CN111296493A - 一种噬菌体消毒剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噬菌体消毒剂及其制备方法，其组成包括大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体和绿脓杆菌噬菌体的菌液。该噬菌体消毒剂生物安全性高，摆脱了传统化学消毒剂毒副性大的缺点。本发明中的噬菌体为裂解性的，对环境中存在的常见致病菌具有广谱杀菌作用，特异性强。本发明所涉及的消毒剂制备工艺简便，杀菌效果长效持久。

Description

一种噬菌体消毒剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌体消毒剂的制备技术。
背景技术
日常生活中病菌无处不在，因此消毒剂被广泛应用于各类场所的消毒工作中。传统的化学消毒剂如过氧化物类消毒剂，氯制剂类消毒剂，醛类消毒剂等化学性质不稳定，刺激性强，长期使用会损害眼睛、呼吸道黏膜等，某些代谢物还具有致癌风险。鉴于化学消毒剂的毒副作用较大，开发一种安全性好，杀菌能力强且能在环境中长时间存在，长效杀毒的消毒剂尤为重要。
噬菌体是一类感染细菌的病毒，能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体是专性细胞内寄生，可以在细菌细胞外存在,但只能在细胞内繁殖(即遗传物质一定要进入细胞内才能繁殖)。噬菌体常分离自污水或粪便等自然环境样本中，并且它具有宿主特异性，只侵袭一种或几种细菌，所以噬菌体对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。噬菌体可以分为温和噬菌体与烈性噬菌体两大类，其中烈性噬菌体可以在短时间内造成敏感细菌裂解。在杀菌效果方面，烈性噬菌体能裂解细菌并具有指数增殖特性，是一种具有抗菌作用的生物消毒剂。
大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌，是一种革兰氏阴性兼性厌氧杆状细菌。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。当它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。大肠杆菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。
金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，在适宜条件下，能产生肠毒素，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症，脓毒症等全身感染。食物受金黄色葡萄球菌污染的程度越严重，其繁殖速度越快，越易形成毒素。
绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌，是一种革兰氏阴性菌。此细菌广泛分布于自然界，是伤口感染比较常见的细菌，能引起病变组织的化脓性改变，感染后因脓汁和渗出液呈绿色，因此称为绿脓杆菌。在人体的正常皮肤、胃肠道和呼吸道分布非常广泛，是临床上比较常见的致病菌。绿脓杆菌是一种令免疫受损的机会性感染病原，一般影响肺部及泌尿道，或造成烧伤、伤口及其他血液感染，如败血病，也是造成烧伤感染最普遍的细菌。绿脓杆菌能产生多种致病物质，主要是内毒素、外毒素、蛋白分解酶和杀白组胞素等。其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力降低时，如大面积烧伤，长期使用免疫抑制剂等。临床上常见的有皮肤和皮下组织感染，中耳炎、脑膜炎、呼吸道感染、尿道感染、败血症等。
随着抗生素的广泛应用，耐药细菌菌株大量出现与流行，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。近年来出现一些“超级细菌”，它们几乎对所有的抗生素都不敏感，导致人类对此类细菌的感染几乎无药可用，因此需要新的抗感染武器来替代抗生素。
专利201810868504.3中公开了一株具有环境消毒能力的噬菌体及其应用，该噬菌体对绿脓杆菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及用于消毒杀菌提供了噬菌体来源。但其针对的菌种较为单一，应用范围较小。
专利200880006630.2中公开了一种用于对动物外消毒的方法，包括将噬菌体施用于该外层，可以控制动物的外层上的微生物群体。但该发明不适用于环境中的消毒杀菌。
发明内容
本发明提供了一种基于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌这上述三种生活中最为常见的致病菌的具有良好的安全性与杀菌能力的噬菌体混合制剂，来持久杀灭环境中潜藏的致病菌。
一方面，本发明提供了一种噬菌体消毒剂，其包括大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体。
具体地，所述的大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体的数量比例为1：1：1，噬菌体总有效含量≥1010PFU/mL。
优选地，所述的噬菌体消毒剂含凝胶剂；所述的凝胶剂包括但不限于海藻酸钠、卡波姆、壳聚糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素中的一种或几种；进一步优选为卡波姆。
优选地，所述的噬菌体消毒剂含有pH调节剂；所述的pH调节剂包括但不限于枸橼酸、枸橼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或几种的水溶液。
优选地，所述的噬菌体消毒剂pH为6-8。
另一方面，本发明提供的噬菌体消毒剂的应用量为以100mL/m2的剂量喷洒施用。
再一方面，本发明提供了一种噬菌体凝胶消毒剂的制备方法。
具体地，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)按照比例配置大肠杆菌噬菌体，金黄色葡萄球菌噬菌体，绿脓杆菌噬菌体混合菌液；
(2)向混合菌液中加入凝胶剂，混合均匀，得到胶体；
(3)滴加pH调节剂调节胶体pH值；
(4)灌装，得到噬菌体凝胶消毒剂。
优选地，所述的步骤(1)中大肠杆菌噬菌体，金黄色葡萄球菌噬菌体，绿脓杆菌噬菌体的数量比例为1：1：1，噬菌体总有效含量≥1010PFU/mL。
优选地，所述的步骤(3)中pH调至6-8。
本发明的有益效果在于：
1、所述噬菌体消毒剂安全性好，没有化学消毒剂的腐蚀性和刺激性气味，对环境和人安全无毒。
2、该噬菌体消毒剂对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌具有广谱杀菌作用，特异性强，长效杀菌。
3、制备工艺简便，适合于广泛生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中选用的大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体是从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购得。其中大肠杆菌噬菌体于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其分类命名为Escherichia coli bacteriophage，保藏编号为CCTCCNO.M2016539；金黄色葡萄球菌噬菌体于2016年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，其分类命名为Staphylococcus aureus subsp.aureus bacteriophage，保藏编号为CCTCCNO.M2016535。绿脓杆菌噬菌体是从美国菌种保藏中心购得(简称ATCC，位于弗吉尼亚州的马纳萨斯)，保藏号为ATCC 15692-B4。
实施例1一种噬菌体凝胶消毒剂的制备方法
将本实验室保存的纯化后的噬菌体进行活化，使其效价≥1010PFU/mL，向40mL含有等比例的大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体混合菌液加入20g海藻酸钠，混合均匀，得到胶体，滴加3.8％枸橼酸钠水溶液调节胶体pH值至7.4，灌装，得到噬菌体凝胶消毒剂。
实施例2一种噬菌体凝胶消毒剂的制备方法
参照实施例1的制备方法，其中凝胶剂采用卡波姆，其余操作同实施例1。
实施例3一种噬菌体凝胶消毒剂的制备方法
参照实施例1的制备方法，其中凝胶剂采用壳聚糖，其余操作同实施例1。
实验例1噬菌体凝胶消毒剂的杀菌效果测定
对实施例1-3制备的凝胶杀毒即进行杀菌效果测定，以实施例1为例，具体包括以下步骤：
1、制备宿主菌菌液。
在平板上挑取一菌落，在普通的琼脂板上划线分离单菌落，37℃恒温箱中培养12-16h。分别挑取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌单菌落，分别接种到盛有5mL LB培养基的试管中，37℃，200rpm震荡培养12h，得到宿主菌的菌悬液。
2、设置实验组与对照组。
取2.0cm×3.0cm大小的测试样片和对照样片各4片，测试样片用实施例1制备的消毒凝胶浸润，对照样片与测试样片同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理，将测试样片和对照样片分成4组置于4个灭菌平皿内。取步骤1大肠杆菌的悬液、金黄色葡萄球菌的悬液、绿脓杆菌的悬液和灭菌LB培养基，分别在每个测试样片和对照样片上滴加10μL，均匀涂布，开始计时，作用1min，用无菌镊分别将样片投入含5mL中和剂(PBS缓冲液)的试管内，充分混匀。
3、细菌计数方法。
将需进行细菌计数的样品放入一定比例的生理盐水中，室温充分振荡制成细菌浸出液。将此细菌浸出液用无菌生理盐水按10倍比例稀释，取一定稀释比例的液体1mL加入无菌空平皿，然后加入已高压灭菌并冷却至不烫手的LB琼脂培养基，轻轻摇晃使之均匀分布。室温放置30min使之凝固，37℃倒置培养10-12h，取合适稀释比例的平皿计算相应细菌数。每个稀释度设三个重复，进行平板计数，并计算杀灭对数值。
实施例2-3采用相同的检测方法，检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002404439470000051
由表1可知，本发明通过比较海藻酸钠，卡波姆，壳聚糖这三种凝胶剂对于噬菌体消毒剂消毒效果的影响，发现卡波姆的效果最佳。
实验例2环境杀菌作用检测
在生物实验室随机选取10个点(每个点均为1m2×20cm)作为试验区，并做标记，将浓度分别为1×108PFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌三种菌株等比混合均匀后喷洒于生物实验室试验区，然后以实施例2获得的噬菌体凝胶消毒剂以100mL/m2的剂量对试验区均匀涂抹，1h后检测菌残留量，发现其中3个试验区仍有残留，4h后检测产肠毒素性大肠杆菌残留，10个试验区均未检测到菌株残留。

Claims (10)

1.一种噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的消毒剂包含大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体。
2.根据权利要求1所述的噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的噬菌体总有效含量≥1010PFU/mL。
3.根据权利要求1所述的噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体的数量比例为1：1：1。
4.根据权利要求1所述的噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的消毒剂为凝胶消毒剂；所述的凝胶消毒剂含凝胶剂；所述的凝胶剂为海藻酸钠、卡波姆、壳聚糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的消毒剂含有pH调节剂；所述的pH调节剂为枸橼酸、枸橼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或几种的水溶液。
6.根据权利要求1所述的噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的噬菌体消毒剂的pH为6-8。
7.根据权利要求1所述的噬菌体消毒剂，其特征在于，所述的噬菌体消毒剂以100mL/m2的剂量喷洒施用。
8.一种权利要求4所述的噬菌体消毒剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照比例配置大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体混合菌液；
(2)向混合菌液中加入凝胶剂，混合均匀，得到胶体；
(3)滴加pH调节剂调节胶体pH值；
(4)灌装，得到噬菌体凝胶消毒剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、绿脓杆菌噬菌体的数量比例为1：1：1，噬菌体总有效含量≥1010PFU/mL。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中pH调节剂调节pH至6-8。
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