CN105002144A - 一株能够通过口服入血的噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了一株能够通过口服入血的噬菌体及其应用，该噬菌体单体为大肠杆菌噬菌体，拉丁名E.coli？phage，被命名为Bp4，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏日期为2014年6月10日，保藏编号为CGMCC？No.9248；该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于鸡大肠杆菌病的防治及环境消毒提供了噬菌体来源，从而控制养鸡场严重的大肠杆菌病毒；该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增；该噬菌体可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒；该噬菌体可作为生物类抗生素替代品应用于鸡场疾病控制。

Description

一株能够通过口服入血的噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株能够通过口服入血的噬菌体及其应用。

背景技术

噬菌体是一类感染细菌的病毒，可从污水或粪便等自然环境样本中分离得到。噬菌体具有严格的宿主特异性，大肠杆菌噬菌体只侵袭大肠杆菌，对人和动物细胞、植物细胞没有感染作用，所以噬菌体对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。噬菌体与相应的宿主菌接触后，就会触发噬菌体的吸附及胞内增殖过程，并通过宿主菌的裂解释放更多的噬菌体。噬菌体可通过这种途径在环境中通过杀灭特异的宿主菌得到自身的大量扩增，具有指数增殖特征，能作为一种具有杀菌作用的生物消毒剂和抗生素替代品。

许多肉鸡养殖场采用地面散养模式，肉仔鸡饲养到20日龄左右往往就会发生大肠杆菌病，抗生素治疗只能暂时控制其症状，并不能完全治愈，因此大肠杆菌病在肉仔鸡的饲养周期中持续不断地发生，给养殖业带来很大的经济损失。抗生素治疗往往面临细菌耐药性的问题，许多大肠杆菌的临床分离株表现为对多种抗菌药物同时耐药；肉鸡发生大肠杆菌病，会通过粪便排出致病性大肠杆菌，污染垫料，加上肉鸡地面散养过程中地面消毒的限制性，使大肠杆菌在环境中大量存在，增加了肉鸡感染大肠杆菌病的机会。

噬菌体消毒试验有过报道，但是口服后能入血且持续存在14h的噬菌体，且该噬菌体还能对鸡粪中的细菌总数及大肠杆菌数有明显消毒作用的噬菌体未见报道。

发明内容

本发明提供了一株能够通过口服入血的噬菌体及其应用，旨在解决抗生素治疗肉鸡大肠杆菌病面临的耐药性难题。肉鸡大肠杆菌病的抗生素治疗面临严重的细菌耐药性问题，地面散养的肉鸡场，其垫料的消毒常常无法进行。国内的研究者都做过很多类似的噬菌体消毒试验，但具有环境消毒作用且能通过口服入血的噬菌体未见报道。

本发明的目的在于提供一株具有口服入血能力的噬菌体，该噬菌体单体为大肠杆菌噬菌体，拉丁名E.coli phage，被命名为Bp4，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏日期为2014年6月10日，保藏编号为CGMCC No. 9248。

该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于环境消毒和噬菌体治疗提供了噬菌体来源。

该噬菌体可用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于鸡场环境消毒及大肠杆菌病的噬菌体治疗。

该噬菌体Bp4作为消毒剂喷洒消毒于鸡粪时，它对鸡粪中的细菌总数及大肠杆菌数有明显的消毒效果，该噬菌体作为消毒剂用于鸡粪消毒且有明显的消毒效果。

该噬菌体可通过口服途径给肉鸡使用，能在14h内在血液中存在，为治疗鸡大肠杆菌病提供潜在的抗生素替代品。

噬菌体Bp4经双层平板法以24株鸡致病性大肠杆菌为对象，测定出噬菌体Bp4可以裂解24株致病性大肠杆菌中的8株，宽噬率为33%，这一结果说明该噬菌体是多价烈性噬菌体且具有较强的广谱性，在临床治疗上具有良好的应用前景。

本发明提供了一株能通过口服入血的噬菌体及其应用，该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于鸡粪消毒及噬菌体治疗提供了噬菌体来源；该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增；该噬菌体还可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理动物养殖场污染；该噬菌体还可作为一种抗生素替代品用于肉鸡大肠杆菌病的防治。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

A、噬菌体的筛选和纯化

（一）         样品的采集

本发明中的鸡粪样品采自山东省潍坊市高密某商品鸡场。

（二）         样品中针对大肠杆菌噬菌体的特异性扩增

取2g样品加入预先已扩增好的大肠杆菌（宿主菌加入比例为1∶10），将其置于恒温摇床37℃，200r/min培养6-8h。

（三）         双层平板试验检测特异性噬菌体的存在

高压灭菌琼脂含量为2%的营养琼脂固体培养基，室温放置至约40-60℃后取10-15mL倾倒至培养皿内，均匀铺于皿底，室温放置30min使其凝固，将此营养琼脂平板作为底层琼脂平板。取上述经大肠杆菌扩增后的噬菌体扩增样本1mL，4000rpm离心5min后，取上清液经0.22μm滤膜过滤除菌。滤液装于无菌管中。取10μL大肠杆菌悬液与50μL上述滤液，混匀后，40℃水浴作用15min，再将混合液加入已高压灭菌并冷却至55°C的5mL琼脂含量为0.7%的营养琼脂培养基中，手搓试管混匀后，迅速倒入己准备好的底层琼脂平板上，旋转平皿使其分布均匀成上层琼脂。待琼脂凝固后，37℃倒置培养6-8h后，观察有无噬斑。如果有则进行步骤（四）。以上操作均为无菌条件。

（四）         噬菌体样品的纯化与扩增

无菌挑取在步骤（三）的大肠杆菌双层平板中出现的单个噬斑，置于盛有800μL生理盐水的无菌EP管中，40℃水浴作用30min，4000r/min离心10min，得到噬菌体浸出液。各取100μL大肠杆菌菌液与噬菌体浸出液加入5mL无菌的营养肉汤液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min培养3-4h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。将噬菌体增殖液经双层平板法进行进一步噬斑纯化，重复3-5次，得到噬菌体单克隆单体，并将该噬菌体命名为Bp4。

（五）         噬菌体保存液的制备

将噬菌体增殖液与已高压灭菌的含60%甘油的营养肉汤液体培养基以1∶1的比例混合，即得到噬菌体保存液。噬菌体保存液4℃保存。

B、噬菌体形态的观察：

将噬菌体增殖液5mL经5000rpm高速离心10min后，将上清液装入透析袋内进行PEG浓缩至0.5-1mL左右，最后加入2倍体积2.5%的戊二醛固定，此样品进行透射电镜观察。

结果可见噬菌体Bp4有一个多面体立体对称的头部，直径约60nm，有一个长约30nm的尾部。

C、噬菌体稳定性的检测

（一）噬菌体计数方法（效价）

将所得的噬菌体样品用无菌生理盐水按10倍比例稀释，取其中一定比例的样品稀释液10μL与大肠杆菌菌液20μL混合均匀后，用A步骤（三）中的方法制备双层平板，每个稀释度分别做3个平行样。计数时，观察平板中的噬菌斑，取噬菌斑数在30-300个之间的平板来计数测效价。记录此稀释度的3个平行样的噬菌斑数目，然后求得平均数，计算原液的噬菌体数（效价）。

噬菌体效价（pfu/mL）=平均噬菌斑数×稀释倍数×100

（二）噬菌体热稳定性的检测

将4×10⁹pfu/mL噬菌体Bp4增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，每一温度两个平行样，各保温20min、40min和60min后，测定噬菌体效价。

结果可见噬菌体Bp4在40℃和50℃保温60min后基本上保持原活性，60℃保温 60min后，效价仍保持在1×10⁶pfu/mL以上，而在70℃保温20min，噬菌体数量即降到1×10⁴pfu/mL以下，80℃作用20min后噬菌体完全失活。由此可见噬菌体Bp4的热稳定性较高。

（三）噬菌体的pH稳定性的检测

取无菌EP管分别加入不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0及13.0）的营养肉汤50μL，然后将上述EP管置于37℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入50μL的效价为4×10⁹pfu/mL噬菌体Bp4增殖液，恒温保存2h。每管取10μL作适当稀释后，测定噬菌体效价。

结果可见噬菌体Bp4在pH5.0-11.0范围内，其效价仍可保持10⁸以上，尤其是pH7.0 3h内噬菌体Bp4活性保持在80%以上。可见噬菌体Bp4对pH的适应范围较广。

D、噬菌体裂解谱测定

应用A步骤（三）中的双层平板法，以24株鸡致病性大肠杆菌为对象，分析噬菌体Bp4的裂解谱。试验中双层平板内能产生噬菌斑则代表噬菌体Bp4裂解该大肠杆菌，不产生噬菌斑代表噬菌体Bp4不能裂解大肠杆菌。

结果显示噬菌体Bp4可以裂解24株致病性大肠杆菌中的8株，其中包括O₇₈、O₈₈和O₁₅ 大肠杆菌，宽噬率为33%。

E、噬菌体Bp4对鸡粪的消毒效果

将需进行细菌计数的样品放入一定比例的生理盐水中，室温充分振荡制成细菌浸出液。将此细菌浸出液用无菌生理盐水按10倍比例稀释，取一定稀释比例的液体1mL加入无菌空平皿，然后加入已高压灭菌并冷却至不烫手的营养琼脂培养基（用于细菌总数计数）或伊红美蓝琼脂培养基（用于大肠杆菌计数），轻轻摇晃使之均匀分布。室温放置30min使之凝固，37℃倒置培养10-12h，取合适稀释比例的平皿计算相应细菌数。每个稀释度设三个重复，进行平板计数。

消毒之前调整噬菌体Bp4效价为1×10⁸pfu/mL。取适量新鲜鸡粪，搅拌均匀后，每组称取200g装于大瓷盘中并抹匀，分为生理盐水对照组、葵甲溴铵消毒剂组和Bp4噬菌体组，常温放置，每组鸡粪用相应液体喷洒，每天早晚各一次，每次喷洒量为20mL，喷洒两天。消毒后以鸡粪为样品通过平板培养法进行细菌计数及大肠杆菌数量计数。根据表1可见，细菌总数方面，与对照组相比，噬菌体Bp4组及葵甲溴铵组的差异极显著，而且Bp4组显著低于葵甲溴铵组；大肠杆菌的数量方面，与对照组相比，噬菌体Bp4组显著低于葵甲溴铵组及对照组，说明噬菌体Bp4对鸡粪中的细菌总数及大肠杆菌数量有显著的消毒效果。

表1

同列肩标字母相同、相邻和相隔分别表示差异不显著(P>0.05)、显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

F、 噬菌体口服后在血液中的药代动力学

将噬菌体增殖到1×10¹⁰PFU/mL，给3只20日龄健康肉仔鸡进行灌服，每只鸡1mL。在灌服后2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h分别采集抗凝血，进行血中噬菌体含量的检测。结果表明，饲喂后2h，噬菌体即可出现在血液中，且一直持续到饲喂后14h，此后从血液中消失。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1. 一株能够通过口服入血的噬菌体，其特征在于，该噬菌体单体为大肠杆菌噬菌体，拉丁名E.coli phage，被命名为Bp4，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，保藏编号为CGMCC No. 9248。

2.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用。

3.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增。

4.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述的噬菌体是多价烈性噬菌体，具有较强的广谱性。

5.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体经鸡口服可入血。

6.一种权利要求1-5任一项所述的噬菌体的应用，其特征在于，该噬菌体作为一种安全的抗生素替代品用于鸡大肠杆菌的控制。

7.一种权利要求1-5任一项所述的噬菌体的应用，其特征在于，该噬菌体作为安全的生物消毒剂用于环境消毒。

8.根据权利要求7所述的噬菌体的应用，其特征在于，该噬菌体用于养殖场环境消毒。

9.一种权利要求1-5任一项所述的噬菌体的应用，其特征在于，该噬菌体作为消毒剂用于鸡粪消毒。