CZ2022395A3 - Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky - Google Patents
Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2022395A3 CZ2022395A3 CZ2022-395A CZ2022395A CZ2022395A3 CZ 2022395 A3 CZ2022395 A3 CZ 2022395A3 CZ 2022395 A CZ2022395 A CZ 2022395A CZ 2022395 A3 CZ2022395 A3 CZ 2022395A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- bacteriophage
- ned111
- bacteriophage strain
- strain
- preparation
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 71
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 title claims abstract description 17
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 title claims abstract description 14
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 title abstract description 14
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 title abstract description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000722363 Piper Species 0.000 claims description 9
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 2
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 27
- 241001148118 Xanthomonas sp. Species 0.000 description 20
- 241000815873 Xanthomonas euvesicatoria Species 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 241000567019 Xanthomonas vesicatoria Species 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 2
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 2
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000001511 capsicum annuum Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 2
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001187099 Dickeya Species 0.000 description 1
- 241000952519 Dickeya sp. Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000531155 Pectobacterium Species 0.000 description 1
- 241000966114 Pectobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000191530 Pradovirus Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000589649 Xanthomonas campestris pv. campestris Species 0.000 description 1
- 241000411046 Xanthomonas perforans Species 0.000 description 1
- 241001633980 Xanthonema Species 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000002925 chemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká kmene bakteriofága uloženého v Polské sbírce mikroorganismů Institutu imunologie a experimentální terapie, Polská akademie věd, Vratislav, ul. Weigla 12, pod přírůstkovým číslem Xe_NED111. Kmen bakteriofága může být použit proti bakteriím způsobujícím skvrnitost rajčete a papriky. Řešení se dále týká přípravku proti bakteriím způsobujícím skvrnitost rajčete a papriky, který obsahuje kmen bakteriofága Xe_NED111 o koncentraci alespoň 106 PFU/ml. Přípravek může dále obsahovat kmen bakteriofága Xe_PB119 a dále kmen bakteriofága Phi966.
Description
Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky
Oblast techniky
Vynález se týká kmene bakteriofága, přípravku na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky.
Dosavadní stav techniky
Bakterie Xanthomonas vesicatoria (Xv), Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria (Xee) a Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav), infikují rostliny z čeledi lilkovitých (Solanaceae) a způsobují onemocnění označované jako bakteriální skvrnitost rajčete a papriky. Symptomy onemocnění jsou mimo jiné fialově šedé skvrny s černým středem a žlutým lemem na listech, vodnaté, mírně vyvýšené skvrny na zelených plodech, později praskající a opad květů. Choroba se přenáší osivem, během vegetace mechanickým kontaktem nebo působením větru a deště. Znehodnocuje plody a snižuje jejich tržní hodnotu. K zabránění výskytu choroby se používá selekce a likvidace napadených rostlin, dezinfekce rukou a nářadí, používá se nekontaminované osivo.
Laboratorně lze bakterie rodu Xanthomonas inhibovat antibiotiky, jejich použití v produkci potravin je však nežádoucí. Na rostliny je možné aplikovat i jiné mikroorganismy, především jiné bakterie, které mohou konkurovat v životních potřebách patogenním bakteriím a nespecificky tak snižovat jejich výskyt. Nevýhodou tohoto přístupu je pouze omezující účinek, nikoli destrukce patogenních bakterií. Princip virové neboli fágové terapie je znám velmi dlouho, rozvíjel se v humánní medicíně především v první polovině 20. století, později však převážila terapie pomocí antibiotik. Fágová terapie využívá rozeznání hostitelské bakterie fágem neboli bakteriofágem, infekce bakterie fágovou nukleovou kyselinou, namnožení fága v buňce a její závěrečný zánik při uvolňování fága z buňky. Projevy infekce fága, jako je rychlost množení fága či množství uvolňovaných virionů na testovacích miskách se liší v závislosti na konkrétní bakterii a konkrétním fágu. Výhodou fágové terapie je specificita pouze na bakterie, jako cílové organismy, a proto je bezpečná pro rostliny, hmyz, člověka a jiné organismy. Hostitelským okruhem pro konkrétní fág může být jen několik málo bakteriálních druhů, jeden bakteriální druh, nebo jen několik kmenů daného druhu. V tom je skryta na druhou stranu i nevýhoda fágové terapie, kdy může být neúčinná například na odlišné kmeny hostitelské bakterie, než jsou ty, na které byly fágy selektovány.
Dokument EP 2195419 popisuje obecnou existenci bakteriofága či bakteriofágů, které jsou obecně účinné proti bakteriím rodu Xanthomonas, zejména Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Dokument se zabývá zejména přípravou suchého bakteriofágového přípravku, následně použitelného ve formě roztoku. V dokumentu však není uvedeno, jakým způsobem lze přípravek použít, není uvedeno rozmezí hostitelů, proti kterým by zmiňovaný fág či fágy byly účinné, ani nejsou uvedeny žádné podmínky využití tohoto fága či fágů.
Úkolem vynálezu je proto najít vhodný kmen bakteriofága, který by byl schopen účinně a rychle působit proti specifickým bakteriálním kmenům způsobujícím onemocnění bakteriální skvrnitost rajčete a papriky, a vytvořit přípravek, který by byl účinný proti těmto bakteriálním kmenům a najít jejich vhodné použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčat a paprik.
- 1 CZ 2022 - 395 A3
Podstata vynálezu
Tento úkol je vyřešen pomocí kmene bakteriofága uloženého v Polské sbírce mikroorganismů Institutu imunologie a experimentální terapie, Polská akademie věd, Vratislav, ul. Weigla 12, (Polish Collection of Microorganisms, Institut of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Science, ul. Weigla 12, Wroclaw) pod přírůstkovým číslem Xe_NED111. Vynález se rovněž zabývá přípravkem obsahujícím tento kmen a jejich použití.
Přípravek obsahující kmen bakteriofága Xe_NED111, také přípravek s výhodou obsahující dále kmen bakteriofága Xe_PB119 a také přípravek obsahující s výhodou dále kmen bakteriofága Phi966 využívá působení přirozeného antagonisty bakterií Xv, Xee aXav, kterými jsou specifické bakteriální viry (bakteriofágy, fágy). Virus využívá tyto bakterie jako své hostitele, po dokončení svého replikačního cyklu bakteriální buňku zahubí (lyzuje) a sám se uvolní do prostředí. Virus nemá kromě bakterií jiné hostitele, pokud se v prostředí nenachází vhodný hostitel, virus působením fyzikálních a chemických vlivů prostředí postupně zaniká. Druhou složkou přípravku je bakteriofág Xe_PB119, který je uložený taktéž v Polské sbírce mikroorganismů Institutu imunologie a experimentální terapie, Polská akademie věd, Vratislav, ul. Weigla 12, a třetí složkou přípravku je bakteriofág Phi966, které mají odlišný genom od genomu bakteriofága Xe_NED111, ale stejné rozmezí hostitelů, je proto oprávněné předpokládat, že v případě výskytu rezistentní bakterie k jedné složce přípravku, lytickou funkci bude vykonávat druhá složka přípravku, případně třetí složka přípravku. Virus Xe_NED111 je přijímán kořenovým systémem rostlin a je distribuován v rostlinách.
Ze vzorku půdy z území ČR byl izolován bakteriální virus neboli bakteriofág označený Xe_NED111, který jako své hostitele využívá kmeny bakterie Xanthomonas euvesicatoria neboli X. euvesicatoria neboli Xe. Na miskách s hostitelem X. euvesicatoria 1940 vytváří bakteriofág Xe_NED111 po 16hodinové inkubaci lytické zóny o průměru 4 mm. Typový izolát viru má dsDNA genom a na základě molekulárně genetických kritérií byl klasifikován v rodu Pradovirus, čeledi Autographiviridae. Z jiného vzorku půdy byl izolován bakteriofág označený Xe_PB119. Na miskách s hostitelem X. euvesicatoria 1940 vytváří po 16hodinové inkubaci lytické zóny o průměru 4 mm. Typový izolát má dsDNA genom a na základě molekulárně genetických kritérií byl klasifikován do rodu Riverridervirus, čeledi Schitoviridae. Podstatou přípravku je směs fágových lyzátů viru Xe_NED111 a jeho přirozených variant, např. bakteriofága Phi966, a fágového lyzátu viru Xe_PB119 a jeho přirozených variant ve stabilizovaném vodném roztoku o výsledném titru alespoň 106 PFU/ml, s účinností proti bakteriím způsobujícím bakteriální skvrnitost rajčete a paprik na území ČR. Účinek přípravku byl sledován na souboru 26 kmenů X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. campestris pv. campestris a Xanthonema sp. izolovaných ze symptomatických rostlin pěstovaných na území České republiky, nebo z prostředí farem nebo deponovaných ve sbírkách mikroorganismů.
Výhody kmene bakteriofága Xe_NED111 a přípravku obsahujícího bakteriofága Xe_NED111 a bakteriofága Xe_PB119 spočívají zejména v tom, že přípravek obsahuje bakteriální lyzát virů specifických k českým kmenům bakterií způsobujících bakteriální skvrnitost rajčat a paprik, je efektivní, neboť rychle a účinně eliminuje přítomnost bakterií způsobující onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčat a paprik. Přípravek obsahující výše uvedené dva bakteriofágy je doplněn třetím bakteriofágem, který rozšiřuje rozmezí kmenů, proti kterým je přípravek účinný.
Objasnění výkresů
Uvedený vynález bude blíže objasněn na následujících vyobrazeních, kde:
obr. 1 zobrazuje graf účinnosti jednotlivých bakteriofágů v tekutém médiu,
- 2 CZ 2022 - 395 A3 obr. 2 zobrazuje graf porovnání účinnosti směsí bakteriofágů a samotného fága NED111.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1 - Způsob nalezení bakteriofága Xe_NED 111
Jeden gram půdy byl ve zkumavce doplněn 5 ml sterilního LB média, kultivován na třepačce 16 hodin při 20 °C a poté odstředěn při 8000 x g 10 minut. Supernatant byl filtrován přes bakteriální filtr o velikosti pórů 0,22 μm a uchován při 10 °C pro další použití. Přítomnost lytických bakteriofágů v jednotlivých vzorcích půdy byly testovány v tekuté kultuře v provedení v ELISA destičce. Do jednotlivých jamek bylo aplikováno 100 μl exponenciálně rostoucí kultury bakteriálního kmenu X. euvesicatoria 1940 a přidáno po 10 μl jednotlivých filtrovaných supernatantů. Na přístroji Tecan Spectra byl proveden odečet absorbance při 405 nm. Po inkubaci 16 h při 27 °C byl znovu proveden odečet absorbance a obě hodnoty porovnány. Jamky, ve kterých byl zaznamenán největší pokles hodnot absorbance při 405 nm, obsahovaly bakteriofágy a byly vybrány pro další selekci.
Metodika testování účinnosti byla založena na principu fágové typizace. Na Petriho misky obsahující pevnou vrstvu vytvořenou z 15 ml LB média (Sigma-Aldrich L3147) s 1,5% agarem, byly nality 4 ml LB média obsahujícího 0,45% agar temperovaný na 45 °C a 20 μl exponenciálně rostoucí kultury testovaného bakteriálního kmene. Po ztuhnutí bylo na misky aplikováno po 1 μl vzorku přípravku obsahujícího fága Xe_NED111, nebo Xe_PB119, nebo jiného, v rozsahu ředění 100 až 10-5 (celkem 6 kapek po 1 μ!). Po inkubaci 16 h při 27 °C byly misky vizuálně hodnoceny. Jako lyzující daný bakteriální kmen byl označen fág tehdy, pokud se lyze projevila aspoň v rozsahu tří ředění. Virus Xe_NED111 lyzoval 23 z 26 kmenů Xanthomonas, virus Xe_PB119 lyzoval stejných 23 kmenů z 26 testovaných (viz tabulka 1).
- 3 CZ 2022 - 395 A3
Tabulka 1. Lytický účinek bakteriofágů proti bakteriím Xanthomonas a jiným druhům
| bakteriální kmeny | Xe_NEDlll | Xe_PB119 | Phi966 |
| X. euvesicatoria 1940 | + | + | + |
| X. euvesicatoria 2501 | + | + | - |
| X. vesicatoria 14/6 | - | - | + |
| X. vesicatoria 667 | - | - | + |
| X. vesicatoria 7116 | - | - | + |
| X. vesicatoria 7117 | + | + | + |
| X. vesicatoria 2/3/1 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1626 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1008 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1009 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1010 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1011 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1012 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1013 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1014 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1015 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1016 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1017 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1018 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1025 | + | + | + |
| Xanthomonas sp. 1027 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1028 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1029 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1030 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 1031 | + | + | - |
| Xanthomonas sp. 4979 | + | + | + |
| Acidovarox citruiti ACS829 | - | - | - |
| Pseudomonas syringae PS152 | - | - | - |
| Cfavibacter mtchiganensis ssp. michiganensis 9047 | - | - | - |
+ = bakteriofág způsobuje lyži buněk, - = bakteriofág nelyžuje buňky, Phi966 = přirozená varianta fága Xe_NED 111.
V jiném pokusu byly lyzovací schopnosti jednotlivých bakteriofágů testovány v tekutém 10 prostředí ve formátu ELISA. Do jamek bylo aplikováno 100 μΐ exponenciálně rostoucí bakteriální kultury. Byl připraven přípravek, konkrétně z purifikátu bakteriofágů bylo připraveno
-4CZ 2022 - 395 A3 ředění v rozsahu 10-3 až 10-5 a do jamek bylo přidáno 10 μΐ z každého ředění, destička byla kultivována při 27 °C a absorbance při 405 nm byla odečítána v 30 min intervalech, jak je zobrazeno v grafu na obr. 1. Z grafu na obr. 1 vyplývá, že všechny tři přípravky obsahující po jednom bakteriofágu v tekutém prostředí hostitelskou bakterii lyzují, měřitelný pokles koncentrace bakterie nastává při použití bakteriofágů Xe_NED111 a Xe_PB119 kolem 60. minuty, u bakteriofága Phi966 až kolem 120. minuty. V kontrolním vzorku bakterie bez přítomnosti bakteriofágů přitom koncentrace neustále roste.
V jiném pokusu byly testovány lyzovací schopnosti směsí bakteriofágů v tekuté kultuře ve formátu ELISA. Do jamek bylo aplikováno 100 μl exponenciálně rostoucí kultury testovaného bakteriálního kmene a 106 PFU bakteriofágů samostatně, nebo v kombinacích, v maximálním objemu 10 gl. Destička byla inkubována při 27 °C a absorbance při 405 nm byla odečítána v časových intervalech, jak je zobrazeno v grafu na obr. 2. Byly použity přípravky obsahující směs bakteriofágu Xe_NED111 a bakteriofágu Xe_PB119 v poměru počtu PFU 50:50 a dále byl použit přípravek obsahující směs bakteriofágu Xe_NED111 a bakteriofágu Xe_PB119 a bakteriofágu Phi966 v poměru počtu PFU 40:50:10. Z grafu na obr. 2 vyplývá, že v případě použití přípravku obsahující směs bakteriofágů Xe_NED111 a Xe_PB119, a směs Xe_NED111, Xe_PB118 a Phi966 dochází k poklesu koncentrace bakterií ještě před 60. minutou, zatímco koncentrace v kontrolním vzorku bez bakteriofágů roste.
Příklad 2 - Způsob přípravy koncentrovaného roztoku bakteriofága
Selektovaný vzorek podle Příkladu 1 byl naředěn 101 až 105 x v PB pufru (150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgSOA smíchán s 20 gl exponenciálně rostoucí kultury
X. euvesicatoria 1940 a 4 ml živného média v 0,45% agaru temperovaného na 45°C a vylit na povrch Petriho misek s vrstvou LB média v 1,5% agaru. Po 16hodinové inkubaci při 27 °C byly dobře oddělené čiré zóny (plaky) jednotlivě odebrány do PB pufru a pasážovací postup byl opakován 4x. Do exponenciálně rostoucí kultury X. euvesicatoria 1940 v tekutém živném médiu byl přidán bakteriofág po 4. pasáži a kultura byla inkubována 16 hodin při 27°C. Bakteriální lyzát byl odstředěn centrifugací 10 min při 20 000 x g a supernatant filtrován přes bakteriální filtr o velikosti pórů 0,22 gm. Filtrovaný lyzát byl naředěn 1:1 (v:v) v 20 mM Tris-HCl pH 7,2 pufru, aplikován na FPLC kolonu CIMmultus QA (Sartorius), která byla promývána stejným pufrem. Bakteriofág, který byl zachycen kolonou byl z ní uvolněn vymytím 1M NaCl v 20mM Tris-HCl pufru a poté dialyzován proti pufru PB. Koncentrace získaného purifikátu fága byla zjištěna metodou fágové typizace, jak bylo uvedeno výše. Takto připravený purifikát fága obsahoval 109 až 1011 PFU/ml.
Příklad 3 - Dekontaminace bakterií na povrchu semen paprik a rajčat
Semena je možné povrchově sterilizovat inkubací v roztoku fága např. postupem: Semena papriky nebo rajčat byla povrchově sterilizována 10 minut v 5% roztoku Sava, propláchnuta destilovanou vodou a vysušena mezi filtračními papíry. Semena byla uměle infikována inkubací 15 minut v pufrovaném roztoku bakterie X. euvesicatoria 1940 o koncentraci 104 CFU/ml. Po odsátí roztoku byla semena osušena mezi filtračními papíry a poté inkubována 60 minut v pufrovaném roztoku viru Xe_NED111 o koncentraci 106 PFU/ml. Po odsátí roztoku byla semena osušena mezi filtračními papíry a inkubována 15 minut v 1 ml živného média (LB). 0,1 ml média bylo rozetřeno na povrch živného média v Petriho misce a inkubováno 16 hodin při 27 °C. Po inkubaci nebyly na misce viditelné žádné kolonie X. euvesicatoria. Konstatujeme tedy, že fágový roztok způsobil snížení koncentrace bakterie pod detekovatelnou mez.
Příklad 4 - Inokulace rostlin virem Xe_NED111 a jeho detekce
Virus Xe_NED111 je přijímán kořenovým systémem rostlin a je distribuován v rostlinách. Semenáče rajčat ve stadiu 2 pravých listů byly pěstovány ve sterilním substrátu z kokosové drti o objemu 250 cm3. Do substrátu bylo nalito 25 ml pufrovaného roztoku viru o koncentraci
- 5 CZ 2022 - 395 A3
106 PFU/ml a rostliny byly pěstovány další dva měsíce. Virus byl detekován metodou PCR s použitím SapphireAmp fast PCR mix (Takara Bio), primerů 2331: 5'ATGGAGGAGGAGAAGAAGGTCAAG-3' a 2332: 5'-ATTATGCAACCTTGTCGATGCG-3' a extraktu nukleových kyselin z řapíků nejvyššího patra listů. Amplifikační protokol byl 98 °C/1 min, 2 x 35 cyklů 95 °C/10 s, 60 °C/20 s a 72 °C/30 s. Po elektroforetickém rozdělení na agarózovém gelu měl virový produkt velikost 442 pb.
Příklad 5 - Inokulace rostlin virem Xe_NED111 ve směsi s jinými viry
Inokulační roztok obsahoval 5 % bakteriofága Xe_NED111 o koncentraci 106 PFU/ml a celkem 95 % nepříbuzných virů Dickeya virus Ds3 a Pectobacterium virus P251, specifických vůči bakterií Dickeya sp. a Pectobacterium sp. (o koncentraci 106 PFU/ml), resp. 50 % Xe_NED111 a celkem 50 % virů Ds3 a P251. Semenáče rajčat ve stadiu 2 pravých listů byly pěstovány ve sterilním substrátu z kokosové drti o objemu 250 cm3. Do substrátu bylo nalito 25 ml pufrovaného roztoku virů a rostliny byly pěstovány další měsíc. Virus byl detekován metodou PCR s použitím SapphireAmp fast PCR mix (Takara Bio), primerů 2331 a 2332 a extraktu nukleových kyselin z řapíků nejvyššího patra listů. Amplifikační protokol byl 98 °C/1 min, 35x (95 °C/10 s +60 °C/20 s +72 °C/30 s). Po elektroforetickém rozdělení na agarozovém gelu měl virový produkt velikost 442 pb.
Příklad 6 - Dekontaminace předmětů povrchově kontaminovaných bakterií Xanthomonas sp. Xee
Sterilní skleněná tyčinka o průměru 5 mm a ocelová laboratorní špachtle byly v délce 5 cm po dobu 5 minut ponořeny do pufrovaném roztoku X. euvesicatoria (1940) o koncentraci 104 CFU/ml. Poté byly vyňaty a ponechány oschnout 5 minut na filtračním papíru. Poté byly ponořeny v délce 5 cm po dobu 60 minut do roztoku viru Xe_NED111 o koncentraci 106 PFU/ml. Po vynětí a oschnutí 5 minut byly ponořeny v délce 5 cm do živného média po dobu 5 minut a poté bylo 0,1 ml média inokulováno na povrch živného média v Petriho misce a inkubováno 16 hodin při 27 °C. Po inkubaci nebyly na misce viditelné žádné kolonie Xee.
Průmyslová využitelnost
Kmen bakteriofága Xe_NED111 a přípravek obsahující tento kmen, případně přípravek obsahující dále kmen bakteriofága Xe_PB119, případně přípravek obsahující dále kmen bakteriofága Phi966 je možné aplikovat za účelem eliminace nebo potlačení bakteriální infekce rostlin spolu se závlahou nebo výživou nebo postřikem nadzemních částí nebo mechanickým očkováním nebo ve směsi s jinými viry nebo také za účelem eliminace viru z kontaminovaných nástrojů a prostředí nebo za účelem eliminace bakterií z povrchu semen.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kmen bakteriofága uložený v Polské sbírce mikroorganismů Institutu imunologie a experimentální terapie, Polská akademie věd, Vratislav, ul. Weigla 12, pod přírůstkovým číslem Xe_NED111.
- 2. Použití kmene bakteriofága Xe_NED111 podle nároku 1 pro eliminaci nebo potlačení bakterií způsobujících skvrnitost rajčete a papriky.
- 3. Přípravek proti bakteriím způsobujícím skvrnitost rajčete a papriky, vyznačující se tím, že obsahuje kmen bakteriofága Xe_NED111 podle nároku 1 o koncentraci alespoň 106 PFU/ml.
- 4. Přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje kmen bakteriofága Xe_PB119 uložený v Polské sbírce mikroorganismů Institutu imunologie a experimentální terapie, Polská akademie věd, Vratislav, ul. Weigla 12, přičemž přípravek obsahuje 30 až 70 % počtu PFU kmene bakteriofága Xe_NED111 a 30 až 70 % počtu PFU kmene bakteriofága Xe_PB119.
- 5. Přípravek podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje kmen bakteriofága Phi966, přičemž přípravek obsahuje 10 až 30 % počtu PFU kmene bakteriofága Phi966.
- 6. Použití přípravku podle některého z nároků 3 až 5 pro eliminaci nebo potlačení bakterií způsobujících skvrnitost rajčete a papriky.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-395A CZ2022395A3 (cs) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-395A CZ2022395A3 (cs) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ309960B6 CZ309960B6 (cs) | 2024-03-06 |
| CZ2022395A3 true CZ2022395A3 (cs) | 2024-03-06 |
Family
ID=90056471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2022-395A CZ2022395A3 (cs) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2022395A3 (cs) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015194540A1 (ja) * | 2014-06-20 | 2015-12-23 | 国立大学法人広島大学 | バクテリオファージ、カンキツかいよう病予防剤およびカンキツかいよう病の予防方法 |
| CN111778216A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-10-16 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 一种地毯草黄单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 |
| CN113151192B (zh) * | 2021-03-05 | 2023-11-24 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 一种可跨种裂解的黄单胞菌噬菌体和其组合物、试剂盒和应用 |
-
2022
- 2022-09-20 CZ CZ2022-395A patent/CZ2022395A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ309960B6 (cs) | 2024-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Elhalag et al. | Potential use of soilborne lytic Podoviridae phage as a biocontrol agent against Ralstonia solanacearum | |
| JP7276901B2 (ja) | 植物病害を治療及び防除する方法及び組成物 | |
| Fujiwara et al. | Biocontrol of Ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages | |
| Czajkowski et al. | Isolation and characterization of novel soilborne lytic bacteriophages infecting Dickeya spp. biovar 3 (‘D. solani’) | |
| Di Lallo et al. | Isolation and partial characterization of bacteriophages infecting Pseudomonas syringae pv. actinidiae, causal agent of kiwifruit bacterial canker | |
| Ramírez et al. | Bacteriophages as promising agents for the biological control of Moko disease (Ralstonia solanacearum) of banana | |
| Ahmad et al. | The filamentous phage XacF1 causes loss of virulence in Xanthomonas axonopodis pv. citri, the causative agent of citrus canker disease | |
| US12024703B2 (en) | Method for treatment and control of plant disease | |
| Ogunyemi et al. | Identification and characterization of five new OP2-related Myoviridae bacteriophages infecting different strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae | |
| Addy et al. | Detection of bacterial wilt pathogen and isolation of its bacteriophage from banana in Lumajang area, Indonesia | |
| US8440446B2 (en) | Bacteriophage strains for the treatment of bacterial infections, especially drug resistant strains of the genus Enterococcus | |
| WO2015194540A1 (ja) | バクテリオファージ、カンキツかいよう病予防剤およびカンキツかいよう病の予防方法 | |
| Jagdale et al. | Green approach to phytopathogen: Characterization of lytic bacteriophages of Pseudomonas sp., an etiology of the bacterial blight of pomegranate | |
| WO2022024287A1 (ja) | バクテリオファージ、青枯病防除剤および青枯病防除方法 | |
| JP2018024589A (ja) | 青枯病防除剤及び青枯病防除方法 | |
| CZ2022395A3 (cs) | Kmen bakteriofága Xe_NED111, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky | |
| CZ309961B6 (cs) | Kmen bakteriofága Xe_PB119, přípravek na bázi tohoto kmene bakteriofága a jejich použití proti onemocnění bakteriální skvrnitosti rajčete a papriky | |
| Sabri et al. | Xylella phage MATE 2: a novel bacteriophage with potent lytic activity against Xylella fastidiosa subsp. pauca | |
| Barua et al. | Isolation of bacteriophages infecting Ralstonia solanacearum causing bacterial wilt disease in Naga Chilli (Capsicum chinense Jacq.) | |
| Marei et al. | Biological control of Pectobacterium carotovorum via specific lytic bacteriophage | |
| Le | Bacteriophage: A Potential Treatment for Citrus Canker | |
| Doan et al. | Efficacy of bacteriophages in controlling bacterial vascular wilt caused by Ralstonia solanacearum Smith on eggplants | |
| Khor et al. | Biocontrol capability of bacteriophages against soft rot disease caused by Dickeya chrysanthemi. | |
| Hussain et al. | Molecular and biochemical characterization of Xanthomonas axonopodis pv. citri pathotypes | |
| Basit et al. | Systemic resistance induced in tomato plants by Beauveria bassiana‐derived proteins against tomato yellow leaf curl virus and aphid Myzus persicae |