CN103289963B - 一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了一株具有环境消毒能力的噬菌体及其应用，该噬菌体单体为大肠埃希氏菌噬菌体，拉丁名E.coli phage，被命名为Bp7，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCC No.6201；该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源；该噬菌体还可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染，该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

Description

一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途。

背景技术

噬菌体是一类感染细菌的病毒，它常分离自污水或粪便等自然环境样本中，并且它具有严格的宿主特异性，只侵袭一种或几种细菌，所以噬菌体对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。噬菌体可以分为温和噬菌体与烈性噬菌体两大类，其中烈性噬菌体可以在短时间内造成敏感细菌裂解。在杀菌效果方面，烈性噬菌体能裂解细菌并具有指数增殖特征，能作为一种具有抗菌作用的生物消毒剂。

畜禽规模化养殖带来的污染一直是养殖业中的严重问题，它不仅是我国农村污染的主要来源，而且养殖环境污染所导致的疫病爆发也给养殖户造成巨大的经济损失，并严重影响我国的社会经济、公共安全以及动物和动物产品的国际贸易。为了控制污染，养殖场内常会频繁大量的使用各种化学消毒剂，但是化学消毒剂不仅会对动物机体造成伤害，造成畜禽致病、致残、致死的生产事故，还会对养殖场工作人员造成伤害，引发过敏反应甚至中毒症状。面对化学消毒剂带来的种种问题，人们需要新型制剂来取代传统化学消毒剂。

国内的研究者都做过很多类似的噬菌体消毒试验，第四军医大学的徐焰等人用噬菌体XY对环境水样中的大肠埃希菌进行杀菌试验(徐焰，熊鸿燕，郝晓柯，等.大肠埃希菌宽宿主谱噬菌体生物学特性的比较研究[J].中华医院感染学杂志，2007(11)：1345-1348)；第三军医大学的宋彬等人进行了侵袭性大肠杆菌烈性噬菌体的筛选及其对宿主菌的抑制效应观察(宋彬，熊鸿燕，朱才众，等.侵袭性大肠杆菌烈性噬菌体的筛选及其对宿主菌的抑制效应观察[J].中国消毒学杂志，2009(5)：397-400)，但在上述试验中只是在试验室条件下进行的噬菌体模拟消毒试验，其噬菌体分离株分离自医院污水，而非来自鸡场环境，而且未进行过噬菌体鸡场实地环境的消毒试验。

发明内容

本发明提供了一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途，旨在解决畜禽规模化养殖污染一直是养殖业中的严重问题，它不仅是我国农村污染的主要来源，而且养殖环境污染所导致的疫病爆发也给养殖户造成巨大的经济损失，并严重影响我国的社会经济、公共安全以及动物和动物产品的国际贸易，为了控制污染，养殖场内常会频繁大量的使用各种化学消毒剂，但是化学消毒剂不仅会对动物机体造成伤害，造成畜禽致病、致残、致死的生产事故，还会对养殖场工作人员造成伤害，引发过敏反应甚至中毒症状，以及国内的研究者都做过很多类似的噬菌体消毒试验，只是在试验室条件下进行的噬菌体模拟消毒试验，其噬菌体分离株分离自医院污水，而非来自鸡场环境，而且未进行过噬菌体鸡场实地环境的消毒试验的问题。

本发明的目的在于一株具有环境消毒能力的噬菌体，该噬菌体单体为大肠埃希氏菌噬菌体，拉丁名E.coli phage，被命名为Bp7，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCC No.6201。

进一步，该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源。

进一步，该噬菌体可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染，该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

进一步，该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒于鸡舍地面，对鸡舍地面的细菌有明显的消毒效果，并且它的消毒效果较之葵甲溴铵类消毒剂更为显著，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍地面消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍空气样本时，它对空气中的肠杆菌科细菌数有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍空气消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍粉尘时，它对粉尘中的细菌数和肠杆菌科细菌均有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍粉尘消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡粪时，它对鸡粪中的细菌有明显的消毒效果，该噬菌体作为消毒剂用于鸡粪消毒且有明显的消毒效果。

进一步，该噬菌体可为治疗鸡大肠杆菌病提供潜在的治疗药物。

进一步，噬菌体Bp7经双层平板法以40株鸡致病性大肠杆菌为对象，测定出噬菌体Bp7可以裂解40株致病性大肠杆菌中的14株，宽噬率为35％。被噬菌体Bp7裂解的菌株中，有6株O₇₈型，占60％，说明噬菌体Bp7可裂解的优势大肠杆菌血清型为O₇₈，这一结果说明该噬菌体是多价烈性噬菌体且具有较强的广谱性在临床治疗上具有良好的应用前景。

进一步，噬菌体Bp7增殖液可直接用于喷雾消毒已涂布了宿主菌菌液的营养琼脂平板，喷雾30min已经能杀灭平板上99％以上的宿主菌，并随着喷雾时间的延长平板上细菌量逐渐下降，噬菌体Bp7在喷雾形式下仍能保持活力并且对细菌具有明显的杀灭效应。

进一步，该噬菌体Bp7可以单独或混合使用，可以作为一种潜在的药物治疗由大肠杆菌引起的细菌感染。

进一步，该噬菌体可与其他噬菌体联合使用，以获得较宽的噬菌范围。

进一步，该噬菌体可与其他消毒剂联合使用，以获得更优良的消毒效果。

本发明提供了提供一株具有环境消毒能力的噬菌体及其应用，该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源；该噬菌体还可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染，该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

本发明的目的在于，该噬菌体单体为大肠埃希氏菌噬菌体，拉丁名E.coliphage，被命名为Bp7，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCC No.6201。

在本发明实施例中，该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源。

在本发明实施例中，该噬菌体可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染，该噬菌体可用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

在本发明实施例中，该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒于鸡舍地面，对鸡舍地面的细菌有明显的消毒效果，并且它的消毒效果较之葵甲溴铵类消毒剂更为显著，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍地面消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍空气样本时，它对空气中的肠杆菌科细菌数有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍空气消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍粉尘时，它对粉尘中的细菌数和肠杆菌科细菌均有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍粉尘消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡粪时，它对鸡粪中的细菌有明显的消毒效果，该噬菌体作为消毒剂，用于鸡粪消毒且有明显的消毒效果。

在本发明实施例中，该噬菌体可为治疗鸡大肠杆菌病提供潜在的治疗药物。

在本发明实施例中，噬菌体Bp7经双层平板法以40株鸡致病性大肠杆菌为对象，测定出噬菌体Bp7可以裂解40株致病性大肠杆菌中的14株，宽噬率为35％。被噬菌体Bp7裂解的菌株中，有6株O₇₈型，占60％，说明噬菌体Bp7可裂解的优势大肠杆菌血清型为O₇₈，这一结果说明该噬菌体是多价烈性噬菌体且具有较强的广谱性在临床治疗上具有良好的应用前景。

在本发明实施例中，噬菌体Bp7增殖液可直接用于喷雾消毒已涂布了宿主菌菌液的营养琼脂平板，喷雾30min已经能杀灭平板上99％以上的宿主菌，并随着喷雾时间的延长平板上细菌量逐渐下降，噬菌体Bp7在喷雾形式下仍能保持活力并且对细菌具有明显的杀灭效应。

在本发明实施例中，该噬菌体Bp7可以单独或混合使用，可以作为一种潜在的药物治疗由大肠杆菌引起的细菌感染。

在本发明实施例中，该噬菌体可与其他噬菌体联合使用，以获得较宽的噬菌范围。

在本发明实施例中，该噬菌体可与其他消毒剂联合使用，以获得更优良的消毒效果。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明的一个目的是开发对大肠杆菌具有强烈裂解作用的噬菌体分离物，为工业化生产噬菌体用于消毒杀菌提供噬菌体来源。

本发明的又一目的是开发一种新型的安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染。

本发明的再一目的是为治疗鸡大肠杆菌病提供潜在的治疗药物。

本发明从自然界中分离得到一种噬菌体分离物，该噬菌体分离物经纯化后得到噬菌体单体。证明该噬菌体单体对多株大肠杆菌具有广泛的裂解作用。上述分离出的噬菌体单体(大肠埃希氏菌噬菌体，拉丁名E.coli phage)命名为Bp7，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力。噬菌体Bp7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，噬菌体已提交菌种保存管理委员会保藏，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCC No.6201。

本发明中噬菌体Bp7经双层平板法以40株鸡致病性大肠杆菌为对象，测定出噬菌体Bp7可以裂解40株致病性大肠杆菌中的14株，宽噬率为35％。被噬菌体Bp7裂解的菌株中，有6株O₇₈型，占60％，说明噬菌体Bp7可裂解的优势大肠杆菌血清型为O₇₈。这一结果说明该噬菌体是多价烈性噬菌体且具有较强的广谱性在临床治疗上具有良好的应用前景。

本发明中的噬菌体Bp7能裂解所选取的全部4株大肠杆菌工程菌，其宽噬率高达100％。提示：噬菌体Bp7能用于治理实验室工程菌污染。

本发明中噬菌体Bp7增殖液可直接用于喷雾消毒已涂布了宿主菌菌液的营养琼脂平板，喷雾30min已经能杀灭平板上99％以上的宿主菌，并且随着喷雾时间的延长平板上细菌量逐渐下降。提示：本发明中的噬菌体在喷雾形式下仍能保持活力并且对细菌具有明显的杀灭效应。

本发明中的噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒于鸡舍地面，对鸡舍地面的细菌有明显的消毒效果，并且它的消毒效果较之葵甲溴铵类消毒剂更为显著。提示：本发明中的噬菌体作为消毒剂用于鸡舍地面消毒且有明显的消毒效果。

本发明中的噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍空气样本时，它对空气中的肠杆菌科细菌数有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂。提示：本发明中的噬菌体作为消毒剂用于鸡舍空气消毒且有明显的消毒效果。

本发明中的噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍粉尘时，它对粉尘中的细菌数和肠杆菌科细菌均有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂。提示：本发明中的噬菌体作为消毒剂用于鸡舍粉尘消毒且有明显的消毒效果。

本发明中的噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡粪时，它对鸡粪中的细菌有明显的消毒效果。提示：本发明中的噬菌体作为消毒剂用于鸡粪消毒且有明显的消毒效果。

本发明中的噬菌体Bp7可以单独或混合使用，可以作为一种潜在的药物治疗由大肠杆菌引起的细菌感染。

本发明中的噬菌体可以和其他噬菌体联合使用，以获得较宽的噬菌范围。

本发明中的噬菌体可以和其他消毒剂联合使用，以获得更优良的消毒效果。

本发明的噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

实施例1

噬菌体的筛选和纯化

(一)样品的采集

本发明中的鸡粪样品采自山东省潍坊市高密某商品鸡场。

(二)样品中针对大肠埃希氏菌噬菌体的特异性扩增

取2g样品加入预先已扩增好的大肠杆菌(宿主菌加入比例为1∶10)，将其置于恒温摇床37℃，200r/min培养6-8h。

(三)双层平板试验检测特异性噬菌体的存在

高压灭菌琼脂含量为2％的营养琼脂固体培养基，室温放置至约40-60℃后取10-15ml倾倒至培养皿内，均匀铺于皿底，室温放置30min使其凝固，将此营养琼脂平板作为底层琼脂平板。取上述经大肠杆菌扩增后的噬菌体扩增样本1ml，4000rpm离心5min后，取上清液经0.22μm滤膜过滤除菌。滤液装于无菌管中。各取10μL大肠杆菌悬液与50μL上述滤液，混匀后，40℃水浴作用15min，再将混合液加入已高压灭菌并冷却至55℃的5mL琼脂含量为0.7％的营养琼脂培养基中，手搓试管混匀后，迅速倒入己准备好的底层琼脂平板上，旋转平皿使其分布均匀成上层琼脂。待琼脂凝固后，37℃倒置培养6-8h后，观察有无噬斑。如果有则进行步骤(四)。(以上操作均为无菌条件)

(四)噬菌体样品的纯化以扩增

无菌挑取在步骤(三)的大肠杆菌双层平板中出现的单个噬斑，置于盛有800μL生理盐水的无菌EP管中，40℃水浴作用30min，4000r/min离心10min，得到噬菌体浸出液。各取100μL大肠杆菌菌液与噬菌体浸出液加入5ml无菌的3％营养肉汤液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min培养3-4h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。重复3-5次，得到噬菌体单克隆单体，并将该噬菌体命名为Bp7。

(五)噬菌体保存液的制备

将噬菌体增殖液与已高压灭菌的含60％甘油的3％营养肉汤液体培养基以1∶1的比例混合，即得到噬菌体保存液。噬菌体保存液4℃保存。

实施例2

噬菌体形态的观察

将噬菌体增殖液5ml经5000rpm高速离心10min后装入透析袋内进行PEG浓缩至0.5-1ml左右，最后加入2倍体积2.5％的戊二醛固定，此样品进行透射电镜观察。

结果可见噬菌体Bp7有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约93nm；有一个长约106nm的尾，有尾鞘；颈部连接着头部和尾部。(如图1)

实施例3

噬菌体稳定性的检测

1.噬菌体计数方法(效价)

将所得的噬菌体样品用无菌生理盐水按10倍比例稀释，取其中一定比例的样品稀释液10μL与大肠杆菌菌液20μL混合均匀后，用实施例1所述的步骤(三)中的方法制备双层平板，每个稀释度分别做3个平行样。计数时，观察平板中的噬菌斑，取噬菌斑数在30～300个之间的平板来计数测效价。记录此稀释度的3个平行样的噬菌斑数目，然后求得平均数，计算原液的噬菌体数(效价)。

噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×100

2.噬菌体热稳定性的检测

将1×10⁹pfu/mL噬菌体Bp7增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，每一温度两个平行样，各保温30min和60min后，测定噬菌体效价。

结果可见噬菌体Bp7在40℃保温30min后基本上保持原活性，在50℃保温30min和60min后噬菌体效价仍可维持在1×10⁸pfu/mL以上，60℃保温30min和60min后，效价仍保持在1×10⁵pfu/mL以上，而在70℃保温30min，噬菌体基本上被灭活，80℃和90℃的两个作用时间下噬菌体完全失活。由此可见噬菌体Bp7的热稳定性较高。(如表1)

表1噬菌体热稳定性测定结果

3.噬菌体的pH稳定性的检测

取无菌EP管分别加入不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的3％营养肉汤50μL，然后将上述EP管置于37℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入50μL的效价为1×10⁹pfu/mL噬菌体Bp7增殖液，恒温保存2h。每管取10μL作适当稀释后，测定噬菌体效价。

结果可见噬菌体Bp7在pH4.5-9.0范围内，其效价仍可保持10⁸以上，尤其是pH7.0-8.0范围内，噬菌体Bp7活性保持在85％以上，在pH9.0时，噬菌体Bp7有49％的活性；pH4.0时，噬菌体Bp7效价下降到10⁷。可见噬菌体Bp7对pH的适应范围较广。

表2噬菌体pH稳定性测定结果

实施例4

噬菌体裂解谱测定

应用实施例1所述的步骤(三)中的双层平板法，以40株鸡致病性大肠杆菌为对象，分析噬菌体Bp7的裂解谱。试验中双层平板内能产生噬菌斑则代表噬菌体Bp7裂解该大肠杆菌，不产生噬菌斑代表噬菌体Bp7不能裂解大肠杆菌。

结果显示噬菌体Bp7可以裂解40株致病性大肠杆菌中的14株，其中包括10株已定型的O₇₈、O₈₈、O₂₃和O₇₃型细菌，另外4株未定型，宽噬率为35％。被噬菌体Bp7裂解的菌株中，有6株O₇₈型，占60％，说明噬菌体Bp7可裂解的优势大肠杆菌血清型为O₇₈。(如表3)

表3噬菌体Bp7裂解大肠杆菌试验结果

实施例5

噬菌体对4株大肠杆菌工程菌的裂解

应用实施例1所述的步骤(三)中的双层平板法，测定噬菌体Bp7对4株大肠杆菌工程菌(BL21、DH5a、JM109、JM110)的裂解谱。试验中双层平板内能产生噬菌斑则代表噬菌体Bp7裂解该工程菌，不产生噬菌斑代表噬菌体Bp7不能裂解该工程菌。

结果显示噬菌体Bp7对所有的工程菌都裂解，其宽噬率高达100％。

实施例6

噬菌体Bp7对宿主菌的喷雾消毒效果研究

1.噬菌体计数方法(效价)

按实施例3中方法进行噬菌体计数。

2.噬菌体Bp7对宿主菌的喷雾消毒试验

取噬菌体Bp7的宿主菌增殖液涂布平板，分为6组，用经测定效价为1×10⁸pfu/mL的Bp7保存液进行喷雾消毒，分别在喷雾30min、40min、50min、60min和70min后取出平板，并设立不进行喷雾的宿主菌平板作为阴性对照，每组三个平行样本，37℃倒置培养过夜，次日对平板上的细菌进行计数。

试验结果显示喷雾消毒30min后菌量减少至对照组的0.23％，随着喷雾时间的延长细菌量逐渐下降，喷雾70min后细菌量仅为对照组的0.12％。说明喷雾形式的噬菌体Bp7对宿主菌有极其明显的杀灭作用，30min就能杀灭99％以上的细菌。(如表4)

表4噬菌体喷雾对宿主菌的杀灭作用

实施例7

噬菌体Bp7对鸡舍地面的消毒效果研究

1.噬菌体计数方法(效价)

按实施例3中方法进行噬菌体计数。

2.细菌计数方法(效价)

将需进行细菌计数的样品放入一定比例的生理盐水中，室温充分振荡制成细菌浸出液。将此细菌浸出液用无菌生理盐水按10倍比例稀释，取一定稀释比例的液体1mL加入无菌空平皿，然后加入以高压灭菌并冷却至不烫手的2％营养琼脂培养基(用于细菌总数计数)或3.75％的伊红美蓝琼脂培养基(用于肠杆菌科细菌计数)，轻轻摇晃使之均匀分布。室温放置30min使之凝固，37℃倒置培养10-12h，取合适稀释比例的平皿计算相应细菌数。

3.噬菌体Bp7对鸡舍地面的消毒试验

在鸡舍分别选取5个试验区，每个试验区选取5个点，每个点划出3个10×10cm的方格，一个用于生理盐水空白对照组，一个用于噬菌体Bp7消毒，一个用于鸡场常规消毒剂葵甲溴铵消毒剂(配制比例为1∶500)消毒，消毒之前调整噬菌体效价为1×10⁸pfu/mL。用装有不同消毒液的喷雾器对方格内地面喷洒相同次数至表面湿润，放置30min。消毒结束后，用无菌生理盐水湿润适当大小的灭菌纱布，以无菌镊子夹住纱布充分擦拭各消毒区域，以纱布为样品进行细菌计数。

结果显示与对照组相比，葵甲溴铵消毒剂组差异显著而Bp7噬菌体组差异极显著，这表示Bp7噬菌体作为消毒剂比葵甲溴铵消毒剂对细菌总数的杀灭作用更为显著。(如表5)

表5鸡舍地面消毒各试验组消毒效果

同列肩标字母相同、相邻和相隔分别表示差异不显著(P＞0.05)、显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)。

实施例8

噬菌体Bp7对鸡舍空气的消毒效果研究

1.噬菌体计数方法(效价)

同实施例3。

2.细菌计数方法(效价)

同实施例7。

3.噬菌体Bp7对鸡舍空气的消毒试验

取无菌的直径为15cm的滤纸置于无菌平皿中，滴加适量无菌生理盐水使之湿润，暴露于鸡舍内1h收集细菌，将其干燥制成菌片对其进行喷雾消毒，分为生理盐水对照组、Bp7噬菌体组和葵甲溴铵消毒剂(配制比例为1∶500)组。消毒之前调整噬菌体Bp7效价为1×10⁸pfu/mL。消毒结束后37℃烘干滤纸，以滤纸为样品进行细菌计数。

结果可见在肠杆菌科细菌数方面，噬菌体Bp7组极显著低于对照组，而葵甲溴铵类消毒剂组则与对照组之间没有显著差异。这说明噬菌体Bp7在鸡舍空气消毒中对肠杆菌科细菌有及明显的消毒效果并极显著优于葵甲溴铵消毒剂。(如表6)

表6鸡舍空气消毒各试验组消毒效果

同列肩标字母相同、相邻和相隔分别表示差异不显著(P＞0.05)、显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)。

实施例9

噬菌体Bp7对鸡舍粉尘的消毒效果研究

1.噬菌体计数方法(效价)

同实施例3。

2.细菌计数方法(效价)

同实施例7。

3.噬菌体Bp7对鸡舍粉尘的消毒试验

称取10g鸡舍粉尘放入含有190ml无菌生理盐水的锥形瓶中，室温振荡混匀，将粉尘浸出液用无菌双层纱布过滤，取8ml滤液滴加于已高压灭菌并烘干的直径为15cm的滤纸上，将其干燥制成菌片对其进行喷雾消毒，分为生理盐水对照组、Bp7噬菌体组和葵甲溴铵类消毒剂(配制比例为1∶500)组。消毒之前调整噬菌体Bp7效价为1×10⁸pfu/mL。消毒结束后37℃烘干滤纸，以滤纸为样品进行细菌计数。

结果可见对噬菌体Bp7对鸡舍粉尘中的细菌总数和肠杆菌科细菌均有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂。(如表7)

表7鸡舍粉尘消毒各试验组消毒效果

同列肩标字母相同、相邻和相隔分别表示差异不显著(P＞0.05)、显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)。

实施例10

噬菌体Bp7对鸡粪的消毒效果研究

1.噬菌体计数方法(效价)

同实施例3。

2.细菌计数方法(效价)

同实施例7。

3.噬菌体Bp7对鸡粪的消毒试验

消毒之前调整噬菌体Bp7效价为1×10¹¹pfu/mL。取适量新鲜鸡粪，搅拌均匀后，每组称取200g装于大瓷盘中并抹匀，分为生理盐水对照组、葵甲溴铵消毒剂组和Bp7噬菌体组，常温放置，每组鸡粪用相应液体喷洒，每天早晚各一次，每次喷洒量为20mL，喷洒两天。消毒后以鸡粪为样品进行细菌计数。结果可见细菌总数方面，与对照组相比，噬菌体Bp7组及葵甲溴铵组的差异均显著，说明噬菌体Bp7对鸡粪中的细菌有显著的消毒效果。(如表8)

表8鸡粪消毒各试验组消毒效果

同列肩标字母相同、相邻和相隔分别表示差异不显著(P＞0.05)、显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)。

本发明实施例提供了提供一株具有环境消毒能力的噬菌体及其应用，该噬菌体单体为大肠埃希氏菌噬菌体，拉丁名E.coli phage，被命名为Bp7，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCC No.6201；该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源；该噬菌体还可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染，该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株具有环境消毒能力的噬菌体，其特征在于，该噬菌体单体为大肠埃希氏菌噬菌体，拉丁名E.coliphage，被命名为Bp7，对大肠杆菌具有广谱的杀菌能力，噬菌体Bp7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCC No.6201。

2.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体对大肠杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源。

3.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，从而治理养殖业污染与实验室污染，该噬菌体可以用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于实验室环境消毒与鸡场环境消毒。

4.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒于鸡舍地面，对鸡舍地面的细菌有明显的消毒效果，并且它的消毒效果较之葵甲溴铵类消毒剂更为显著，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍地面消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍空气样本时，它对空气中的肠杆菌科细菌数有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍空气消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡舍粉尘时，它对粉尘中的细菌数和肠杆菌科细菌均有极显著的消毒效果且极明显优于葵甲溴铵类消毒剂，该噬菌体作为消毒剂用于鸡舍粉尘消毒且有明显的消毒效果；

该噬菌体Bp7单独使用时，作为消毒剂喷洒消毒于鸡粪时，它对鸡粪中的细菌有明显消毒效果，该噬菌体作为消毒剂用于鸡粪消毒且有明显的消毒效果。

5.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体可为治疗鸡大肠杆菌病提供潜在的治疗药物。

6.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，噬菌体Bp7经双层平板法以40株鸡致病性大肠杆菌为对象，测定出噬菌体Bp7可以裂解40株致病性大肠杆菌中的14株，宽噬率为35％。被噬菌体Bp7裂解的菌株中，有6株O₇₈型，占60％，说明噬菌体Bp7可裂解的优势大肠杆菌血清型为O₇₈，这一结果说明该噬菌体是多价烈性噬菌体且具有较强的广谱性在临床治疗上具有良好的应用前景。

7.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，噬菌体Bp7增殖液可直接用于喷雾消毒已涂布了宿主菌菌液的营养琼脂平板，喷雾30min已经能杀灭平板上99％以上的宿主菌，并随着喷雾时间的延长平板上细菌量逐渐下降，噬菌体Bp7在喷雾形式下仍能保持活力并且对细菌具有明显的杀灭效应。

8.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体Bp7可以单独或混合使用，可以作为一种潜在的药物治疗由大肠杆菌引起的细菌感染。

9.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体可与其他噬菌体联合使用，以获得较宽的噬菌范围。

10.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，该噬菌体可与其他消毒剂联合使用。