天，后期正常饲养 14天，观察各组小鸡死亡情况，计算死亡率。
结果显示，对照组雏鸡全部成活，感染组雏鸡死亡率80％，治疗组雏鸡死亡率10％，可知感染大肠杆菌的雏鸡服用噬菌体PD38可以减少70％的死亡率。
实施例5噬菌体PD38粪便喷雾消毒试验
不同养殖场取鸡粪3份，每份鸡粪设置PD38组、新洁尔灭组、对照组。每份鸡粪搅拌均匀后各取200g进行分组。将鸡粪均匀涂抹在灭菌瓷盘中，常温放置，每组鸡粪用相应的液体喷洒，每天早9：00，晚17:00进行喷洒，每次每组喷洒量为20mL.，连续喷洒2天。喷洒结束后，取各组鸡粪25g放入225mL生理盐水中，加入玻璃珠，震荡10min，充分混匀，然后吸取1ml，放入含9ml生理盐水的试管中，10倍倍比稀释，倾注法，VRBA培养基进行大肠杆菌总数计数。
结果显示(图6)：PD38和新洁尔灭组大肠杆菌总数比对照组降低一个滴度，且PD38喷雾后的粪便大肠杆菌数量明显降低。
表1粪便消毒喷雾试验结果(CFU/g)
粪样编号 对照组 新洁尔灭组 PD38组
1 2.0×10<sup>7</sup> 7.5×10<sup>6</sup> 2.8×10<sup>6</sup>
2 2.9×10<sup>7</sup> 7.3×10<sup>6</sup> 1.5×10<sup>6</sup>
3 1.5×10<sup>8</sup> 5.6×10<sup>6</sup> 1.6×10<sup>6</sup>
实施例6PD38对食品的消毒试验
从山东某屠宰场，选取鸡胸肉作为试验样品，将鸡胸肉切成表面平整的 2×2cm2肉块。分别设立PBS组和PD38组。制备1×105CFU/ml的宿主菌液体， 1×109PFU/ml PD38噬菌体。用70％酒精将肉块消毒后放入无菌培养皿中，超净台紫外灯下照射30min灭菌。用移液枪吸取50μL宿主菌液随机滴加肉块朝上的表面，将肉样置于超净台中风干20min。取100μLPFU/ml PD38噬菌体均匀滴加样品表面，覆盖住滴加的宿主菌。对照组加等量灭菌PBS。分别于0h、1h、3h、5h取样检测细菌含量。
结果显示(图7)，PD38噬菌体作用1h肉块菌含量开始下降，作用5h肉块菌含量降低约2个数量级，对照组菌含量持续增多。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种大肠杆菌噬菌体，其特征在于，其保藏号为：CGMCC No.16391。
2.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的应用。
3.权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的饲料添加剂中的用途；
优选地，大肠杆菌引起的疾病选自鸡大肠杆菌性腹膜炎、输卵管炎、气囊炎、心包炎、眼炎、大肠杆菌性腹泻。
4.权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在屠宰加工和保鲜过程中食品添加剂的用途。
5.权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在制备杀灭食品、药物、饲料或环境中大肠杆菌消毒剂或作为处理包含大肠杆菌的动物粪便、尸体、水源、毛皮的无害化生物试剂中的用途；
优选地，所述的环境包括饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
6.一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物，其有效成分包括权利要求1所述所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分；优选地，所述的药物为口服药物、喷雾制剂药物。
7.一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的饲料，其有效成分包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为抗大肠杆菌的唯一有效成分。
8.一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体。
9.一种杀灭大肠杆菌的消毒剂，其有效成分包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分。
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