KR20220041222A - 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 및 그 조합물, 키트, 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게, 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 및 그 조합물, 키트, 응용을 개시하며, 상기 산토모나스 파지는 보존 번호가 CCTCC NO:M 2020805인 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)이며; 해당 박테리오파지는 자외선 및 산성 환경에 대한 비교적 높은 내성을 가지며, 다양한 방제 환경에서 양호한 방제효과를 달성할 수 있으며; 상기 조합물은 적어도 하나 이상의 산토모나스 파지 GJ19P1을 포함하며; 상기 키트는 상기 산토모나스 파지 GJ19P1 또는 산토모나스 파지 GJ19P1의 조합물을 포함하며; 상기 산토모나스 파지 GJ19P1 조합물은 산토모나스균을 사살하는 데 적용되며, 단 이에 한정되지 않는다.

Description

균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 및 그 조합물, 키트, 응용
본 발명은 박테리오파지 기술분야에 관한 것으로, 보다 상세하게, 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 및 그 조합물, 키트, 응용에 관한 것이다.
산토모나스 속, 막대 모양 박테리아, 말단 편모 운동, 절대 호기성. 배지를 통해 브로모아릴 폴리엔 화학성분을 함유한 카로티노이드 수불용성 황색 안료를 생성하여 균락이 황색을 띠게 한다. 모든 산토모나스균은 식물성 병원균으로 식물의 질병을 유발할 수 있다.
산토모나스속은 자체의 중요한 검역성에 의해 <중화인민공화국 입국 식물검역성 유해 생물 목록>에 든 다음과 같은14종의 병원성 변종을 포함한다: 산토모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans),산토모나스 아르보리콜라 패소바 셀레벤시스(Xanthomonas arboricola pv. celebensis), 산토모나스 악소노포디스 패소바 베틀리콜라(Xanthomonas axonopodis pv. betlicola), 산토모나스 악소노포디스 패소바 시트리(Xanthomonas axonopodis pv. citri), 산토모나스 악소노포디스 패소바 마니호티스 (Xanthomonas axonopodis pv. manihotis), 산토모나스 악소노포디스 패소바 바스큘럼(Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum), 산토모나스 악소노포디스 패소바 맹기페라 인디카 (Xanthomonas axonopodis pv. mangiferaeindicae), 산토모나스 캄페스트리스 패소바 망기페라 인디카(Xanthomonas campestris pv. mangiferaindicae), 산토모나스 캄프스트리스 패소바 무사체룸(Xanthomonas campestris pv. musacearum), 산토모나스 카사바(Xanthomonas cassavae),산토모나스 프라가리아에(Xanthomonas fragariae), 산토모나스 히아신티(Xanthomonas hyacinthi),산토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,), 산토모나스 오리재 패소바 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola), 산토모나스 포퓰리(Xanthomonas populi). 중국검험검역과학연구원 동식물검역정보자원공유서비스플랫폼을 통해 입수한 포트 자료 통계에 따르면, 2015년 1월부터 2017년 2월까지 2년 동안, 중국항만분지국이 여객 소지품 및 곡물, 대두, 야채, 과일, 기타 식물 제품, 묘목, 원자재 및 제품, 원목 등의 화물에 대한 검역 결과 상, 산토모나스균이 총 586건 발견되었다. 예를 들어, 산토모나스 오리제에 의해 유발되는 벼흰빛잎마름병은 벼 생산 과정에서 가장 심각한 박테리아 질병 중 하나이다. 산토모나스 캄페스트리스 패소바 망기페라인디카에 의한 망고의 세균성 흑반병은 망고에 흔하게 발생하는 중요한 질병으로 망고의 수확량과 과일의 상업적 가치에 심각한 영향을 미친다. 산토모나스 악소노포디스 패소바 시트리는 감귤 궤양병의 병원성 균종으로 감귤 과일의 수확량과 품질에 심각한 영향을 미친다. (Lin Wenli, Xiao Fulian. 감귤 궤양병의 검출 방법 및 방제 기술에 대한 연구 진전 [J]. 현대 농업과기, 2012(22):112-114.).
박테리오파지는 세균을 특이적으로 용해시키는 바이러스의 일종으로 단백질과 핵산을 주요 화학성분으로 구성되며, 토양, 공기, 물 및 생물체 등에 널리 존재하며, 세균 세포 표면의 특정 부위와 결합하여 특이성 세균을 사멸하는 바이러스 특이성이 강하다. 1915년, Frederik Tword에 의해 박테리오파지가 처음 발견된 이후, 연구자들의 다양하게 많은 연구를 통해 박테리오파지가 가진 높은 항균 활성과 특이성에 의한 약물 내성 박테리아에 대한 방제 및 미생물 군락 손상을 방지하는 효과를 입증하였다. 항생제 치료에 비해 부작용이 극히 적고 더 신속하고 효과적이며 유기체의 자연 면역을 억제하거나 알레르기 반응을 유발하지 않으며, 인간, 기타 포유류 및 식물에 대한 침습성 및 독성을 가지지 않는다. 그러나, 현재 박테리오파지에 대한 연구는 선별 및 생물학적 특성에만 초점을 두고 있으며, 파지 응용 관련 보도는 아주 적다. 따라서, 적합한 독성 파지를 선별 및 적용하는 것은 새로운 항균제를 개발하는 효과적인 방법으로 되고 있다.
현재, 산토모나스균에 의해 유발되는 식물의 세균성 질병을 방제하기 위한 산토모나스 파지 용도에 대한 연구는 아주 적다.
상술한 관련 기술에 대해, 본 발명인은 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지를 찾아 내는 것은 시급한 과제라고 생각한다.
본 발명은 다양한 방제 환경에 대한 파지의 내성이라는 기술적인 난제를 해결하기 위해, 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 및 그 조합물, 키트, 응용에 관하여 안출한다.
첫번째 측면에서, 본 발명은 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지를 제공하며, 다음과 같은 기술 방안을 채택한다: 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지에 있어서, 상기 산토모나스 파지는 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)이며, 보존번호는 CCTCC NO: M 2020805이다.
본 발명은 상기 기술 방안을 채택하여, 우수한 pH 내성을 갖는 산토모나스 파지 GJ19P1을 제공하며, 현재, 해당 파지는 중국 전형배양물 보존센터에 보존번호 CCTCC NO:M 2020805로 보존 중에 있다.
바람직하게, 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 감염 다중도 MOI=0.0001 여건에서 24시간 동안 배양되어, 역가는 3.5×1010PFU/mL 이상에 달한다.
상기 채택한 기술 방안에서, 감염 다중도(MOI)는 파지수와 세균수 간의 비율을 나타내며, 파지 감염 세균과 생성된 파지 자손의 용량영향 관계를 연구하는데 중요한 근거로 적용된다. 본 발명의 산토모나스 파지는 소량만 첨가해도 증식 중인 산토모나스균를 감염시켜 다량의 자손 파지를 얻을 수 있다. 본 발명은 파지 살균제의 산업 생산을 위해 고품질의 파지 균주 공급원을 제공한다.
바람직하게, 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 pH=2~10의 여건에서 내성을 가지며, 96시간 내로 역가 감소가 4개 자릿수를 초과하지 않으며; 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 9개의 상이한 산토모나스 병원성 변종 균주에 대해 91.8%에 달하는 강한 용해력을 가지고 있으며; 또한, 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)이 단일한 산토모나스 병원성 변종에 대한 용해력은 전부 85% 이상에 달한다.
상기 채택한 기술방안을 통해, 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 pH 2과 같은 산성 여건에서 우수한 내성을 가지며. 방제 환경이 pH = 2~10 사이에 있을 때, 본 발명의 산토모나스 파지는 양호한 방제 역할을 할 수 있음을 알 수 있다. 본 방안의 산토모나스 파지 GJ19P1은 다양한 산토모나스 병원성 변종에 의해 유발되는 세균성 질병을 예방 및 치료하는 데 사용할 수 있다.
바람직하게, 자외선 조사 8h 후 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)에서 역가의 감소는 2개 자릿수를 초과하지 않는다.
상기 채택한 기술방안을 통해, 자외선이 비교적 강한 방제 환경에서 본 발명에 기재된 산토모나스 파지 GJ19P1은 내성이 좋고，역가 감소가 적으며, 병원균에 대해 효과적인 방제 역할을 한다．
바람직하게, 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 상이한 산토모나스 병원성 변종을 고효율적으로 식별할 수 있고, 비교적 넓은 용해 범위를 갖는다.
본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 상기 기술방안을 채택함으로써, 9종의 상이한 산토모나스 병원성 변종 균주에 대해 비교적 강한 용해력을 갖추게 되며, 상응한 용해율은 91.8%에 달할 수 있으며; 단일 산토모나스 병원성 변종의 용해력은 전부 85%이상에 달한다. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 다양한 산토모나스 병원성 변종 의해 유발되는 세균성 질병을 예방 및 치료하는 데 사용할 수 있다.
두번째 측면에서, 본 발명을 통해 안출된 산토모나스 파지 조합물에 있어서, 다음의 기술방안을 채택한다:
균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물에 있어서, 상기 조합물은 적어도 1종의 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)균주를 포함한다.
바람직하게, 상기 조합물은 화학성 살균제를 포함한다.
바람직하게, 상기 화학성 살균제는 아모밤의 700배액이다.
상기 기술 방안을 채택함으로써, 상기 산토모나스 파지 GJ19P1 및 화학성 살균제를 조성물로 조합 사용한다. 예시적인 설명에 있어서, 산토모나스 파지 GJ19P1과 아모밤 700배액 사이의 사용 비례 관계는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 본 발명 및 실제 응용분야, 본 분야의 상식과 연결시켜 확정할 수 있다.
바람직하게, 상기 조합물은 다음을 포함한다: 산토모나스 악소노포디스 파지 YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5), 보존번호 CTCCC NO:M 2018579; 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phagePSA-P1), 보존번호 CTCCC NO: M 2020252; 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3), 보존번호 CTCCC NO: M2016635.
상기 기술 방안을 채택하여 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 다른 박테리오 파지와도 혼합하여 사용할 수 있으며, 이와 같은 조합물로 산토모나스 악소노포디스 파지의 용해율이 97% 이상에 달하는 더 강한 용해 특성을 나타낸다.
세번째 측면에서, 본 발명을 통해 안출된 산토모나스 파지 키트에 있어서, 다음의 기술방안을 채택한다:
균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1) 또는 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)의 조합물을 포함한다.
상기 채택된 기술방안을 통해, 본 발명의 산토모나스 파지에 대한 빠른 검출은 시험지, 키트 등의 형태를 포함하나, 단 이에 한정되지 않는 방식으로 산토모나스균를 검출하거나, 또는 임상 샘플 중의 표적 병원성 박테리아에 대한 선별을 통해 검출 감도를 효과적으로 확보한다.
네번째 측면에서, 본 발명을 통해 안출된 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 응용에 있어서, 다음의 기술방안을 채택한다:
균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물의 응용에 있어서, 상기 산토모나스 파지 GJ19P1의 조합물은 바이오류 소독제 또는 바이오류 살충제의 유효성분으로 적용하여, 산토모나스균에서 유래되는 단, 이에 한정되지 않는 세균성 질병을 방제한다.
상기 채택한 기술방안을 통해, 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물은 산토모나스균 및 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하는 데 사용할 수 있으며, 산토모나스균 및 이에 한정되지 않는 질병을 방제하는 바이오 제제로 사용할 수 있다.
상술한 내용을 요약하면, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 가진다:
1. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 자외선 및 산성 환경에 대한 내성이 높고 다양한 방제 환경에 적합하며 감귤궤양병에 대한 우수한 생물학적 방제 효과를 나타낸다;
2. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 자연에서 분리된 독성 파지로, 시험용 파지는 독성 유전자 또는 불량 유전자를 포함하지 않으며, 이와 같은 파지의 DNA은 잠재적인 건강 리스크를 유발할 수 있는 단백질을 인코딩할 수 없으며, 용원성 유전자를 운반할 가능성이 존재하지 않는다;
3. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 높은 친화성 및 용해력을 가지며, 배양하여 24시간 내로 1010PFU/mL 이상의 역가에 도달하며; 산토모나스 파지 GJ19P1은 특이적으로 부분적 또는 전부의 산토모나스균를 비활성화할 수 있으며, 소량의 초기 파지만을 사용해도 다량 증식을 완성할 수 있어, 파지 살균제의 산업화 생산을 위해 양질의 파지 균주 공급원을 제공한다; 본 발명이 속하는 분야의 당업자이라면 본 발명의 기재 및 본 분야의 상식에 따라 본 발명에 기재된 산토모나스 파지 GJ19P1 또는 그 조합물을 검출, 소독 및 식물 보호 등에 활용할 수 있는 다양한 제품으로 제조하여 산업적인 응용을 추진할 수 있다;
4. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 엄밀한 독성 파지로, 숙주균에 대한 높은 특이성과 용해성, 비교적 넓은 숙주 범위를 나타내며, 9종의 상이한 산토모나스 병원성 변종 184개에 대한 용해율이 91.8%의 높은 수치를 나타내며; 단일한 산토모나스 병원성 변종에 대한 용해력은 전부 85% 이상에 달하며; 산토모나스 파지 GJ19P1은 다양한 환경 소독용 제품의 유효성분으로 적용되어, 액체 침지, 분무, 수성 담체와 복합 사용하는 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 형식으로 급수시스템, 관개시설, 양식시설, 공공 및 민간 시설 또는 기타 환경 표면에 대한 소독 및 오염 제거를 진행하여 표적 세균의 번식과 활성을 효과적으로 억제할 수 있으며; 상기 액체 침지, 분부 형식은 세척제, 소독제, 오염제거제 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 상기 수성 담체는 인산염 완충액, TSB 배지, LB 배지, 염소화 유리수 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다;
5. 본 발명에서 산토모나스 파지 GJ19P1는 실험에 투여된 10개의 비숙주 병원성 박테리아 균주 중 어느 하나도 식별할 수 없으며, 이는 특이성이 우수함을 설명한다.
6. 본 발명에서 상기 산토모나스 파지 GJ19P1은 양호한 안정성 및 pH=2~10 여건에 대한 내성을 가지며, 96시간 내로 역가 감소는 4개 자릿수를 초과하지 않으며; 자외선으로 8시간 조사한 후, 역가 감소는 2개 자릿수를 초과하지 않는다;
7. 본 발명에서, 산토모나스 파지 GJ19P1는 조합물, 시제 및 키트 제조에 사용될 수 있으며, 산토모나스균 및 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하는 데 사용할 수 있으며, 산토모나스균 및 이에 한정되지 않는 질병을 방제하는 바이오 제제로 사용할 수 있다.
상술한 내용을 요약하면, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 가진다:
1. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 자외선 및 산성 환경에 대한 내성이 높고 다양한 방제 환경에 적합하며 감귤궤양병에 대한 우수한 생물학적 방제 효과를 나타낸다;
2. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 자연에서 분리된 독성 파지로, 시험용 파지는 독성 유전자 또는 불량 유전자를 포함하지 않으며, 이와 같은 파지의 DNA은 잠재적인 건강 리스크를 유발할 수 있는 단백질을 인코딩할 수 없으며, 용원성 유전자를 운반할 가능성이 존재하지 않는다;
3. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 높은 친화성 및 용해력을 가지며, 배양하여 24시간 내로 1010PFU/mL 이상의 역가에 도달하며; 산토모나스 파지 GJ19P1은 특이적으로 부분적 또는 전부의 산토모나스균를 비활성화할 수 있으며, 소량의 초기 파지만을 사용해도 다량 증식을 완성할 수 있어, 파지 살균제의 산업화 생산을 위해 양질의 파지 균주 공급원을 제공한다; 본 발명이 속하는 분야의 당업자이라면 본 발명의 기재 및 본 분야의 상식에 따라 본 발명에 기재된 산토모나스 파지 GJ19P1 또는 그 조합물을 검출, 소독 및 식물 보호 등에 활용할 수 있는 다양한 제품으로 제조하여 산업적인 응용을 추진할 수 있다;
4. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1은 엄밀한 독성 파지로, 숙주균에 대한 높은 특이성과 용해성, 비교적 넓은 숙주 범위를 나타내며, 9종의 상이한 산토모나스 병원성 변종 184개에 대한 용해율이 91.8%의 높은 수치를 나타내며; 단일한 산토모나스 병원성 변종에 대한 용해력은 전부 85% 이상에 달하며; 산토모나스 파지 GJ19P1은 다양한 환경 소독용 제품의 유효성분으로 적용되어, 액체 침지, 분무, 수성 담체와 복합 사용하는 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 형식으로 급수시스템, 관개시설, 양식시설, 공공 및 민간 시설 또는 기타 환경 표면에 대한 소독 및 오염 제거를 진행하여 표적 세균의 번식과 활성을 효과적으로 억제할 수 있으며; 상기 액체 침지, 분부 형식은 세척제, 소독제, 오염제거제 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 상기 수성 담체는 인산염 완충액, TSB 배지, LB 배지, 염소화 유리수 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다;
5. 본 발명에서 산토모나스 파지 GJ19P1는 실험에 투여된 10개의 비숙주 병원성 박테리아 균주 중 어느 하나도 식별할 수 없으며, 이는 특이성이 우수함을 설명한다.
6. 본 발명에서 상기 산토모나스 파지 GJ19P1은 양호한 안정성 및 pH=2~10 여건에 대한 내성을 가지며, 96시간 내로 역가 감소는 4개 자릿수를 초과하지 않으며; 자외선으로 8시간 조사한 후, 역가 감소는 2개 자릿수를 초과하지 않는다;
7. 본 발명에서 산토모나스 파지 GJ19P1는 조합물, 시제, 키트의 제조에 사용할 수 있으며, 표적 샘플 중의 산토모나스균에 대한 시험지, 키트 등의 형태를 포함하나 단 이에 한정되지 않는 빠른 검출에 응용하거나, 임상 샘플 중의 표적 병원성 박테리아에 대한 선별을 진행하여 검출의 감도를 효과적으로 확보한다;
8. 산토모나스 파지 GJ19P1및 그 조합물이 액체 배지에 함유된 농도가 103 PFU/mL인 산토모나스균에 대하여 양호한 사멸 능력을 나타내며; 산토모나스 파지 GJ19P1의 농도가 ≥1×104 PFU/mL일 경우, 산토모나스균에 대한 사멸률이 98.2% 이상에 달하며, 기타 복합 사용한 물질에 대한 길항 작용을 나타내지 않는다;
9. 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phageGJ19P1) 및 그 조합물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 본 발명의 기재 및 본 분야의 상식에 따라 바이오 약제로 제조되어, 산토모나스균으로 인한, 단, 이에 한정되지 않는 세균으로 인한 질병 방제에 응용할 수 있다.
도 1은 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phageGJ19P1)의 플라크를 나타낸 예시도;
도 2는 투과형 전자현미경으로 식별한 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)의 형태 구조를 나타낸 예시도이다.
아래에 도 1 및 실시예와 연결시켜 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.
하기 실시예에서 당사의 명명 방식에 따라 지정된 균주 번호를 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1(anthomonas phage GJ19P1), 보존번호 CTCCC NO:M 2020805, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 보존 날짜: 2020년 11월 30일; 산토모나스 악소노포디스 파지 YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5), 보존번호 CTCCC NO:M 2018579, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 보존 날짜: 2018년 8월 30일.
슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지PSA-P1(Pseudomonas syringae pv. Actinidiae phagePSA-P1),보존번호 CCTCC NO : M 2020252, 보존기구: 중국전형배양물보존센터, 보존 날짜: 2020년 6월 30일.
랄스토니아 솔라나세아룸 파지GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3),보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 주소: 후베이성 우한시 우창 뤄가산 우한대학, 우편번호 430072; 보존 날짜: 2016년 11월 10일; 보존번호 CCCCC NO: M2016635.
산토모나스 악소노포디스 패소바 시트리(Xanthomonas axonopodis pv. citri), 보존번호 ACCC 03526, 보존기구에 문의하여 구입.
산토모나스 악소노포디스 패소바 마니호티스(Xanthomonas axonopodis pv. manihotis), 보존번호 ACCC 03517, 보존기구에 문의하여 구입 가능.
산토모나스 캄페스트리스 패소바 망기페라인디카(Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae), 보존번호 ACCC 11637, 보존기구에 문의하여 구입 가능.
산토모나스 오리재 패소바 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola), 보존번호 ACCC03523，보존기구에 문의하여 구입 가능.
슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아(Pseudomonassyringae pv.Actinidiae), 보존번호 ATCC BAA-2502, 보존기구에 문의하여 구입 가능.
랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 보존번호 ATCC11696D-5, 보존기구에 문의하여 구입 가능.
다음 실시예에서,
TSB 액체 배지 배합: 트립톤 15g, 대두 펩톤 5g, 염화나트륨 5g, 증류수 1000mL; TSA 고체 배지 배합: 트립톤 15g, 대두 펩톤 5g, 염화나트륨 5g, 한천 15g, 증류수 1000mL;
TSA 플레이트: TSA 고체 배지를 멸균처리한 후 멸균 플레이트에 붓고 냉각 및 응고하여 TSA 플레이트 제작; TSB 반고체 한천 배지 배합: 트립톤 15g, 대두 펩톤 5g, 염화나트륨 5g, 한천 7g, 증류수 1000mL;
SM액 배합: 염화나트륨 5.8g, 황산 마그네슘 2g, 1mol/L Tris-HCl 50mL, 젤라틴 0.25g, 증류수 1000mL.
실시예1: 산토모나스 파지 GJ19P1의 분리 제조 및 정제 배양
본 발명에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 소스 샘플은 강소성 난징시 장닝구 하수에서 채취하여 이중층 여과지로 여과 및 상온에서 저속 원심분리한 후, 0.22μm 여과막을 사용하여 상청액을 여과하였다.
파지의 분리：
(1) 여과후 상층액을 10ml 취하여 10ml의 2배 TSB 액체 배지에 넣는 동시에 1ml의 파지 숙주균 GJ19 대수기 균액을 넣고 28℃에서 밤새 배양한다.
(2) 상술한 배양물을 채취한 다음 8000rpm 여건에서 10분간 원심분리한 후 0.22 m의 여과막으로 상층액을 여과하여 비치해 둔다;
(3) 파지 숙주균 산토모나스 악소노포디스균 GJ19의 대수기 균액 0.5mL를 취한 후, 40℃의 TSB 반고체 한천 배지 5mL를 넣어 균일하게 섞어서 TSA 플레이트 상에 부어 숙주균을 함유하는 이중층 플레이트를 제작한다;
(4) 비치해 둔 상층액 10 μL를 취하여 응고된 이중층 플레이트에 떨어뜨려 무균 여건에서 풍건시킨 후, 28°C에서 밤새 배양하여 파지 플라크를 형성한다.
파지의 정제：
(1) 요지로 파지 플라크를 골라내어 1mL의 SM용액에 넣고 1분간 진탕한다.
(2) 10배의 구배 희석 후, 102, 104 및 106의 희석액을 취하여 각각 파지 숙주균 대수기 균액 0.5mL를 추가한 후 충분히 섞어준다.
(3) 15분간 방치한 후, 상기 혼합액을 45℃의 TSB 반고체 한천배지 5mL에 넣어 균일하게 혼합해 준 후 즉시 TSA플레이트 위에 붓고 균일하게 흔들어 주어 5분간 평평하게 방치하여 대기하며, 고형화 후, 28°C의 인큐베이터에 방치하여 밤새 배양 후, 단일 플라크가 생성된 이중층 플레이트를 관찰 및 수득한다.
(4) 플라크 1개를 취하여 1mL의 SM용액에 옮겨 상기 방법과 같이 3회 이상 정제하여 최종적으로 플레이트 상에 동일한 모양과 크기의 플라크를 형성한다;
(5) 요지로 모양과 크기가 같은 단일 플라크를 골라내어, 1mL의 대수기의 숙주균 균액을 포함하는 50mL의 TSB 액체 배지에 넣고, 28°C, 180rpm에서 밤새 흔들면서 배양한다;
(6) 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 0.22μm 여과막으로 여과하여 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)를 얻는다. 그림1을 참조하여 보면, 산포모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 산토모나스 악소노포디스 균태 상에 중심부위가 반투명하고 지름이 6-7mm인 단일 원형 플라크를 생성하였다. 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1), 보존번호 CCTCC M: 2020805.
실시예2: 전자현미경을 이용한 산토모나스 파지 GJ19P1의 관찰
실시예 1에서 제조된 정제 파지액 시료를 전자현미경 관찰용으로 20μL를 취하여 동메쉬 위에 떨어뜨려 15분간 자연침전시킨 후, 여과지를 사용하여 측면에서 잔여액을 흡수해 준 후, 2% 인텅스텐산 1방울을 동메쉬에 떨어뜨려 10분간 염색해 주고 여과지를 사용하여 측면에서 염색액을 흡수하여 건조시킨 후 전자현미경을 통해 관찰을 한다.
도 2에 표시된 바와 같이, 전자현미경을 통해 파지 지름이 약 60 nm인 다면체 입체대칭 헤드 및 짧고 협착된 꼬리의 형태를 가진 산토모나스 파지 GJ19P1이 관찰되었다. 해당 파지는 짧은 꼬리가 달린 자기 복제형 박테리오파지과(Autographiviridae)에 속한다.
실시예 3: 산토모나스 파지 GJ19P1 과립의 제조, 게놈의 추출 및 시퀀싱
실시예 1을 통해 제조한 정제 파지 용액 100mL를 취하여, 농도가 5mg/mL인 DNaseI 20μL 및 RNaseA 20μL를 넣어, 37℃ 여건에서 60분간 배양한 후 NaCl 5.84g을 넣고 용해시켜 얼음 수조에 1시간 방치한다;
(1) 4°C 온도에서 11000rpm으로 10분간 원심분리해 준 후, 분리된 상층액을 새 원심분리 튜브로 옮긴 후 고체 PEG8000을 최종 농도 10%(w/v)가 되도록 첨가하여 PEG8000이 완전 용해된 후 얼음 수조에 1시간 방치한다;
(2) 다시 4°C온도에서 11000rpm으로 20분간 원심분리해 준 후, 1mL의 SM 용액을 첨가하여 침전물을 재현탁해 주면 파지 과립 농축액을 수득하며, 나중에 사용을 위해 4°C에서 보관한다.
λ파지 게놈 DNA 키트를 사용하여 파지 핵산을 추출하고 시퀀싱한다. 뉴클레오티드 서열 분석을 통해 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage PSA-P1)은 SEQ ID No.1에 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖고 있음을 알 수 있다.
실시예4: 산토모나스 파지 GJ19P1 역가의 측정
SM 액을 희석제로 사용하여 산토모나스 파지 GJ19P1(실시예 1을 통해 제조) 원액을 10배 구배로 108배까지 단계적으로 희석한다. 희석도가 105, 106, 107 및 108인 파지 배양액을 각각 1,000μL씩 취하여 300μL의 숙주세균용액과 균일하게 혼합하여 15분간 방치해 주어 박테리아 표면의 수용체와 충분히 결합시킨다. 상기 혼합물을 50℃로 냉각된 4mL의 반고체 한천 배지에 첨가하여, 균일하게 혼합한 후 즉시 이미 응고된 고체 한천 플레이트 상에 펴주어, 한천이 응고된 후 28℃에서 6-8시간 동안 도치시켜 배양한다. 희석도별로 3개의 병렬 샘플이 필요하며, 계수 시, 상기 희석도별로 3개 병렬 샘플의 평균을 취한다. 이 중, 파지 역가(PFU/mL) = 평균 플라크 수 × 희석배수
표 1로부터 산토모나스 파지 GJ19P1은 12시간 배양 후 역가가 1010 PFU/mL 이상임을 알 수 있다.
12시간 배양한 산토모나스 파지 GJ19P1 역가의 측정
배양시간 4h 8h 12h
파지 GJ19P1 역가 (PFU/mL) 5.2x109 2.8x1010 4.6x1010
실시예 5 : 산토모나스 파지 GJ19P1의 독성 유전자 또는 불량 유전자 결실 검출 실험
본 실시예를 통해 병원성 세균내부 용원성 파지에서 유래된 것으로 확인된 독성 유전자 103종을 선별하여(표 2 참조), 산토모나스 파지
GJ19P1의 전체 게놈을 측정하고 이에 대한 생물정보학 분석을 수행하여 상기 독성 유전자를 포함하고 있는지를 확인하였다. 결과에 보면, 산토모나스 파지 GJ19P1은 다음과 같은 독성 유전자 또는 불량 유전자를 포함하지 않아 잠재적인 건강 위험을 유발할 수 있는 단백질을 인코딩할 수 없기에, 산토모나스 파지 GJ19P1은 인간이나 동물의 건강에 영향 주지 않는다.
병원성 세균내부 용원성 파지의 알려진 주요 독성 유전자
유전자원 독성 유전자
Staphylococcus aureus Alpha toxin (alpha lysin), Beta-lysin (beta toxin); Gamma lysin (Gamma toxin); Enterotoxins (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). Pyrogenic exotoxins A B;
Toxic shock syndrome (TSST-1); PVL (Panton-Valentine leukocidin);
Panton-Valentine leukocidin chain S precursor phospholipase C beta-toxin ; gamma-hemolysin component B; gamma-hemolysin chain II precursor toxic shock syndrome toxin-1
Staphylococcus aureus RF122 leukotoxin D subunit; leukotoxin E subunit
Staphylococcus aureus subsp.
Aureus MW2		 alpha-hemolysin
Clostridium botulism Neurotoxins (A to G); lysin; C2 toxin
Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 and 2 (SLT-1 and 2 or Stx-1 and 2)
Escherichia coli type III cytolethal distending toxin protein CdtA; cytolethal distending toxin type IV subunit A ;
hemolysin A
Escherichia coli O111:H- str.
11128		 Shiga toxin 2 subunit A; Shiga toxin 2 subunit B
대장균 APEC O1 cytolethal distending toxin type IV subunit C
Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A; Proteases, Leukocidin; exotoxin A precursor; alkaline protease
Bacillus pertussis Pertussis toxine (AB5-type Exotoxin); bifunctional
hemolysin-adenylate cyclase precursor
Bacillus Anthrax Toxin (Edema factor and Lethal factor)
Helicobacter Pylori VacA toxin
Cyanobacteria Hepatotoxin and neurotoxin
Corynebacterium diphteriae Diphtheria toxin
Clostridium tetani Tetanus toxin; Tetanus toxin tetX; Tetanolysin O
Proteus mirabilis Neurotoxin
Bacillus Cereus Cereolysin; Enterotoxin; Alveolysin
Shigella dysenteriae Shigella toxin (Shiga toxin); Shiga toxin subunit A
Clostridium difficile Toxin A; Toxin B; Toxin B - cytotoxin
Legionella pneumophila Cytolysin
Vibrio Cholera Cholera toxin
Vibrio cholerae O395 zona occludens toxin
Vibrio cholerae RC385 conserved hypothetical protein - toxin
Streptococcus pyogens Streptolysin S; Erythrogenic toxin
Corynephage omega diphtheria toxin
Corynephage beta diphtheria toxin
C oryneb acterium ulcerans diphtheria toxin
Pseudomonas phage phiCTX Cytotoxin
Shigella dysenteriae Sd197 Shiga toxin subunit B precursor
Clostridium botulinum C2 toxin, component I; C2 toxin, component
II;BoNT/G; BoNT/F
Clostridium botulinum B1 botulinum neurotoxin type B
Clostridium phage c-st botulinum neurotoxin type C1 precursor
Clostridium botulinum E3 botulinum neurotoxin type E3, BoNT/E3
Clostridium botulinum F botulinum neurotoxin type A1
Clostridium phage d-16 phi type D neurotoxin
Clostridium botulinum D str.
1873 		tetanolysin O
Proteus mirabilis HI4320 Toxin
Proteus mirabilis ATCC 29906 Toxin;toxin
Staphylococcus phage PVL LukF-PV
Yersiniapestis CA88-4125 Toxin
Brevibacillus laterosporus Isp2b protein
weihenstephanensis Delta endotoxin central region subgroup 1
Bacillus thuringiensis Pesticidal crystal protein cry1Bc
Clostridium novyi NT phospholipase C precursor (PLC)
Clostridium novyi alpha-toxin
Clostridium perfringens ATCC13124 perfringolysin O
Clostridium perfringens SM101 phospholipase C
Clostridium perfringens str. 13 Collagenase
Clostridium perfringens Enterotoxin ; delta toxin
Clostridium perfringens B str.
ATCC 3626		 beta-toxin epsilon-toxin
Clostridium septicum alpha-toxin
Clostridium sordellii phospholipase C
Listeria monocytogenesClip81459 listeriolysin O precursor
Streptococcus pneumoniaeTIGR4 Pneumolysin
Bacillus anthracis hypothetical protein pxo1_122 edema factor
Bacillus anthracis str. A2012 lethal factor
Bordetella pertussis Tohama I Putative toxin; toxin subunit 2; toxin subunit 3
Prophage CP-933V shiga-like toxin 1 subunit A encoded within prophage
CP-933V; shiga-like toxin 1 subunit B encoded
within prophage CP-933V
Vibrio mimicus VM573 heat-labile hemolysin
Aeromonas hydrophila subsp. Hydrophila ATCC 7966 Hemolysin
Streptococcus pyogenes
MGAS10394		 streptolysin O
Streptococcus pyogenes mitogenic exotoxin Z precursor
Streptococcus pyogenes phage
5005.1		 enterotoxin type A
Streptococcus pyogenes
MGAS6180		 exotoxin type J precursor
Streptococcus phage 370.3 streptococcal exotoxin H precursor
Streptococcus pyogenes M1 GAS exotoxin G precursor
Streptococcus equisimilis
GGS_124		 putative exfoliative toxin
Yersinia enterocolitica heat-stable enterotoxin; heat-stable enterotoxin type B
실시예 6: 독성실험
수컷과 암컷 각각 반으로 구성된 실험용 쥐 20 마리를 3일간 적응성 사육한 후 무작위로 2개 군(파지군과 대조군), 각군 당 10마리(수컷 5 마리, 암컷 5 마리)로 나뉘어, 파지군에 1010 pfu/kg을 계량단위로 하는 산토모나스 파지 GJ19P1을 투여하고, 대조군은 동일한 양의 생리 식염수를 투여하여, 이와 같은 실험을 연속 15일간 진행한 후, 쥐의 목을 잘라 생명을 중지시켜, 체내 장기 상황을 검사하였다.
실험 결과를 보면, 이와 같은 투여량의 산토모나스 파지 GJ19P1은 쥐의 일상 행동에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 체내 장기에 대한 해부학적 검사에서 이상이 발견되지 않았다. 산토모나스 파지 GJ19P1은 생물학적 안전성을 가지며, 작물 질병 방제용 제제로 사용될 수 있다.
실시예7: 산토모나스 파지 GJ19P1가 산토모나스 악소노포디스균에 대한 최적 감염 다중도(MOI)의 측정
숙주균 산토모나스 악소노포디스균 GJ19 단일 균락을 선정하여, 3mL의 TSB 액체 배양 배지를 넣은 시험관에 접종하여, 온도가 28℃인 진탕기에서 180 rpm로 밤새 진탕 배양하여 숙주균 현탁액을 얻는다. 숙주균 현탁액을 1:100의 비율로 10mL의 TSB 액체 배지에 옮기고, 28℃의 온도 및 180rpm의 회전 속도에서 대수 초기단계까지 진탕 배양한다. MOI가 각각 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0.0001, 0.00001, 0.000001, 0.0000001의 비율이 되도록 파지 GJ19P1 정제 용액(실시예 1을 통해 제조) 및 파지 숙주균(MOI=정제 파지 용액 역가/파지 숙주균 농도)을 첨가한 후, 각 튜브의 총 부피가 동일하도록 TSB 액체 배지를 추가한다. 28°C 진탕기에서 160rpm의 회전속도로 12시간 동안 진탕 배양한다. 배양 완료 후 10000g에서 10분간 원심분리하여 상청액을 채취 및 이중층 평판법을 적용하여 처리된 파지별 역가를 측정한다. 각 포인트별로 시험관 2개로 나누어 중복 배양한 후 평균치를 취하여, 최고 파지 역가를 생성한 MOI를 최적 감염 다중도로 한다. 실험은 세 번 반복 진행한다.
감염 다중도별 산토모나스 파지 GJ19P1의 역가
MOI GJ19P1 (PFU/mL) 숙주균 (cfu/mL) GJ19P1 역가 (PFU/mL)
100 107 105 1.3x108
10 107 106 2.4x108
1 107 107 5.7x108
0.1 107 108 2.5x109
0.01 107 109 6.9x109
0.001 107 1010 8.3x109
0.0001 106 1010 3.5x1010
0.00001 105 1010 3.0x1010
0.000001 104 1010 2.4x1010
0.0000001 103 1010 1.5x1010
표 3의 결과를 보면, 12시간 배양한 여건에서 파지 GJ19P1 역가가 최고값 3.5×1010 PFU/mL에 도달했을 때 MOI=0.0001임을 알 수 있다. 이로부터, 소량의 초기 산토모나스 파지 GJ19P1만으로도 다량 증식이 완성됨을 알 수 있다. 산토모나스 파지 GJ19P1은 파지 살균제의 산업 생산을 위해 고품질의 파지 균주 공급원을 제공한다.
실시예 8: 산토모나스 파지 GJ19P1의 pH값 및 온도 안정성의 측정
8-1: pH 별 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
멸균 EP 튜브를 취하여 pH=1~14의 TSB 액체 배지 900μL를 첨가하고, 상기 EP 튜브를 25℃ 항온수조에 방치하여, 온도가 평형을 이룬 후 초기 역가가 1×1010 PFU/mL이 되도록 정제된 파지 용액(실시예 7을 통해 제조) 100μL를 첨가하여, 상온에 방치해 둔다. 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 및 96시간 반응한 후 각각 대응되게 샘플을 채취하여 처리된 각 샘플을 적절히 희석한 후 이중층 평판법을 적용하여 파지 역가를 측정한다. 실험은 세 번 반복 진행한다.
pH값별 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
pH 값 시간 (h)
파지 역가
（PFU/mL）		 1 h 4 h 8 h 24 h 96 h
1.0 3.0x107 5.1x104 34 0 0
2.0 6.6x109 4.2x109 3.3x108 7.6x106 1.1x106
3.0 7.6x109 5.2x109 6.3x108 9.8x106 6.4x106
4.0 8.6x109 5.4x109 5.3x109 7.7x108 5.4x108
5.0 8.1x109 7.4x109 6.9x109 6.4x109 5.2x109
6.0 9.2x109 8.9x109 9.7x109 9.4x109 9.2x109
7.0 9.7x109 9.7x109 9.7x109 9.3x109 9.3x109
8.0 9.6x109 9.3x109 9.2x109 9.2x109 9.3x109
9.0 9.2x109 7.8x109 6.8x109 5.6x109 3.2x109
10.0 9.2x109 7.8x109 6.4x109 4.8x109 2.7x109
11.0 3.8x109 5.4x108 2.3x108 8.9x107 2.9x107
12.0 2.7x109 4.2x108 6.3x107 6.3x106 1.8x106
13.0 0 0 0 0 0
14.0 0 0 0 0 0
표 4에 표시된 결과를 보면, pH=2~10 범위내에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 역가는 크게 변하지 않았으며, 이를 통해 중성, 약산성 및 약알칼리성 여건에서 비교적 좋은 안정성을 나타냄을 알 수 있다.
pH=2의 산성 여건에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 역가가 어느 정도 감소하였으나, pH=7인 경우에 비해 역가가 약 3개 자릿수 감소하여 산성 여건에서 비교적 좋은 내성을 갖고 있음을 알 수 있다.
8-2: 온도별 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
1.0 x 107 PFU/mL의 역가를 갖는 산토모나스 파지 GJ19P1(실시예 7을 통해 제조)을 4℃, 25℃ 및 40℃ 여건에 방치하여, 주기적으로 샘플을 취하여 역가를 측정한다.
4℃ 여건에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
파지 파지 역가 (PFU/mL)
0M 3M 6M 9M 12M
GJ19P1 1.0X107 9.3x106 8.6x106 8.0x106 7.8x106
25℃ 여건에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
파지 파지 역가 (PFU/mL)
0W 1w 2w 3w 4w
GJ19P1 1.0x107 8.0x106 6.6x106 5.2x106 4.9x106
40℃ 여건에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
파지 파지 역가 (PFU/mL)
0 h 24h 48h 72h
GJ19P1 1.0x107 7.1x106 4.2x106 2.3x106
표 5~표 7에 표시된 결과로부터, 산토모나스 파지 GJ19P1은 4℃에서 비교적 좋은 안정성을 가짐을 알 수 있으며, 3개월 보관한 후, 역가는 크게 감소하지 않았으며, 12개월 보관한 후에도 역가 감소가 1개 자릿수를 초과하지 않았음을 알 수 있으며; 25°C에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 역가는 보관 4주 후 유의하게 감소하지 않았으며; 40°C에서 파지 GJ19P1의 역가는 24시간 내로 유의하게 감소하지 않았으며, 72시간 후, 역가가 1개 자릿수 감소한 것으로 나타났다. 이로부터, 상이한 온도 여건에서 산토모나스 파지 GJ19P1은 전부 비교적 좋은 안정성 나타냄을 알 수 있다.
실시예 9: 산토모나스 파지 GJ19P1이 자외선에 대한 내성 측정
1×108PFU/mL의 역가를 갖는 산토모나스 악소노포디스 파지 GJ19P1(실시예 7에서 제조) 10mL를 취하여 90mm의 멸균 페트리 접시에 펴 발라준 후, 초청정 작업대에 방치하여 자외선 램프(20w, 20 cm)로 조사한다. 0분, 20분, 40분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간 당 샘플을 채취하여 암실에서 30분간 방치한 후 이중층 평판법을 사용하여 파지 역가를 측정하였다.
자외선 조사 여건에서 산토모나스 파지 GJ19P1의 안정성
시간 0min 20min 40min 1h 2h 3h
파지 GJ19P1
역가 (PFU/mL)		 1x108 9.9x108 9.7x107 9.1X107 9.0x107 8.6x107
시간 4h 5h 6h 7h 8h /
파지 GJ19P1
역가 (PFU/mL)		 7.2x107 5.9x107 2.1x107 8.5x106 3.9x106 /
표 8에 표시된 결과를 보면, 8시간 동안 자외선을 조사한 후, 산토모나스 악소노포디스 파지 GJ19P1의 역가는 2개 자릿수 감소한 것으로 타나났으며, 이로부터 본 발명의 파지는 자외선에 대해 비교적 강한 내성을 나타내고 있음을 알 수 있다.
실시예10: 산토모나스 파지 GJ19P1 용해 스펙트럼의 측정
이중층 평판 점적법을 사용하여 파지의 용해 스펙트럼을 측정한다. 9종의 상이한 산토모나스 병원성 변종 균주 총 184개를 선별한다. 시험용 균주의 단일 균락을 선별하여 TSB 액체 배지 3mL를 넣어 둔 시험관에 접종하여 28°C, 180rpm 여건에서 밤새 배양하여 각 균주별 균액을 제조한다. 세균 현탁액 500μL를 취하여 각각 TSB 반고체 한천 배지와 혼합한 후, 일반 한천 평판 위에 펴고 정제된 파지 GJ19P1 용액(실시예 7을 통해 제조) 5μL를 취하여 평판 위에 떨어뜨린 후, 자연 통풍 여건에서 건조시켜, 28°C에서 밤새 배양한 후 결과를 관찰한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 용해 스펙트럼 실험
산토모나스 병원성 변종 산토모나스균 번호 파지 GJ19P1
산토모나스 악소노포디스 패소바 시트리(Xanthomonas axonopodis pv. citri) Xac2 ++
Xac3 +++
Xac5 ++
Xac8 ++
Xac10 ++
Xac11 ++
Xac15 ++
Xac16 +++
Xac18 +++
Xac19 +++
Xac22 +++
Xac23 +++
Xac36 +++
Xac39 ++
Xac41 +++
Xac45 +++
Xac49 ++
Xac55 ++
Xac59 ++
Xac61 +
산토모나스 악소노포디스 패소바 마니호티스(Xanthomonas axonopodispy.manihotis) Xam6 +
Xam7 ++
Xam8 ++
Xam19 +++
Xam21 -
Xam52 +
Xam53 +++
Xam59 -
Xam63 ++
Xam65 ++
Xam66 +
Xam72 +
Xam78 ++
Xam80 ++
Xam89 ++
Xam95 ++
Xam96 ++
Xam99 +
Xam101 ++
Xam103 +
Xam109 ++
Xam110 +
산토모나스 악소노포디스 패소바 베틀리콜라(Xanthomonas axonopodis pvbetlicola) Xab24 ++
Xab25 -
Xab26 +
Xab28 +++
Xab31 ++
Xab33 ++
Xab35 +++
Xab40 -
Xab41 +++
Xab57 +
Xab59 ++
Xab62 ++
Xab71 +
Xab73 ++
Xab78 +++
Xab80 +
Xab81 +
Xab85 ++
Xab90 ++
Xab92 +++
산토모나스 악소노포디스 패소바 맹기페라인디카
(Xanthomonasaxonopodispv. mangiferaeindicae) 		Xama20 ++
Xama26 ++
Xama27 ++
Xama30 ++
Xama32 ++
Xama33 ++
Xama35 ++
Xama37 +
Xama40 +++
Xama42 +++
Xama43 ++
Xama45 -
Xama49 ++
Xama52 +++
Xama53 +++
Xama57 +
Xama60 +++
Xama63 +
Xama64 +
Xama67 +
Xama69 ++
산토모나스 악소노포디스 패소바 바스큘럼 (Xanthomonasaxonopodis pv. vasculorum) Xav28 ++
Xav29 +++
Xav30 +++
Xav31 ++
Xav35 ++
Xav36 +++
Xav37 ++
Xav42 ++
Xav44 +
Xav46 +
Xav49 +++
Xav50 +++
Xav53 +++
Xav80 +
Xav85 ++
Xav90 +++
Xav95 +++
Xav102 ++
Xav112 +++
Xav115 +++
산토모나스 캄페스트리스 패소바 망기페라인디카
(Xanthomonascampestris pv.mangiferaeindicae) 		Xcm31 ++
Xcm32 +
Xcm33 -
Xcm34 ++
Xcm45 +++
Xcm50 ++
Xcm51 +
Xcm52 +
Xcm53 +
Xcm56 ++
Xcm60 -
Xcm64 ++
Xcm65 ++
Xcm70 -
Xcm71 +++
Xcm72 +++
Xcm78 +
Xcm79 +
Xcm82 +
Xcm83 ++
산토모나스 캄프스트리스 패소바 무사체룸
(Xanthomonascampestris pvmusacearum) 		Xcmc5 +++
Xcmc6 ++
Xcmc8 ++
Xcmc9 ++
Xcmc13 +++
Xcmc15 +++
Xcmc22 ++
Xcmc24 ++
Xcmc35 +++
Xcmc37 -
Xcmc40 ++
Xcmc42 ++
Xcmc43 ++
Xcmc44 +
Xcmc45 +
Xcmc50 +
Xcmc54 +
Xcmc56 ++
Xcmc57 ++
Xcmc58 ++
Xcmc59 +++
산토모나스 오리재 패소바 오리재
(Xanthomonasoryzaepvoryzae )		 Xoozl +++
Xooz2 ++
Xooz5 ++
Xooz7 ++
Xooz9 +++
Xooz10 -
Xooz13 ++
Xooz15 +++
Xooz16 +
Xooz18 +++
Xooz19 +
Xooz21 -
Xooz23 ++
Xooz25 ++
Xooz26 +
Xooz27 ++
Xooz29 +
Xooz31 -
Xooz35 ++
Xooz36 ++
산토모나스 오리재 패소바 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) Xooc9 +++
Xooc10 +
Xooc13 +++
Xooc15 ++
Xooc17 ++
Xooc19 -
Xooc23 +
Xooc24 +
Xooc26 +
Xooc28 ++
Xooc29 ++
Xooc30 +
Xooc33 +++
Xooc35 +++
Xooc37 ++
Xooc39 +
Xooc40 ++
Xooc41 +++
Xooc42 -
Xooc43 -
주: "+++"는 완전투명, "++”는 중간투명, "+"는 약간 투명, "-"는 불용해를 나타냄.
표9에 표시된 바와 같이, 파지 GJ19P1은 9종의 상이한 산토모나스 병원성 변종 균주 184개에 대해 비교적 강한 용해력을 가지며, 상응한 용해율은 91.8%에 달할 수 있으며; 단일 산토모나스 병원성 변종의 용해력은 전부 85%이상에 달한다. 파지 GJ19P1은 비교적 넓은 폭의 용해 스펙트럼을 가진다.
실시예 11: 비병원성 유익균에 대한 산토모나스 파지 GJ19P1의 용해성 시험
비병원성 근류균 균주 5개,비병원성 고초균 균주 5개를 각각 3mL의 TSB 액체 배지가 들어 있는 시험관에 접종하고, 37℃, 180rpm 여건에서 8시간 동안 배양하여 각 균주별 균액을 준비해 둔다. 300μL의 세균 현탁액을 취하여 TSB 반고체 한천 배지와 혼합하여 일반 한천 플레이트 위에 펴바른다. 정제된 파지 GJ19P1 용액(실시예 7을 통해 제조) 5 μL를 각각 취해 플레이트 위에 떨어뜨리고 자연 통풍 여건에서 건조시켜 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 결과를 관찰한다.
비병원성 유익균에 대한 산토모나스 파지 GJ19P1의 용해시험
균주유형 균주코드 파지 GJ19P1
근류균 GL-11 -
GL-12 -
GL-13 -
GL-14 -
GL-15 -
고초균 KC-11 -
KC-12 -
KC-13 -
KC-14 -
KC-15 -
주: "+++"는 완전투명, "++"는 중간투명, "+"는 약간 투명, "-"는 불용해를 나타냄.
표 10에 표시된 결과를 보면, 본 실시예에서 파지 GJ19P1은 상기 10개의 비병원성 박테리아 균주를 인식하지 못한 것으로 나타났다. 이를 통해 실험용 파지는 숙주 특이성이 강하고 미생물 군락에 손상 주지 않음을 알 수 있다.
실시예12: 산토모나스 파지 GJ19P1의 액체내 살균 효과
산토모나스 악소노포디스 GJ19을 대수 성장기까지 배양하고, 이를 여러 시험관에 나누어 넣은 후, 같은 부피의 TSB 액체 배지를 사용하여 산토모나스 악소노포디스 GJ19의 최종 농도가 5×103cfu/mL가 될 때까지 세균액을 희석한다. 최종 농도가 각각 2×102PFU/mL, 2×103PFU/mL, 2×104PFU/mL, 2×105PFU/mL, 2×106PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)(시예 7에서 제조됨)을 세균액에 접종한다. 동시에, 대조군과 공백군을 설정하여, 대조군은 최종 농도가 1x103 cfu/mL인 산토모나스 파지 GJ19P1을 투여하고; 공백군은 동일 양의 생리 식염수를 투여한다. 상기 세균액을 28℃에서 150rpm 회전속도로 진탕 배양하여, 4시간 후에 산토모나스 악소노포디스균의 잔류량을 측정한다. 측정 방법: 각 처리된 샘플을 멸균수로 희석한 후, 희석액 100μL를 취하여 TSA 고체 평판 위에 도포하고, 28℃에서 24시간 배양한 후 평판 상의 균락수를 통계한다. 산토모나스 악소노포디스균 수 = TSA 플레이트 상의 균락수 × 희석배수 × 10.
농도별 산토모나스 파지 GJ19P1의 액체내 살균 효과
시간
(h)		 산토모나스 GJ19P1 최종 농도(cfu/mL)
2×102
PFU /mL 파지 GJ19P1		 2×103
PFU /mL 파지 GJ19P1		 2×104
PFU /mL 파지 GJ19P1		 2×105
PFU /mL 파지 GJ19P1		 2x106
PFU/mL
파지
GJ19P1		 대조군 CK
0h 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103
2h 4.2x102 3.8x102 3.2x102 1.8X102 1.2x102 2.1X105 5x103
4h 2.2x102 1.3x102 90 70 50 3.3x107 5x103
표 11로부터 산토모나스 파지 GJ19P1의 최종 농도가 1×102 PFU/mL인 경우, 산토모나스 악소노포디스균 GJ19P1이 액체 배지 여건에서의 생장을 충분히 제어할 수 있으며; 산토모나스 파지 GJ19P1의 최종 농도 ≥1×103PFU/mL의 경우, 산토모나스 악소노포디스균에 대한 사멸률이 97% 이상에 도달할 수 있음을 알 수 있다.
실시예13: 산토모나스 파지 GJ19P1 조합물의 제조
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1（Xanthomonas phage GJ19P1）및 산토모나스 악소노포디스 파지 YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)의 원액을 1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 Sm액에 균일하게 혼합하여, 배합비가 1:1인 조합물(조합물1)을 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1) 및 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phagePSA-P1)의 원액을 1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여, 배합비가 1:1인 조합물(조합물2)를 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1) 및 랄스토니아 솔라나세아룸 파지GP3（Ralstonia solanacearum phageGP3)의 원액을 1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여, 배합비가 1:1인 조합물(조합물3)를 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1), 산토모나스 악소노포디스 파지 YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5）및 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1(Pseudomonas syringae pv. Actinidiae phage PSA-P1)의 원액을 1:1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여 조합물(조합물4)를 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1), 산토모나스 악소노포디스 파지YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5）및 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)의 원액을 1:1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여 조합물(조합물5)를 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1), 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1(Pseudomonas syringae pv. Actinidiae phagePSA-P1) 및 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3(Ralstonia solanacearum phageGP3)의 원액을 1:1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여 조합물(조합물6)를 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1), 산토모나스 악소노포디스 파지 YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5), 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1(Pseudomonas syringae pv. Actinidiae phag e PSA-P1) 및 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3（Ralstonia solanacearum phage GP3)의 원액을 1:1:1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여 조합물(조합물7)를 조제한다.
역가가 2x109PFU/mL인 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1) 및 최종농도가 50%인 700배 아모밤액을 1:1의 균등한 부피로 각각 취하여 균일하게 혼합하여 조합물(조합물8)를 조제한다.
실시예 14 : 산토모나스 파지 GJ19P1 조합물의 액체내 살균 효과
산토모나스 악소노포디스균을 대수 성장기까지 배양하여 상이한 시험관에 나누고 넣고, 산토모나스 악소노포디스균 GJ19의 최종 농도가 5×103cfu/mL로 될 때까지 동일한 부피의 TSB 액체 배지로 세균액을 희석하며, 실시예 15에서 제조한 산토모나스 파지 GJ19P1 조합물을 각각 접종하는 동시에, 대조군과 공백군을 설정하며, 대조군에 최종 농도가 5×103cfu/mL인 산토모나스 악소노포디스균 GJ19을 투여하고; 공백군에 같은 양의 생리 식염수를 투여한다. 각 시료를 28℃에서 150rpm으로 진탕 배양하여 4시간 후 산토모나스 악소노포디스균 GJ19의 잔류량을 측정한다. 측정 방법: 처리된 각 시료를 멸균수로 희석한 후, 희석액 100μL를 취하여 TSA 고체평판 위에 도포하여 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 플레이트 상의 균락 수를 통계한다. 산토모나스 악소노포디스균 수 = TSA 플레이트 상의 균락수 × 희석배수 × 10.
농도별 산토모나스 악소노포디스 파지 GJ19P1조합물의 액체내 살균효과
시간 조합
물 1		 조합
물2		 조합
물3		 조합
물 4		 조합
물 5		 조합
물6		 조합
물 7		 조합
물 8		 대조군 공백군
0 h 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103 5x103
2 h 3.2x102 3.7x102 2.9x102 1.8x102 1.2x102 4.8x102 1.3x102 3.3x102 2.4x105 5x103
4 h 1.2x102 1.3x102 1.2x102 87 85 96 58 2.4x102 3.6x107 5x103
표 12로부터 산토모나스 파지 GJ19P1 조합물의 각 성분은 산토모나스 악소노포디스균에 대해 양호한 사멸 효과를 가짐을 알 수 있다. 이와 같은 결과를 통해 산토모나스 파지 GJ19P1은 박테리아 방제에 필요한 다른 물질과 복합 사용할 수 있으며, 다른 물질에 대한 길항 효과가 없음을 알 수 있다.
본 실시예의 조합은 아모밤 700배 용액으로 한정되지 않고, 폴리옥신, 플루모프, 디메토모르프, 프로클로라즈, 디펜코나졸, 플루실라졸, 미클로부타닐, 만코젭, 티오파네이트 메틸, 카벤다짐, 클로로탈로닐, 글리칸 과락 등과 같은 화학 살균제일 수 있다. 본 실시예는 예방 살균 효과를 달성하기 위해 다른 화학 소독제와 복합 사용될 수 있다.
실시예15: 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물이 감귤 궤양병에 대한 방제
최종 농도가 2x104PFU/mL, 2x105PFU/mL, 2x106PFU/mL인 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)을 각각 최종 농도가 50%인 아모밤 700배 용액(화학 살균제)와 같은 부피로 균일하게 혼합하여 1:1의 조합물9, 조합물 10 및 조합물11을 제조한다.
감귤 과수 480그루를 1개월간 적응성 배양한 후 무작위로 8개 군(파지 3군, 조합물 9군~조합물11군, 대조군 및 공백군), 군 당 60그루씩 그룹을 나뉘어, 파지 실험군에 용량단위가 2×104PFU/mL, 2x105 PFU/mL, 2x106 PFU/mL인 시험용 파지(실시예 7을 통해 제조) 및 2x105cfu/mL의 산토모나스 악소노포디스균 GJ19을 투여하며; 조합물 실험군은 각 조합물을 2×105cfu/mL의 산토모나스 악소노포디스균 GJ19을 투여하며; 대조군에는 2x105 cfu/mL의 산토모나스 악소노포디스균 GJ19을 투여하며; 공백군에는 같은 양의 생리식염수를 투여한 후, 줄기주입법을 사용하여 과수 당 1L씩 접종한 후 15일 내로 감귤 궤양병 발병률을 통계하며, 발병률 계산공식은 발병율 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100% 적용.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물이 감귤 궤양병에 대한 영향
시간 2x104
PFU/mL		 2x105
PFU/mL		 2x106
PFU/mL		 조합물9 조합
물10		 조합
물11		 대조군 공백군
1d 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2d 2% 0% 0% 0% 0% 0% 5% 0%
3d 4% 2% 0% 1% 0% 0% 7% 0%
4d 5% 2% 0% 2% 2% 0% 18% 0%
5d 6% 3% 0% 4% 2% 0% 24% 0%
6d 7% 5% 2% 5% 3% 2% 35% 0%
7d 10% 7% 4% 7% 3% 3% 48% 0%
8d 11% 10% 6% 10% 5% 3% 53% 0%
9d 16% 12% 7% 14% 7% 4% 61% 0%
10d 18% 14% 7% 16% 8% 5% 65% 0%
11d 19% 15% 8% 19% 11% 6% 69% 0%
12d 20% 17% 8% 21% 13% 7% 75% 0%
13d 21% 16% 9% 21% 14% 7% 83% 0%
14d 23% 17% 9% 22% 16% 7% 91% 0%
15d 25% 19% 10% 23% 16% 8% 100% 0%
표 13에 표시된 결과를 통해, 대조군을 감귤 과수에 접종하여 15일 후, 감귤 궤양병의 발병률은 100%에 도달했음을 알 수 있다. 파지를 접종한 각 실험군의 경우, 산토모나스 파지 GJ19P1의 농도가 높을수록 감귤 과수의 발병률이 낮았고; 산토모나스 파지 GJ19P1의 농도가 106PFU/mL의 경우, 15일간의 챌린지 후, 감귤 과수의 발병률은 10% 이내를 유지하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해, 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물을 바이오 살균제로 적용하여 감귤 궤양병을 효과적으로 방제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 16: 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물의 키트 제조, 사용
키트는 1×107PFU/mL의 역가를 갖는 5~10mL의 산토모나스 파지 GJ19P1 액체 또는 산토모나스 파지 GJ19P1의 조합물, 1L의 TSB 반고체 배지, 1L의 TSA 배지를 함유한다.
키트를 사용하는 방법은 다음과 같다: 역가가 1 x 107 PFU/mL인 산토모나스 파지 GJ19P1 액체 또는 산토모나스 파지 GJ19P1 조합물을 취하여, 이중층 플레이트 점적법을 사용하여 실험용 파지의 용해 스펙트럼을 측정한다. 측정할 단일 균락을 선정하여 표적 액체 배지에 접종하고, 표적 온도에서 측정 대기 균주의 번식특성와 연결시켜 진탕 배양하여 측정 대기 균주용액을 준비한다. 시험할 세균 현탁액 300 μL를 취하여 각각 5 mL의 TSB 반고체 배지와 혼합하여 TSA 플레이트에 도포하고, 10μL의 산토모나스 파지 GJ19P1액체 또는 산토모나스 파지 GJ19P1의 조합물을 취하여 플레이트 위에 점적해 준다. 자연 풍건 후 측정할 균주의 번식 특성에 따라 표적 온도에서 배양하고 그 결과를 관찰한다.
실시예17: 감귤 궤양병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1의 주성분은 역가가 3 x 108 PFU/mL인 5~10 mL의 산토모나스 파지 GJ19P1 액체이다.
키트 2의 주성분은 역가가 3 x 108 PFU/mL인 5~10 mL의 산토모나스 액소노포디스 파지 YHC5 액체이다.
키트 3의 주성분은 역가가 3 x 108 PFU/mL인 5~10 mL의 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1액체이다.
키트 4의 주성분은 역가가 3 x 108 PFU/mL인 5~10 mL의 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)액체이다.
키트 5의 주성분은 50%의 최종 농도를 갖는 5~10 mL의 아모밤 700배 용액이다.
키트 6의 주성분은 역가가 3×108 PFU/mL인 5~10 mL의 산토모나스 액소노포디스 파지 GJ19P1 액체, 역가가 3×108 PFU/mL인 5~10 mL의 산토모나스 액소노포디스 파지 YHC5 액체, 역가가 3×108 PFU/mL인 5~10 mL의 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1 액체, 역가가 3×108 PFU/mL인 5~10 mL의 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3 액체, 50%의 최종 농도를 갖는 5~10 mL의 아모밤 700배 용액을 포함한다.
시험과정: 1개월간 적응 재배한 감귤 과수 160그루를 무작위로 8개 군(키트 1군~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 20그루씩 배정한다. 줄기주입법을 이용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 산토모나스 악소노포디스 패소바 시트리ACCC 03526 (Xanthomonas axonopodis pv. citri) 을 각각 키트 1군~ 키트 6군 및 양성 대조군으로 나뉘어진 총 140그루의 감귤 과수를 챌린지 처리하며, 20그루의 음성대조군은 줄기주입법으로 생리 식염수 1L를 주입한다. 챌린지 처리를 수행하여 3일 후, 챌린지 처리 된 5개 군의 감귤과수에 대하여 줄기주입법을 사용하여 키트 1군~ 키트 6군의 1000배 희석액을 각각 1L씩 접종하며, 양성 대조군과 음성 대조군에는 전부 같은 양의 식염수를 투여한다. 접종 후부터 15일 내로 감귤 궤양병의 발병률을 통계하며, 계산공식은 발병률 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100%을 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트가 감귤 궤양병에 대한 영향
시간 키트 1군 키트 2군 키트 3군 키트 4군 키트 5군 키트 6군 양성대조군 음성대조군
1DAY 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2DAY 0% 0% 2% 3% 0% 0% 4% 0%
3DAY 4% 3% 7% 7% 5% 3% 7% 0%
4DAY 6% 3% 9% 8% 8% 3% 10% 0%
5DAY 6% 5% 12% 12% 11% 3% 12% 0%
6DAY 6% 5% 13% 13% 12% 3% 17% 0%
7DAY 6% 5% 17% 16% 15% 6% 20% 0%
8DAY 6% 5% 19% 18% 18% 6% 22% 0%
9DAY 6% 5% 21% 20% 18% 6% 27% 0%
10DAY 7% 7% 31% 32% 20% 6% 35% 0%
11DAY 9% 11% 35% 37% 26% 6% 43% 0%
12DAY 13% 13% 48% 50% 37% 7% 56% 0%
13DAY 15% 16% 65% 66% 40% 10% 72% 1%
14DAY 17% 17% 76% 79% 46% 12% 81% 1%
15DAY 17% 18% 79% 82% 47% 12% 83% 1%
표 14에 표시된 결과를 보면, 키트 6군의 감귤궤양병 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트 6은 감귤 궤양병에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6의 감귤궤양병에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예18: 벼의 세균성줄무늬반점병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1~키트 6는 전부 실시예 17에 기재된 키트를 적용한다.
시험 과정: 벼 160포기를 1개월간 적응 배양한 후, 무작위로 8개 군(키트 1군~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 20포기씩 배정한다. 뿌리 관개법을 사용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 산토모나스 오리재 패소바 오리지콜라 ACCC03523(Xanthomonas oryzaes pv. oryzicola)를 사용하여 키트 1군~키트 6군 및 양성대조군의 총 140포기의 벼를 챌린지 처리하며, 음성대조군의 벼 20포기 뿌리에 각각 생리식염수 1L를 관개한다. 챌린지 처리 3일 후, 뿌리관개법을 사용하여 키트 1~키트 6의 1000배 희석액을 각각 1L씩 접종하였고, 양성 대조군과 음성 대조군 모두에 같은 양의 식염수를 투여한다. 접종 후부터 15일 내로 벼의 세균성줄무늬반점병의 발병률을 통계하며, 계산공식은 발병률 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100%을 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 시트가 벼의 세균성줄무늬반점병에 대한 영향
시간 키트 1군 키트 2군 키트 3군 키트 4군 키트 5군 키트 6군 양성대조군 음성대조군
1DAY 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2DAY 1% 0% 3% 3% 3% 0% 4% 0%
3DAY 3% 2% 6% 7% 6% 2% 6% 0%
4DAY 4% 4% 8% 9% 8% 4% 9% 0%
5DAY 5% 6% 11% 12% 11% 4% 12% 0%
6DAY 7% 7% 12% 13% 12% 5% 12% 0%
7DAY 9% 7% 15% 14% 15% 7% 16% 0%
8DAY 10% 8% 18% 15% 18% 8% 21% 0%
9DAY 12% 16% 20% 16% 20% 12% 26% 0%
10DAY 14% 18% 24% 20% 22% 13% 31% 0%
11DAY 15% 20% 28% 24% 24% 14% 35% 0%
12DAY 16% 24% 36% 27% 26% 14% 46% 0%
13DAY 17% 25% 45% 66% 35% 14% 54% 1%
14DAY 20% 28% 56% 70% 41% 14% 77% 1%
15DAY 20% 30% 69% 74% 52% 14% 80% 1%
표 15에 표시된 결과를 보면, 키트 6군의 벼포기 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트6은 벼의 세균성줄무늬반점병에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6이 벼의 발병률에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예19: 카사바 세균성 시들음병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1~키트 6는 전부 실시예 17에 기재된 키트를 적용한다.
시험 과정: 카사바 160그루를 1개월간 적응 배양한 후, 무작위로 8개 군(키트 1군~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 카사바 20그루로 나뉜다 뿌리 관개법을 사용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 산토모나스 악소노포디스 패소바 마니호티스ACCC 03517(Xanthomonas axonopodis pv. manihotis)를 사용하여 키트 1군~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군의 총 140그루의 카사바를 챌린지 처리하며, 음성대조군의 카사바 20그루의 뿌리에 각각 생리식염수 1L를 관개한다. 챌린지 처리 3일 후, 뿌리관개법을 사용하여 키트 1~키트 6의 1000배 희석액을 각각 1L씩 접종하였고, 양성 대조군과 음성 대조군 모두에 같은 양의 식염수를 투여한다. 접종 후부터 15일 내로 카사바 세균성 시들음병의 발병률을 통계하며, 계산공식은 발병률 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100%을 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물이 카사바 세균성 시들음병에 대한 영향
시간 키트 1군 키트 2군 키트 3군 키트 4군 키트 5군 키트 6군 양성대조군 음성대조군
1DAY 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2DAY 1% 1% 2% 3% 2% 0% 3% 0%
3DAY 3% 3% 4% 6% 4% 3% 5% 0%
4DAY 3% 4% 6% 8% 6% 3% 7% 0%
5DAY 4% 5% 9% 11% 9% 4% 8% 0%
6DAY 6% 7% 10% 12% 10% 5% 13% 0%
7DAY 9% 9% 13% 15% 13% 7% 17% 0%
8DAY 10% 10% 16% 18% 16% 9% 22% 0%
9DAY 11% 12% 18% 27% 18% 10% 25% 0%
10DAY 13% 14% 20% 36% 20% 12% 31% 0%
11DAY 14% 15% 34% 42% 24% 12% 38% 0%
12DAY 16% 16% 46% 58% 26% 13% 42% 0%
13DAY 16% 17% 63% 66% 33% 13% 53% 2%
14DAY 19% 18% 73% 72% 43% 14% 60% 2%
15DAY 19% 18% 74% 72% 44% 14% 65% 2%
표 16에 표시된 결과를 보면, 키트 6군의 카사바 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트6는 카사바 세균성 시들음병에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6이 카사바 세균성 시들음병에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예20: 망고 세균성 흑반병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1~키트 6는 전부 실시예 17에 기재된 키트를 적용한다.
시험 과정: 망고 과수 160그루를 1개월간 적응 배양한 후, 무작위로 8개 군(키트 1군~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 망고 과수 20그루로 나뉜다 줄기주입법을 이용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 산토모나스 캄페스트리스 패소바 망기페라인디카 ATCC 11637(Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae)을 각각 키트 1군~키트 6군 및 양성 대조군으로 나뉘어진 총 140그루의 망고 과수를 챌린지 처리하며, 20그루의 음성대조군은 줄기주입법으로 생리 식염수 1L를 주입한다. 챌린지 처리 3일 후, 뿌리관개법을 사용하여 키트 1~키트 6의 1000배 희석액을 각각 1L씩 접종하였고, 양성 대조군과 음성 대조군 모두에 같은 양의 식염수를 투여한다. 접종 후부터 15일 내로 망고 세균성 흑반병의 발병률을 통계하며, 계산공식은 발병률 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100%을 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물이 망고 세균성 흑반병에 대한 영향
시간 키트 1군 키트 2군 키트 3군 키트 4군 키트 5군 키트 6군 양성대조군 음성대조군
1DAY 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2DAY 1% 1% 2% 3% 2% 0% 3% 0%
3DAY 2% 3% 5% 6% 5% 2% 5% 0%
4DAY 3% 4% 8% 9% 7% 3% 7% 0%
5DAY 4% 5% 12% 15% 10% 3% 12% 0%
6DAY 5% 7% 13% 17% 11% 5% 15% 0%
7DAY 8% 9% 14% 19% 14% 8% 19% 0%
8DAY 9% 10% 17% 22% 17% 9% 24% 0%
9DAY 11% 12% 22% 23% 19% 11% 30% 0%
10DAY 13% 14% 25% 24% 21% 11% 42% 0%
11DAY 14% 15% 27% 28% 25% 11% 46% 2%
12DAY 15% 16% 31% 32% 27% 12% 58% 2%
13DAY 16% 17% 37% 38% 35% 12% 63% 3%
14DAY 17% 18% 47% 49% 44% 12% 65% 3%
15DAY 17% 20% 65% 51% 60% 12% 70% 3%
표 17에 표시된 결과를 보면, 키트 6군의 망고 세균성 흑반병 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트6는 망고 세균성 흑반병에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6이 망고 세균성 흑반병에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예21: 키위 궤양병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1~키트 6는 전부 실시예 17에 기재된 키트를 적용한다.
시험과정: 1개월간 적응 재배한 키위 과수 160그루를 무작위로 8개 군(키트 1군, ~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 20그루씩 배정한다. 줄기주입법을 이용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디아 ATCC BAA-2502(Pseudomonassyringae pv. Actinidiae)을 각각 키트 1군~키트 6군 및 양성 대조군으로 나뉘어진 총 140그루의 키위 과수를 챌린지 처리하며, 20그루의 음성대조군은 줄기주입법으로 생리 식염수 1L를 주입한다. 챌린지 처리 3일 후, 표 17에 표시된 결과와 같이, 키트 6군의 키위 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트6는 키위 궤양병 에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6의 키위 궤양병에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예21: 키위 궤양병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1~키트 6는 전부 실시예 17에 기재된 키트를 적용한다.
시험과정: 1개월간 적응 재배한 키위 과수 160그루를 무작위로 8개 군(키트 1군, ~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 20그루씩 배정한다. 줄기주입법을 이용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디아 ATCC BAA-2502 (Pseudomonassyringae pv. Actinidiae) 을 각각 키트 1군~키트 6군 및 양성 대조군으로 나뉘어진 총 140그루의 키위 과수를 챌린지 처리하며, 20그루의 음성대조군은 줄기주입법으로 생리 식염수 1L를 주입한다. 챌린지 처리 3일 후, 뿌리관개법을 사용하여 키트 1군~키트 6군의 1000배 희석액을 각각 1L씩 접종하였고, 양성 대조군과 음성 대조군 모두에 같은 양의 식염수를 투여한다. 접종 후부터 15일 내로 키위 궤양병의 발병률을 통계하며, 계산공식은 발병률 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100%을 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물이 키위 궤양병에 대한 영향
시간 키트 1군 키트 2군 키트 3군 키트 4군 키트 5군 키트 6군 양성대조군 음성대조군
1DAY 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2DAY 3% 3% 1% 3% 3% 0% 3% 0%
3DAY 6% 7% 2% 4% 4% 2% 4% 0%
4DAY 8% 9% 4% 6% 6% 3% 6% 0%
5DAY 11% 11% 5% 9% 10% 4% 11% 0%
6DAY 12% 13% 6% 12% 13% 5% 13% 0%
7DAY 17% 14% 6% 16% 14% 7% 18% 0%
8DAY 20% 18% 9% 19% 18% 9% 22% 0%
9DAY 28% 29% 10% 30% 19% 10% 28% 0%
10DAY 34% 40% 11% 38% 24% 11% 35% 0%
11DAY 43% 51% 15% 43% 33% 14% 46% 0%
12DAY 55% 68% 15% 52% 39% 16% 55% 0%
13DAY 65% 73% 17% 64% 51% 17% 76% 0%
14DAY 77% 85% 18% 75% 60% 18% 89% 0%
15DAY 90% 92% 18% 89% 70% 18% 100% 2%
표 18에 표시된 결과를 보면, 키트 6군의 키위 궤양병 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트6은 키위 궤양병에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6이 키위 궤양병에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예22: 생강 역병 치료와 관련된 산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트의 응용
키트 1~키트 6는 전부 실시예 17에 기재된 키트를 적용한다.
시험 과정: 생강 160포기를 1개월간 적응 배양한 후, 무작위로 8개 군(키트 1군~키트 6군, 양성대조군 및 음성대조군), 군 당 20포기씩 배정한다. 뿌리 관개법을 사용하여 최종 농도가 1x103cfu/mL인 1L의 랄스토니아 솔라나세아룸 ATCC11696D-5(Ralstonia solanacearum)를 사용하여 키트 1군~키트 6군, 양성대조군 의 총 140포기의 생강을 챌린지 처리하며, 음성대조군의 생강 20포기의 뿌리에 각각 생리식염수 1L를 관개한다. 챌린지 처리 3일 후, 뿌리관개법을 사용하여 키트 1군~키트 6군의 1000배 희석액을 각각 1L씩 접종하였고, 양성 대조군과 음성 대조군 모두에 같은 양의 식염수를 투여한다. 접종 후부터 15일 내로 생강 역병의 발병률을 통계하며, 계산공식은 발병률 = 발병 식물 수/총 식물 수 × 100%을 적용한다.
산토모나스 파지 GJ19P1 및 그 조합물 키트가 생강 역병에 대한 영향
시간 키트 1군 키트 2군 키트 3군 키트 4군 키트 5군 키트 6군 양성대조군 음성대조군
1DAY 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2DAY 3% 2% 2% 1% 2% 0% 2% 0%
3DAY 6% 7% 4% 4% 4% 2% 4% 0%
4DAY 8% 9% 6% 5% 6% 4% 10% 0%
5DAY 11% 13% 9% 5% 10% 4% 18% 0%
6DAY 12% 15% 12% 7% 12% 5% 21% 0%
7DAY 19% 17% 18% 8% 15% 8% 34% 0%
8DAY 21% 22% 23% 9% 15% 9% 42% 0%
9DAY 27% 29% 30% 12% 20% 10% 48% 0%
10DAY 33% 32% 41% 13% 29% 11% 60% 0%
11DAY 42% 40% 50% 16% 30% 12% 68% 0%
12DAY 55% 56% 58% 17% 39% 13% 77% 0%
13DAY 68% 64% 64% 17% 44% 13% 87% 3%
14DAY 76% 75% 76% 18% 51% 15% 93% 3%
15DAY 89% 85% 78% 18% 66% 15% 100% 3%
표 19에 표시된 결과를 보면, 키트 6군의 생강 역병 발병률은 키트 1군보다 낮게 나타나며, 이를 통해 상기 조합물을 함유한 키트6는 생강 역병에 대한 방제효과가 뚜렷하며, 상기 조합물을 함유한 키트6이 생강 역병에 대한 방제효과는 산토모나스 파지 GJ19P1만 함유한 키트1보다 더 효과적임을 알 수 있다.
이상의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1) 및 조합물은 사용 안전성이 높고, 키트 및 바이오류 소독제 또는 바이오류 살충제 제조의 유효성분으로 적용하여, 산토모나스균에서 유래되는, 단, 이에 한정되지 않는 세균성 질병을 방제할 수 있다.
실시예 17 ~22를 통해, 산토모나스 파지 GJ19P1만을 투여한 챌린지 실험에서 투여한 균종에 대해 전부 사멸 효과를 나타내며, 챌린지 처리된 식물에 대하여 뚜렷한 방제 역할을 함을 알 수 있으며, 단, 산토모나스 파지 GJ19P1을 함유한 조합물을 투여하여 진행한 바이러스의 공격을 받은 식물에 대한 병치료 방제 효과가 더 우수함을 알 수 있다.
본 발명의 특정 실시예는 단지 본 발명 대한 설명을 위해 적용될 뿐이고, 본 발명에 대하여 한정하지 않으며,본 발명이 속하는 분야의 당업자라면, 본 명세서를 읽은 후 필요에 따라 창의적인 기여 없이 실시예를 수정할 수 있으며, 단, 이와 같은 수정은 본 발명의 청구범위를 벗어나지 않는 한 전부 특허법의 보호범위에 든다.

Claims (10)

  1. 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지에 있어서,
    상기 산토모나스 파지는 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)이며, 보존번호는 CCTCC NO：M 2020805인 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 감염다중도 MOI=0.0001의 여건에서 24시간 배양하여, 역가가 3.5Х1010PFU/mL 이상에 도달하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 pH=2~10의 여건에서 내성을 가지며, 96시간 내로 역가 감소가 4개 자릿수를 초과하지 않으며; 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 9개의 상이한 산토모나스 병원성 변종 균주에 대해 용해율이 91.8%에 달하는 강한 용해력을 가지고 있으며; 또한, 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)이 단일한 산토모나스 병원성 변종에 대한 용해력은 전부 85% 이상에 달하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)은 자외선을 8시간 조사한 후, 역가 감소가 2개 자릿수를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 임의 항에 기재된 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지를 함유한 조합물에 있어서,
    상기 조합물은 적어도 1종의 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조합물은 화학성 살균제를 포함하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 화학성 살균제는 아모밤의 700배액인 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조합물은: 보존번호가 CCTCC NO:M 2018579인 산토모나스 악소노포디스 파지 YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5); 보존번호가 CTCCC NO: M 2020252인 슈도모나스 시린게 패소바 악티니디아 파지 PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phagePSA-P1); 보존번호가 CCTCC NO:M2016635인 랄스토니아 솔라나세아룸 파지 GP3(Ralstonia solanacearum phage Gp3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물.
  9. 제8항에 있어서,
    균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1) 또는 산토모나스 파지 GJ19P1(Xanthomonas phage GJ19P1)의 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 키트.
  10. 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물의 응용에 있어서,
    제6항 내지 제8항에 기재된 상기 산토모나스 파지 GJ19P1의 조합물은 바이오류 소독제 또는 바이오류 살충제의 유효성분으로 적용하여, 산토모나스균에서 유래되는 단, 이에 한정되지 않는 세균성 질병을 방제하는 것을 특징으로 하는 균종간 용해가 가능한 산토모나스 파지 조합물의 응용.
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