KR20210142679A - 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지 및 그 조합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리오파지 기술분야에 관한 것으로, 특히 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지 및 그 조합물에 관한 것이다. 상기 살모넬라 파지는 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3는 고온 내성이 우수하여 65°C 수조에서 2시간 방치한 후에도 생존율이 80%에 달하며, 75°C 수조에서 2시간 방치한 후 106PFU/mL의 역가를 나타낸다. 농도가 102～103cfu/mL인 살모넬라 배지에서 104～106PFU/mL의 살모넬라 파지 SG8P3이 상기 농도의 살모넬라에 대한 멸균율은 99% 이상에 달하는 와이드 스펙트럼 살균력을 나타내며; 살모넬라 파지 SG8P3의 조합물은 용해율이 98% 이상인 더 강한 용해성으로 더 많은 살모넬라를 용해할 수 있다.

Description

와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지 및 그 조합물
본 발명은 박테리오파지 기술분야에 관한 것으로, 특히 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지 및 그 조합물, 키트, 응용에 관한 것이다.
살모넬라 균은 일반적으로 동물의 장내에 서식하며, 식품 가공과정에서 *부적절한 취급으로 식품을 쉽게 오염시켜 식품 안전에 위협주는 동시에 인체 건강에 위해를 끼칠 수 있다. 최근들어, 양식업자와 사료생산업체의 항생제 남용으로 약물 내성 박테리아 균주가 점점 더 많이 출현하면서 살모넬라 감염 치료에 사용하는 많은 항생제가 효능을 잃어가고 있다. 관련 보도에 따르면, 중국 살모넬라가 설폰아미드 항생제에 대한 내성은 100%에 접근하고 있어 당업자들은 부득이 하게 이와 같은 박테리아의 감염을 예방하고 치료하기 위한 효과적인 방법을 모색 중이다.
박테리오파지는 박테리아를 절대적으로 기생시키거나 감염시키는 바이러스의 한 부류로 자연계에 널리 존재한다. 독성 파지는 민감한 숙주 박테리아 세포 내에서 번식할 수 있으며, 숙주 박테리아를 용해하여 자손 파지를 방출하면서 숙주 박테리아를 파괴하는 효과를 달성할 수 있다. 생산 과정에서 독성 파지는 다양한 병원성 박테리아를 사멸하는 데 널리 사용되며, 특히 범 약물 내성 "슈퍼 박테리아"로 인한 감염 치료에서 좋은 효과를 나타내고 있다.
중국특허 공개번호 CN104830806B 발명은 살모넬라 파지 및 그 항균 응용에 관하여 개시하고 있다. 이의 보존 변경 번호는 CCTCC NO: M2014145, 보존 일자 2014년 4월 24일, 해당 박테리아 파지는 살모넬라에 대해 강한 용해 작용을 한다. 본 발명에서, 전자 현미경을 이용한 형태학적 분석을 통해 해당 파지 균주를 미오비리대과로 확정하면서 살모넬라 파지 STP4-a로 명명한다; 해당 파지는 40 ~ 60℃, pH 4~12 여건에서 생존 가능하며; -20℃에서 1년간 보관한 후 안정적인 활성을 나타낸다; 파지 보관용 보호제는 20%의 글리세롤을 함유하는 배양액을 사용한다. 본 발명에서 명시하는 살모넬라 특이성 용해 파지를 사용하여 약물 내성 살모넬라를 사멸할 수 있다.
중국 특허 공개번호 CN106497888B 발명은 살모넬라 파지와 박테리오 파지 항균 조합물 및 그 응용을 개시하고 있다. 본 발명에서 취급하는 파지는 살모넬라 엔테리티디스 파지 LPSE1 및 살모넬라 티피무리움 파지 LPST10을 포함한다. LPSE1 또는 LPST10 파지는 모두 살모넬라에 대해 좋은 억제 효과를 발생할 수 있다. 이와 같은 파지는 식품 시스템에서의 적용 예를 통해 정균제로서의 좋은 효과를 나타내고 있음을 입증했다.
상술한 기존 기술방안에는 다음과 같은 문제점이 존재한다: 상기 언급한 살모넬라 파지는 용해 범위와 고온 내성 상 모두 한계를 나타내고 있으며, 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 제공하는 것이 시급하다.
종래 기술 단점을 고려한 본 발명의 목적 중 하나로 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 제공하는 것이다.
상기 언급된 본 발명의 목적 중 하나는 다음과 같은 기술방안을 통해 달성된다: 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지에 있어서, 상기 살모넬라 파지는 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)이며, 보존 번호는 CCTCC NO: M 2020205이다.
상기 기술방안을 채택함으로써 와이드 용해 스펙트럼을 가진 새로운 유형의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)이 제공되며, 이와같은 파지는 고온에 대한 내성이 좋아 살모넬라를 고효율적으로 사멸할 수 있다.
본 발명은 바람직한 실시예를 통해 다음과 같이 추가로 구성할 수 있다: 상기 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)은 20면체 헤드, 길이 80-100nm, 가로 지름 50-70nm 및 수축성 근초를 가지며, 꼬리 길이는 90 ~ 110nm이고, 지름이 15 ~ 25nm이다.
본 발명은 바람직한 실시예를 통해 다음과 같이 추가로 구성할 수 있다: 상기 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 75℃여건에서 양호한 내고온 특성을 나타낸다.
본 발명은 바람직한 실시예를 통해 다음과 같이 추가로 구성할 수 있다: 상기 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 살모넬라에 대하여 와이드 스펙트럼 살균력을 나타낸다.
본 발명의 두번째 목적은 상기 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 함유하는 조합물을 제공하는 것이다. 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 고온에 대한 양호한 내성을 가지며, 용해 스펙트럼 범위도 넓어 다른 파지와 조합하여 함께 사용할 수 있고, 특정 요구사항을 충족하기 위해 다른 물질과 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 두번째 목적은 다음과 같은 기술방안에 의해 달성된다 : 상기 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 함유하는 조합물에 있어서, 조합물은 상기 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 다른 살모넬라 파지 중 적어도 하나를 함유한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 다음과 같이 추가로 구성될 수 있다: 상기 다른 살모넬라 파지는 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 보존 번호는 CCTCC M2018765; 미오비리대과 BP-66 (Myoviridae sp. BP- 66), 보존 번호 CCTCC NO: M 2015146; 미오비리대과 BP-63 (Myoviridae sp. BP-63), 보존번호 CCTCC NO : M 2015145; 또는 칠리키 바이러스과 파지 BP-12 (Chilikevirus sp. BP-12), 보존번호 CCTCC NO : M 2015141 중 하나일 수 있다.
상기 기술방안을 통해 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)을 다른 파지와 함께 사용하여 표적 세균에 대한 더 나은 사멸 효과를 달성하였다.예시적인 설명에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3과 다른 파지 사이의 사용 상 비례 관계는 본 발명이 속하는 분야의 기술인원에 의해 본 발명을 실제 응용분야 및 본 분야의 상식과 연결시켜 확정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에 있어서, 다음을 추가로 구성할 수 있다 : 조합물은 화학적 살균제 농도가 0.05%인 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드 또는 최종 농도가 0.01%인 브로모게라민 중 하나를 추가로 포함한다.
살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 다른 항균제와 혼합 사용하여 와이드 스펙트럼 항균성을 갖추면서 살모넬라를 특이적으로 사멸할 수 있다.여기서 본안에 기재된 파지와 조합하여 사용하는 항균제는 항생제와 화학적 항균제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 설명에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3과 다른 항균제 사이의 사용 상 비례 관계는 본 발명이 속하는 분야의 기술인원에 의해 본 발명을 실제 응용분야 및 본 분야의 상식과 연결시켜 확정할 수 있다.
본 발명의 세번째 목적은 상기 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 함유하는 조합물을 제공 및 활용하는 것이다. 상기 살모넬라 풀로룸 파지(Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물은 살모넬라로 인한 세균성 질병을 예방하기 위한 생물학적 살균제 또는 생물학적 약제의 유효 성분으로 사용될 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세번째 목적은 다음과 같은 기술방안에 의해 달성된다: 상기 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 함유하는 조합물에 있어서, 조합물은 상기 살모넬라 파지(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 다른 파지 중 적어도 하나를 함유한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 다음과 같이 추가로 구성될 수 있다: 상기 다른 살모넬라 파지는 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 보존 번호 CCTCC NO: M2018765; 대장균 파지 EC35P1 (Escherichia coli phage EC35P1), 보존 번호 CCTCC NO : M 2020438; 황색포도상구균 파지 J1P2 (Staphylococcus aureus phage J1P2), 보존 번호 CCTCC NO : M2016285 중 하나일 수 있다.
상기 기술방안을 통해 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물은 살모넬라에 따른 세균 감염 및 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하는 데 사용할 수 있으며; 또한, 살모넬라로 인한 세균성 질병, 단, 이에 한정되지 않는 세균성 질병을 예방 및 치료하는 생물학적 제제로 사용할 수 있다. 예시적인 설명에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3과 다른 파지 사이의 사용 상 비례 관계는 본 발명이 속하는 분야의 기술인원에 의해 본 발명을 실제 응용분야 및 본 분야의 상식과 연결시켜 확정할 수 있다.
본 발명의 네번째 목적은 상기 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지 또는 살모넬라 파지의 조합물을 함유하는 시제 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 다음과 같은 기술방안에 의해 달성된다 : 상기 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지를 함유하는 조합물의 시제 및 키트에 있어서, 시제 또는 키트는 상기 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 또는 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물을 함유한다.
본 발명의 다섯번째 목적은 상기 살모넬라 파지 및 그 조합물의 활용법을 제공하는 것이다.
상기 언급된 본 발명의 다섯번째 목적은 다음과 같은 기술방안을 통해 달성된다: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)및 그 조합물을 생물학적 살균제로 활용한다.
상기 기술방안을 채택하여 일상 살균제로 사용할 수 있으며 일상환경에서 서식하는 살모넬라 및 이에 한정되지 않는 박테리아를 특이적으로 사멸할 수 있으며, 일상 환경에 서식하는 미생물의 분포를 개선할 수 있다; 또한, 가축 및 가금류 제품의 사육, 운수 및 저장하는 과정에서 생물학적 살균제로 사용할 수도 있으며, 가축 및 가금 사육, 운수 및 저장하는 과정에서 살모넬라 및 기타 박테리아의 오염을 방지 제어할 수 있으며; 다른 살균제와 혼합 사용하여 식품 생산 작업장에 뿌려, 식품 가공 과정에서 발생할 수 있는 살모넬라균 및 기타 박테리아의 오염을 방지 제어할 수도 있다.
본 발명의 여섯번째 목적은 상기 살모넬라 파지 및 그 조합물의 다른 활용법을 제공하는 것이다.
상기 언급된 본 발명의 여섯번째 목적은 다음과 같은 기술방안을 통해 달성된다: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 살모넬라를 포함하나 단 이에 한정되지 않는 세균 감염에 대하여 잠재적인 치료제 또는 건강제품으로 사용한다.
상기 기술방안을 통해 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물은 살모넬라에 따른 세균 감염 및 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 일곱번째 목적은 상기 살모넬라 파지 및 그 조합물의 다른 활용법을 제공하는 것이다.
상기 언급된 본 발명의 일곱번째 목적은 다음과 같은 기술방안을 통해 달성된다: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 살모넬라를 포함하나 단 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하기 위한 의료기기에 사용한다.
상기 기술방안을 통해 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물은 의료기기 용도로 승인 및 등록되어, 살모넬라에 따른 세균 감염 및 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 여덟번째 목적은 상기 살모넬라 파지 및 그 조합물의 다른 활용법을 제공하는 것이다.
상기 언급된 본 발명의 여덟번째 목적은 다음과 같은 기술방안을 통해 달성된다: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)및 그 조합물을 생물학적 살균제로 활용한다.
상기 기술방안을 통해 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 사료에 첨가하여 사료에 함유된 살모넬라 단, 이에 한정되지 않는 세균의 생존과 번식을 특이적, 지속적으로 퇴치할 수 있으며, 사료 보관 및 동물 사육 과정에서 살모넬라로 인한 오염 및 이에 한정되지 않은 세균 오염을 퇴치할 수 있다.
상기 내용을 요약하면, 본 발명은 다음의 유익한 기술적 효과 중 적어도 하나를 포함한다 :
1. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 내산성이 강하고 특이적으로 살모넬라의 일부 또는 전부를 사멸할 수 있어 파지 살균제의 산업적 생산을 위해 파지 균주 공급원을 제공한다.
2. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 자연계로부터 분리해낸 독성파지로 독성 실험을 통해 안전하고 부작용이 없음이 입증되었으며; 실험용 파지는 독성 유전자 또는 불량 유전자를 포함하지 않는다; 본 발명은 실험용 파지에 대하여 임의 유전적 변형을 수행하지 않았다.
3. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3는 고온 내성이 우수하여 65°C 수조에서 2시간 방치한 후에도 생존율이 80%에 달하며, 75°C 수조에서 2시간 방치한 후 106 PFU/mL의 역가를 나타낸다.
4. 본 발명에서 단독 사용되는 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 넓은 숙주 범위를 가지며; 다른 파지와 혼합해 사용하면 더 많은 살모넬라를 용해시킬 수 있고, 98% 이상의 용해율을 달성할 수 있는 보다 강한 용해성을 나타낸다.
5. 본 발명에서 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)는 비숙주 병원성 박테리아와 상호작용하며, 실험에 투여된 28개의 비숙주 병원성 박테리아 중 어느 하나도 식별할 수 없으며, 우수한 특이성을 가진다.
6. 본 발명에서 104～106 PFU/mL의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 102～103 cfu/mL 농도의 살모넬라 배지에서 상기 농도의 살모넬라에 대한 살균율이 99% 이상에 달하는 폭넓은 살균력을 나타내며, 다른 복합 사용 물질에 대한 길항 작용을 하지 않으며 화학 소독제와도 병용할 수 있다; 살모넬라 파지 SG8P3는 환경 소독에 사용되는 다양한 제품의 유효 성분으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 액체 침지, 분무, 수성 담체와의 병용 등을 포함하되 이에 한정되지 않는 형태로 급수계통, 의료시설, 양식업시설, 공공 및 민간 시설 또는 기타 환경 표면에 대한 소독 및 오염을 제거하여 표적 박테리아의 성장과 활성을 효과적으로 제어할 수 있다. 상기 액체 침지 및 분무 형태는 세제, 소독제, 오염제거제 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 상기 수성 담체는 인산염 완충액, LB 배지, 염소 유리수 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
7. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 계육 표면에 있는 살모넬라를 효과적으로 사멸하고 계육 보존 과정 중 살모넬라에 의한 오염을 방지할 수 있으며; 살모넬라 파지 SG8P3의 조합물은 계육 표면에 있는 살모넬라, 대장균, 황색포도상구균을 효과적으로 사멸할 수 있으며, 계육 등과 같은 육류 보존 과정에서 살모넬라, 대장균, 황색포도상구균의 오염을 방지할 수 있다. 다양한 식품 보호용 제품의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 본 발명은 액체 침지, 분무, 합성 성분의 병용 등, 단 이에 한정되지 않는 형태를 통해 살모넬라, 대장균, 황색포도상구균 감염으로 인한 식품 부패를 예방하며, 특히 조리된 식품 또는 살균에 적합하지 않은 식품에 적용할 수 있다; 액체 침지 및 분무 형태에는 식품 살균제, 식품 소독제, 식품 방부제 등이 포함 되나 이에 한정되지 않는다; 본 발명의 합성 성분은 벤조산, 벤조산 나트륨, 소르빈산, 소르빈산 칼륨, 프로피온산 칼슘 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
8. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorumphage SG8P3)는 조합물, 시제 또는 키트를 제조하는데 사용될 수 있으며; 살모넬라의 신속한 검출에 적용될 수 있으며, 테스트 스트립, 키트 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 형태로 표적 샘플에 함유된 살모넬라를 검출하거나 임상 샘플에서 표적 병원성 박테리아에 대한 선별을 진행할 수 있으며, 검출 감도를 효과적으로 확보할 수 있다.
9. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 생물학적 살균제, 사료 첨가제 또는 살모넬라, 대장균 및 황색포도상구균에 의한 세균 감염에 대한 치료제 및 건강식품, 의료기기 제품으로 단독 또는 혼합하여 사용될 수 있다; 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물은 살모넬라, 대장균 및 황색포도상구균에 의한 감염성 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용할 수 있다; 살모넬라, 대장균 및 황색포도상구균에 감염될 수있는 숙주에는 사람, 가축(돼지, 소, 양 등), 가금(닭, 오리, 거위 등) 및 다양한 짐승, 어류, 설치류 등이 포함된다.
10. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)는 산업 생산에 적용할 수 있고, 숙주 박테리아에 의해 특이적으로 확장될 수 있으며, 표준 바이러스 정제법을 통해 고순도화를 구현할 수 있어 양호한 성장 전망을 나타낸다. 본 업계의 당업자라면 본 발명의 기재 및 본 업계의 상식에 따라 본 발명에 기재된 살모넬라 파지 SG8P3 또는 그 조합물을 의료, 테스트, 소독 및 식품 보호 등 분야에 사용할 수 있는 다양한 제품으로 제조될 수 있다. 제품 형태는 담체 운반, 농축 주사 또는 약물 침지를 포함하나 이에 한정되지 않는 형태로 숙주 표면, 입, 직장, 흉막 내부 등 부위에 투여되어 치료할 수 있다; 일 실시예로, 담체 운반 형태는 경구 수성 담체, 경구 비수성 담체, 크림 제제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며; 농축 주사 형태는 백신 주사, 흉막 주사, 정맥 주사 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다; 약물 침지 형태는 에어로졸, 표세제 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
11. 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 본 출원의 기재 및 본 분야의 상식에 따라 바이오 약제로 제조되어, 살모넬라, 단, 이에 한정되지 않는 세균으로 인한 질병 예방 및 치료에 응용할 수 있다.
도 1은 살모넬라 파지 SG8P3 플라크 형태를 나타낸 사진.
도 2는 투과형 전자 현미경으로 관찰된 살모넬라 파지 SG8P3의 형태 구조를 나타낸 예시도.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 사용되지만, 본 발명의 유효 범위를 어떤 방식으로도 제한하지 않는다.
하기 실시예에서 균주 번호는 당사의 명명 방식에 따라 지정된 번호이다.
살모넬라 파지 SG8P3(almonella pullorum phage SG8P3), 보존 번호: CCTCC NO : M 2020205, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터(China Center for Type Culture Collection), 보존 날짜: 2020년 6월 12일.
살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 보존 번호 CCTCC NO: M2018765，보존기구 중국전형배양물보존센터, 보존 날짜: 2018년 11월 9일.
미오비리대과 BP-66 (Myoviridae sp. BP-66), 보존번호: CCTCC NO : M 2015146, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 주소: 후베이성 우한시 우창 뤄가산 우한대학, 보존 날짜: 2015년 3월 23일.
미오비리대과 BP-63 (Myoviridae sp. BP-63), 보존번호: CCTCC NO : M 2015145, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 주소: 후베이성 우한시 우창 뤄가산 우한대학, 보존 날짜: 2015년 3월 23일.
칠리키 바이러스과 BP-12（Chilikevirus sp. BP-12）, 보존번호: CCTCC NO : M 2015141, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 주소: 후베이성 우한시 우창 뤄가산 우한대학, 보존 날짜: 2015년 3월 23일.
대장균 파지 EC35P1 (Escherichia coli phage EC35P1), 보존 번호: CCTCC NO : M 2020438, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 주소: 후베이성 우한시 우창 뤄가산 우한대학, 보존 날짜: 2020년 8월 20일.
황색포도상구균 파지 J1P2 (Staphylococcus aureus phage J1P2), 보존 번호: CCTCC NO : M2016285, 보존 기구: 중국전형배양물보존센터, 주소: 후베이성 우한시 우창 뤄가산 우한대학, 보존 날짜: 2016년 5월 26일.
다음 실시예에서,
LB 액체 배지 배합: 트립톤 10g, 효모추출물 5g, 염화나트륨 10g, 증류수 1000mL, pH 7.0.
LB 고체 배지 배합: 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 10g, 한천 15g, 증류수 1000mL, pH 7.0.
반고체 한천 배지 배합: 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 10g, 한천 7g, 증류수 1000mL, pH 7.0.
SM 완충액 배합: 염화나트륨 5.8g, 황산 마그네슘 2g, 1 mol / L Tris-HCl 50mL, 젤라틴 0.25g, 증류수 1000mL.
살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대과 BP-63 (Myoviridae sp. BP-63), 미오비리대과 BP-66 (Myoviridae sp. BP-66), 칠리키 바이러스과 BP-12 (Chilikevirus sp. BP-12), 대장균 파지 EC35P1 (Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지 J1P2 (Staphylococcus aureus phage J1P2)의 조합물 1 ~조합물 9는 전부 실시예 6에 기재된 방법에 따라 제조된다.
실시예1：파지의 선별 및 정제
(1) 샘플 수집 및 처리
본 발명에 사용된 샘플은 산둥, 허난, 장쑤 지역 양식장 오수 및 인근 농지 토양으로부터 수집된다. 수집된 샘플을 5000r / min에서 10 분간 원심 분리한 후 0.22μm 여과막으로 걸러준다.
(2) 표적 살모넬라에 대한 시료내 파지의 농축
상기 여과액을 1:1의 비율로 2 배의 LB 액체 배지와 혼합하여, 100μL의 표적 살모넬라 균주를 접종한 후, 밤새 농축시켰다.
(3) 파지의 선별
상기 농축액을 원심분리하여 상층액을 취해 0.22μm의 막을 통과시킨 후 1mL를 취하여 표적 살모넬라를 함유하는 5mL의 LB 반고체 배지와 균일하게 혼합하여 LB 고체 배지가 들어있는 페트리 접시에 부어 넣은 후, 반고체 배지가 응고될 때까지 대기하며, 37°C 온도에서 밤새 배양한다. 다음날 플라크 생성 여부를 관찰하고 실험 결과를 기록한다.
(4) 파지의 정제
상기 단일 플라크를 선별 수집하여 1mL Sm완충액에 넣어 150rpm 에서 15분간 진탕하여 구배 희석 시킨 후 희석액을 취해 표적 살모넬라를 함유하는 5mL의 LB 반고체 배지와 균일하게 혼합하여 LB 고체 배지가 들어있는 페트리 접시에 부어 넣은 후, 반고체 배지가 응고될 때까지 대기하며, 37°C 온도에서 밤새 배양한다. 상기 단계를 3 ~ 5 회 반복하여 파지의 단일 클론 샘플을 수득하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)로 명명한다. 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)의 플라크 형태는 도 1과 같이 도시되어 있으며; 투과형 전자 현미경으로 관찰한 살모넬라 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)는 도 2에 도시된 바와 같이, 20면체 헤드, 길이 80~100nm, 가로지름 50~70nm , 수축성 근초, 꼬리 길이 90-110nm, 지름 15-25nm의 형태를 가진다. 상기 도면에서 SG8P3은 헤드 길이 87nm, 가로 지름 66nm, 꼬리 길이 95nm, 지름 18nm로 나타났다.
(5) 파지과립의 제조
숙주 박테리아를 사용하여 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)을 확장하여, 배지가 맑아진 후 8000g에서 10 분간 원심분리하여 불순물을 제거한 후, 고체 폴리에틸렌 글리콜 (PEG8000)을 첨가하여 최종 농도가 10% (w/v)이 되도록 교반 용해시켜, 4℃에서 하룻밤 배양하며, 4℃, 8000g 여건에서 20분간 원심분리하여, 침전물을 SM완충액에 재현탁한다. 수득한 파지 현탁액을 4℃ 온도에서 보존하여 사용을 대비한다.
실시예 2 : 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)의 최적 감염다중도 (MOI) 측정
1. 파지 계수법 : 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 샘플을 10 배의 비율로 구배 희석한 후, 100 μL의 샘플을 일정한 희석 비율로 취하여 단계(4)에 기재된 방법에 따라 플레이트를 2층으로 펴주며, 적절한 비율로 플레이트를 취하여 플라크의 수를 계산한다. 하나의 플라크는 하나의 파지 단량체를 나타낸다.
2. 살모넬라의 단일 콜로니를 선정하여 3 mL의 LB 배양액이 들어있는 시험관에 접종한 후, 37℃온도, 150rpm 여건에서 12시간 동안 진탕 배양하여 숙주균 현탁액을 수득한다.박테리아 현탁액을 1:100의 비율로 10 mL의 LB 배양액으로 옮긴 후, 37°C 온도, 150rpm 속도로 진탕하여 초기단계인 대수기까지 배양한다. 살모넬라 파지 SG8P3 순수 배양액(실시예 1에서 제조)와 숙주균 (MOI = 파지수/세균수)을 감염 다중도 비율에 따라 첨가한 후, 각 시험관의 총 부피가 동일하도록 LB 액상 배지를 첨가해 준다. 셰이커를 사용하여 37°C 온도, 150rpm에서 밤새 흔들어 배양한다. 배양 완료 후 5000g에서 10분간 원심분리한 후, 상층 액을 수집하여 파지 역가를 측정한다. 각 포인트별로 시험관 2개로 나누어 중복 배양한 후 평균치를 취하여, 최고 파지 역가를 생성한 MOI를 최적 감염 다중도로 한다. 실험은 세번 반복 진행한다.
감염 다중도별 살모넬라 파지 SG8P3의 역가
MOI SG8P3(PFU/mL) 숙주균(cfu/mL) SG8P3 역가 (PFU/mL)
1000:1 108 105 8x108
100:1 108 106 7.6x108
10:1 108 107 4.6x109
1:1 108 108 3.4x109
1:10 108 109 4x109
1:100 108 1010 6.6x109
1:1000 107 1010 2.3x1010
결과를 표 1에 나열한다. 살모넬라 파지 SG8P3의 역가가 최고치(2.3x1010 PFU/mL)에 달할때, 대응된 MOI는 1:1000이다. 이로부터 초기 투입량이 적고 번식 속도가 빨라 산업 생산에 적용할 수 있음을 알 수 있다.실시예 3 : 살모넬라 파지 SG8P3의 독성 유전자 또는 불량 유전자 결실 검출 실험
병원성 세균내부 용원성 파지에서 유래된 것으로 확인된 103개의 독성 유전자를 선별하여(표 2), 살모넬라 파지 SG8P3의 전체 게놈을 측정하고 이에 대한 생물정보학 분석을 수행하여 상기 독성 유전자를 포함하고 있는지를 확인하였다. 그 결과, 살모넬라 파지 SG8P3는 다음과 같은 독성 유전자를 포함하지 않는 것으로 나타났다. 테스트용 파지에 불량 유전자가 없었다.
병원성 박테리아 체내 용원성 파지의 알려진 주요 독성 유전자
유전자원 독성 유전자
황색포도상구균 알파 독소 (알파 라이신), 베타-리신 (베타 독소); 감마 리신 (감마 독소); 장 독소 (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). 발열성 엑소톡신 A B; 독성 쇼크 증후군 (TSST-1); 팬톤-발렌타인 류코시딘(PVL, Panton-Valentine leukocidin);
팬톤-발렌틴 류코시딘 사슬 S 전구체 포스포리파제 C 베타-독소; 감마-헤몰리신 성분 B; 감마-헤몰리신 사슬 II 전구체
독성 쇼크 증후군 독소-1
황색포도상구균 RF122 류코톡신 D 서브유닛; 류코톡신 E 서브유닛
황색포도상구균 아종. 아우레우스 MW2 알파-헤몰리신
클로스트리듐 보툴리눔 뉴로톡신 (A 내지 G); 리신; C2 독소
대장균 O157 : H7 시가유사독소 1 및 2 (SLT-1 및 2 또는 Stx-1 및 2)
대장균 III 형 세포치사팽창독소 단백질 CdtA; 세포치사팽창독소 IV 형 서브유닛 A; 헤몰리신 A
대장균 O111 : H- str. 11128 시가독소 2 서브유닛 A; 시가독소 2 서브유닛 B
대장균 APEC O1 세포치사팽창독소 IV 형 서브유닛 C
녹농균 외독소 A; 프로테아제, 류코시딘; 외독소 A 전구체; 알칼리성 프로테아제
백일해 간균 백일해 독소 (AB5 형 외독소); 2기능성 헤모리신-아데닐레이트 시클라제 전구체
바실러스 탄저균 독소(부종인자 및 치사인자)
헬리코박터 파일로리 VacA 독소
남세균 간독소 및 신경독소
코리네박테리움 디프테리아 디프테리아 독소
파상풍균 파상풍 독소; 파상풍 독소 tetX; 테타놀리신 O
프로테우스 미라빌리스 신경독소
바실러스 세레우스 세레우스용혈독소; 장 독소; 알베올리신
지하적리균 시겔라 독소 (시가독소); 시가독소 서브유닛 A
클로스트리듐 디피실리균 독소 A; 독소 B; 독소 B - 세포독소
레지오넬라 뉴모필라 세포용해소
비브리오 콜레라 콜레라 독소
비브리오 콜레라 O395 폐쇄 조나 독소
비브리오 콜레라 RC385 보존성 가상 단백질 - 독소
화농성연쇄상구균 스트렙톨리신 S; 발적독소
코리네파지 오메가 디프테리아 독소
코리네파지 베타 디프테리아 독소
궤양성 코리네박테리움 디프테리아 독소
슈도모나스 파지 phiCTX 세포 독소
이겔라 이질균 Sd197 시가 독소 서브유닛 B 전구체
클로스트리듐 보툴리눔 C2 독소, 성분 I; C2 독소, 성분 II; BoNT / G; BoNT / F
클로스트리듐 보툴리눔 B1 보툴리눔 신경독소 B형
클로스트리듐 파지 c-st 보툴리눔 신경독소 C1형 전구체
클로스트리듐 보툴리눔 E3 보툴리눔 신경독소 E3형, BoNT / E3
클로스트리듐 보툴리눔 F 보툴리눔 신경독소 A1형
클로스트리듐 파지 D-16 파이 D형 신경독소
클로스트리듐 보툴리눔 D str. 1873 테타놀리신 O
프로테우스 미라빌리스 HI4320 독소
프로테우스 미라빌리스 ATCC 29906 독소; 독소
포도상구균 파지 PVL LukF-PV
예시니아 페스티스 CA88-4125 독소
측포단간균 Isp2b 단백질
아포간균(weihenstephanensis) 델타 내독소 중앙 영역 서브그룹 1
바실러스 투링겐시스 살충결정단백질 cry1Bc
클로스트리듐 노비 NT 포스포리파제 C 전구체 (PLC)
클로스트리듐 노비 알파 독소
클로스트리듐 퍼프린젠스 ATCC 13124 퍼프린고리신 O
클로스트리듐 퍼프린젠스 SM101 포스포리파제 C
클로스트리듐 퍼프린젠스 str. 13 콜라게나제
클로스트리듐 퍼프린젠스 장 독소; 델타 독소
클로스트리듐 퍼프린젠스 B str. ATCC 3626 베타 독소엡실론 독소
클로스트리듐 셉티쿰 알파 독소
클로스트리디움 소르델리 포스포리파제 C
리스테리아 모노사이토제네시스 클립81459 리스테리오리신 O 전구체
폐렴 연쇄상구균 TIGR4 용혈소
탄저균 가상 단백질 pxo1_122 부종 인자
탄저균 str. A2012 치사인자
백일해 간균 I형 추정 독소; 독소 서브유닛 2; 독소 서브유닛 3
프로파지 CP-933V 프로파지 CP-933V 내에 암호화 된 시가유사독소 1 서브 유닛 A; 프로파지 CP-933V 내에서 암호화 된 시가유사독소 1 서브 유닛
비브리오 미미쿠스 VM573 열 불안정성 용혈소
아에로모나스 하이드로필라 서브스프 하이드로필라 ATCC 7966 용혈소
화농성연쇄상구균 MGAS10394 스트렙톨리신 O
화농성연쇄상구균 유사 분열 외독소 Z 전구체
화농성연쇄상구균 파지 5005.1 장 독소 A 형
화농성연쇄상구균 MGAS6180 외독소 J 형 전구체
연쇄상구균 파지 370.3 연쇄상구균 외독소 H 전구체
화농성연쇄상구균 M1 GAS 외독소 G 전구체
이퀴시밀리스 연쇄상구균 GGS_124 추정성 각질 제거 독소
예르시니아 엔테로콜리티카 내열성 장 독소; 내열성 장 독소 B 형
본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3는 독성 유전자 또는 불량 유전자를 함유하지 않으며, 이 중 함유하지 않는 독성 유전자 또는 불량 유전자란 표 2에 기재된 독성 유전자 또는 불량 유전자를 의미한다.실시예 4: 독성실험
수컷 반, 암컷 반으로 구성된 실험용 쥐 20 마리를 3일간 적응성 사육한 후 무작위로 2개 군(파지군과 대조군), 각군 당 10마리(수컷 5 마리, 암컷 5 마리)로 나뉘어, 파지군에 1010 pfu/kg을 계량단위로 하는 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)를 투여하고, 대조군은 동일한 양의 생리 식염수를 투여하여, 이와 같은 실험을 연속 15일간 진행한 후, 쥐의 목을 잘라 생명을 중지시켜, 체내 장기를 검사하였다.
실험 결과를 보면, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)의 이와 같은 투여량은 쥐의 일상 행위에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.체내 장기에 대한 해부학적 검사에서 이상이 발견되지 않았다. 이를 통해 본 발명의 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 생물학적 안전성이 갖추었며 사료 첨가제로 적용가능함을 알 수 있다. 본 독성 실험을 통해 살모넬라 파지 SG8P3의 안전성을 입증하였으며, 이를 건강제품이나 의약품으로도 사용할 수 있음은 자명한 것이다.
실시예 5: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)의 열안전성 실험
1. 파지 계수법 : 실시예 2에 기재된 방법과 동일하다.
2. 역가가 5x109PFU/mL인 파지 순수 배양액(실시예 1에서 제조)을 각각 500μL씩 취하여 멸균 EP 튜브에 각각 넣은 후, 온도가 각각 25°C(CK), 55°C, 65°C, 75°C인 수조에 방치하여 2시간, 24시간, 48시간 동안 작용 시킨다. 작용시간이 끝나면 샘플 튜브를 꺼내어 즉시 얼음 욕조에 넣어 식힌 후, 적절하게 희석하여 이중층 플레이트법을 사용하여 파지 역가를 측정한다. 실험은 세 번 반복 진행한다.
온도별 살모넬라 파지 SG8P3 역가
시간 파지 역가 (PFU/mL)
55℃ 65℃ 75℃ CK
2h 5x109 4.0x109 8x106 5x109
24h 9.5x108 4.8x107 7x103 5x109
48h 2.4x108 2.6x106 0 4.9x109
그 결과를 표 3에 나열한다. 실험군의 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 55℃에서 더 쉽게 생존하는 것으로 나타났다. 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 우수한 내열성을 나타냈고, 대조군과 비교해 보면 65°C 수조에서 2시간 동안 방치한 후 생존율은 80%의 높은 수치를 나타냈고, 75°C 수조에서 2시간 동안 방치한 후의 역가는 106 PFU/mL을 나타냈다.실시예 6 : 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)가 살모넬라균에 대한 용해 범위 실험 및 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1)의 조합물에 대한 제조 및 용해 범위 실험은
점적법을 사용하여 파지의 용해 스펙트럼을 측정한다. 살모넬라 균주를 다량 선택하여, 살모넬라가 함유된 LB 반고체 배지 5mL를 균일하게 혼합하여 LB 고체 배지가 들어있는 페트리 접시에 각각 부어넣어 반고체 배지가 응고된 후 실시예 1에 기재된 방법으로 분리해 낸 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)로 점적한다.
살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1) 원액의 제조: 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1의 숙주균을 500mL의 LB 배지가 들어있는 삼각 플라스크에 접종한 다음, 37°C, 150rpm에서 OD값이 0.2로 될 때까지 진탕 배양한 후, 1000PFU/mL 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1)을 첨가하고, 37°C, 150rpm에서 진탕하면서 12시간 동안 배양한다.발효액을 8000rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 0.22μm 여과막으로 여과하여 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 원액을 수득한다.
살모넬라 파지 EC35P1(Salmonella pullorum phage EC35P1) 원액의 제조: 대장균 파지 EC35P1 숙주균을 500mL의 LB 배지가 들어 있는 삼각 플라스크에 접종한 다음, 37°C, 150rpm에서 OD값이 0.2이 될 때까지 진탕 배양한 후, 1000PFU/mL 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)을 첨가하고, 37°C, 150rpm에서 진탕하면서 12시간 동안 배양한다.발효액을 8000rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 0.22μm 여과막으로 여과하여 대장균 파지 EC35P1원액을 수득한다.
황색포도상구균 파지 J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2) 원액의 제조: 황색포도상구균 파지 J1P2 숙주균을 500mL의 LB 배지가 들어 있는 삼각 플라스크에 접종한 다음, 37°C, 150rpm에서 OD값이 0.2이 될 때까지 진탕 배양한 후, 1000PFU/mL 황색포도상구균 파지 J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)을 첨가하고, 37°C, 150rpm에서 진탕하면서 12시간 동안 배양한다.발효액을 8000rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 0.22μm 여과막으로 여과하여 황색포도상구균 파지 J1P2 원액을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum 파지 SG4P1)의 두 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)와 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1)의 1:1 조합물 (조합물 1)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1) 및 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) 세 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1) 및 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) 의 1:1:1 조합물 (조합물 2)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1) 및 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 세 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1) 및 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 의 1:1:1 조합물 (조합물 3)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12) 세 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12)의 1:1:1 조합물 (조합물 4)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) 및 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 네개의 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) 및 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 의 1:1:1:1 조합물 (조합물 5)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. Bp-12) 네개의 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12)의 1:1:1:1 조합물 (조합물 6)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12) 네개의 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12)의 1:1:1:1 조합물 (조합물 7)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63), 미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12) 다섯 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 미오비리대 BP-63(Myoviridae sp. BP-63) ,미오비리대 BP-66(Myoviridae sp. BP-66) 및 칠리키 바이러스과 파지 BP-12(Chilikevirus sp. BP-12)의 1:1:1:1:1 조합물 (조합물 8)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2) 네개의 파지 균주 원액을 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1 (Salmonella pullorum phage SG4P1), 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2)의 1:1:1:1 조합물(조합물 9)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)와 최종농도가 0.05%인 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드를 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여 1:1의 조합물(조합물 10)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)와 최종농도가 0.01%인 브로모게라민를 각각 동등 부피로 취해 균일하게 혼합하여 1:1의 조합물(조합물 11)을 수득한다.
역가가 1x108 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3), 최종농도가 0.05%인 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드,최종농도가 0.01%인 브로모게라민을 각각 동등 부피로 취해 3자를 균일하게 혼합하여 1:1:1의 조합물(조합물 12)을 수득한다.
34개의 혈청형에 속하는 160 개의 살모넬라 균주의 단일 콜로니를 선별하여 3mL의 LB가 들어있는 시험관에 접종하고, 160rpm에서 8시간 동안 배양하여 각 균주의 세균 용액을 수득한다.300μL의 세균 현탁액을 반고체 배지와 혼합하여 일반 한천 플레이트 상에 펴 바른다. 살모넬라 파지 SG8P3 배양액 10μL 및 그 조합물 1~8의 배양액을 취하여 플레이트 상의 상이한 위치에 점적한다. 시료 첨가 시, 각 파지의 배양액은 실험 결과에 영향주지 않도록 상호간의 접촉을 피해야 한다. 자연 풍건 후 37°C에서 6 ~ 8 시간 동안 배양하여 결과를 관찰한다. 실험은 세 번 반복한다.
표 4에 나열한 실험결과를 보면, 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 넓은 숙주 범위를 가지고 있음을 알 수 있다. 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 153개의 살모넬라 균주를 용해시킬 수 있으며, 95.6%의 용해율을 나타낸다. 이와 비교해 보면, SG8P3의 조합물 배양액은 일반적으로 적어도 157개의 살모넬라 균주를 식별 할 수 있으며, 용해율은 적어도 98%을 달성할 수 있다. 이를 통해, 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 숙주 범위가 넓고, 다양한 혈청형에서 내원되는 살모넬라를 식별 가능함 알 수 있다. 또한, SG8P3의 조합물은 단일 파지를 사용할 때 나타내는 숙주 스펙트럼이 제한적인 단점을 보완해 줄 수 있어 파지 치료 상 큰 응용 잠재력을 나타낸다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 조합물의 용해 스펙트럼 측정 결과
균주번호 균주명 및 라틴어명 혈청군 항원식（O:HI:HII） SG8P 3 조합물1 조합물2 조합물3 조합물4 조합물5 조합물6 조합물7 조합물8
SA1 살모넬라 티피S.Typhi D 9,12,Vi:d:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA2 살모넬라 티피S. Typhi D 9,12,Vi:d:- + + + + + + + + +
SA5 살모넬라 티피S. Typhi D 9,12,Vi:d:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA9 살모넬라 티피S. Typhi D 9,12,Vi:d:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA10 살모넬라 티피S. Typhi D 9,12,Vi:d:- + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA15 살모넬라 더블린S.Dublin D 1,9,12,Vi:g,p:- + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA16 살모넬라 콜레라수이스S.Choleraesuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA22 살모넬라 콜레라수이스S.Choleraesuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA26 살모넬라 콜레라수이스S.Choleraesuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA30 살모넬라 티피수이스S. Typhisuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA36 살모넬라 티피수이스S. Typhisuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA46 살모넬라 콜레라수이스S.Choleraesuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA61 살모넬라 콜레라수이스S. Choleraesuis C1 6,7:c:1,5 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA66 살모넬라 티피수이스S. Typhisuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA68 살모넬라 티피수이스S.Typhisuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA71 살모넬라 티피수이스S. Typhisuis C1 6,7:c:1,5 + + + + + + + + +
SA77 살모넬라 티피수이스S. Typhisuis C1 6,7:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA82 살모넬라 파라티피 AS. Paratyphi A A 1,2,12:a:1,5 - + + + + + + + +
SA83 살모넬라 파라티피 AS. Paratyphi A A 1,2,12:a:1,5 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA89 살모넬라 더블린S.Dublin D 1,9,12,Vi:g,p:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA91 살모넬라 더블린S.Dublin D 1,9,12,Vi:g,p:- + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA95 살모넬라 파라티피 AS.ParatyphiA A 1,2,12:a:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA101 살모넬라 파라티피 AS. Paratyphi A A 1,2,12:a:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA10 5 살모넬라 파라티피 CS. Paratyphi C C1 6,7,Vi:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA11 6 살모넬라 델비S. Derby B 1,4,5,12:f,g:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA11 7 살모넬라 델비S.Derby B 1,4,5,12:f,g:1,2 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA11 8 살모넬라 델비S. Derby B 1,4,5,12:f,g:1,2 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA12 0 살모넬라 파라티피 CS. Paratyphi C C1 6,7,Vi:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA12 3 살모넬라 파라티피 CS. Paratyphi C C1 6,7,Vi:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA12 4 살모넬라 파라티피 CS. Paratyphi C C1 6,7,Vi:c:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA12 5 살모넬라 II Salmonella II D 1,9,12:g,m,s,t: 1,5,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA13 1 살모넬라 타시S. Tarshyne D 9,12:d:1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA13 2 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA13 4 살모넬라 타시S. Tarshyne D 9,12:d:1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA13 7 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA14 2 살모넬라 IISalmonellaII D 1,9,12:g,m,s,t: 1,5,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA14 5 살모넬라 II Salmonella II D 1,9,12:g,m,s,t: 1,5,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA14 7 살모넬라 리딩S. Reading B 1,4,5,12:e,h:1, 5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA14 8 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SA14 9 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D2 살모넬라 사오S. Sao E4 1,3,19:e,h:e,n,z 15 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D5 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D6 살모넬라 베네치아S. Veneziana F 11:i:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D7 살모넬라 베네치아S. Veneziana F 11:i:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D11 살모넬라 리딩S. Reading B 1,4,5,12:e,h:1, 5 - - + - - + + - +
SAS D13 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D14 살모넬라 보비스모비피칸스S. Bovismorbificans C2 6,8,20:r,i:1,5 - - - - - - - - -
SAS D22 살모넬라 리딩S. Reading B 1,4,5,12:e,h:1, 5 + + + + + + + + +
SAS D23 살모넬라 베네치아S. Veneziana F 11:i:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D27 살모넬라 베네치아S. Veneziana F 11:i:e,n,x + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D28 살모넬라 사오S. Sao E4 1,3,19:e,h:e,n,z 15 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D33 살모넬라 사오S. Sao E4 1,3,19:e,h:e,n,z 15 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D35 살모넬라 파라티피 BS. Paratyphi B B 1,4,5,12:b:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D36 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D15 살모넬라 파라티피 BS. Paratyphi B B 1,4,5,12:b:1,2 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D45 살모넬라 파라티피 BS. Paratyphi B B 1,4,5,12:b:1,2 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D47 살모넬라 파라티피 BS. Paratyphi B B 1,4,5,12:b:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D49 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D59 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D60 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D64 살모넬라 엔테리티디스S.Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D67 살모넬라 아보르투스퀴S. Abortusequi B 4,12:-:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D71 살모넬라 아보르투스퀴S. Abortusequi B 4,12:-:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D72 살모넬라 갈리나룸-풀로루 mS. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D73 살모넬라 아보르투스퀴S. Abortusequi B 4,12:-:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D74 살모넬라 갈리나룸-풀로루 mS. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D75 살모넬라 갈리나룸-풀로루S. Gallinarum-Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D78 살모넬라 갈리나룸-풀로루 mS. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D81 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D88 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D89 살모넬라 아보르투스퀴S. Abortusequi B 4,12:-:e,n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D90 살모넬라 갈리나룸-풀로루S. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D110 살모넬라 갈리나룸-풀로루S. Gallinarum- Pullorum D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D114 살모넬라 갈리나룸-풀로루 mS. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- - - - - - - - - -
SAS D115 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D118 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D120 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D121 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D122 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 + + + + + + + + +
SAS D123 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D135 살모넬라 갈리나룸-풀로루S. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D136 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D137 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D141 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAS D142 칠면조 살모넬라S. Meleagridis E1 3,10,15,34:e,h: 1,w + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N1 칠면조 살모넬라S. Meleagridis E1 3,10,15,34:e,h: 1,w ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N2 살모넬라 스탠리S. Stanley B 1,4,5,12,27:d:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N5 칠면조 살모넬라S. Meleagridis E1 3,10,15,34:e,h: 1,w ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N14 살모넬라 스탠리S. Stanley B 1,4,5,12,27:d:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N15 살모넬라 아고나S. Agona B 1,4,5,12:f,g,s:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N16 살모넬라 스탠리S. Stanley B 1,4,5,12,27:d:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N27 칠면조 살모넬라S.Meleagridis E1 3,10,15,34:e,h: 1,w ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N28 살모넬라 스탠리S. Stanley B 1,4,5,12,27:d:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N29 칠면조 살모넬라S. Meleagridis E1 3,10,15,34:e,h: 1,w ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N30 살모넬라 아고나S. Agona B 1,4,5,12:f,g,s:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N41 칠면조 살모넬라S. Meleagridis E1 3,10,15,34:e,h: 1,w ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N42 살모넬라 리젠트S. Regent E1 3,10:f,g,s:1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N43 살모넬라 아고나S. Agona B 1,4,5,12:f,g,s:1 ,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N68 살모넬라 리젠트S. Regent E1 3,10:f,g,s:1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N69 살모넬라 아고나S. Agona B 1,4,5,12:f,g,s:1 ,2 - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N70 살모넬라 아고나S. Agona B 1,4,5,12:f,g,s:1 ,2 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N81 살모넬라 바르도S. Bardo C3 8:e,h:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N82 살모넬라 바르도S. Bardo C3 8:e,h:1,2 + + + + + + + + +
SAH N93 살모넬라 리젠트S.Regent E1 3,10:f,g,s:1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N94 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N95 살모넬라 갈리나룸-풀로루 mS. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N106 살모넬라 바르도S. Bardo C3 8:e,h:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N107 살모넬라 리젠트S.Regent E1 3,10:f,g,s:1,6 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N108 살모넬라 리젠트S. Regent E1 3,10:f,g,s:1,6 + + + + + + + + +
SAH N109 살모넬라 인판티스S. Infantis C1 6,7,14:r:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N130 살모넬라 인판티스S. Infantis C1 6,7,14:r:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N131 살모넬라 인판티스S. Infantis C1 6,7,14:r:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N132 살모넬라 바르도S. Bardo C3 8:e,h:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N133 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N134 살모넬라 갈리나룸-풀로루 mS. Gallinarum- Pulloru m D 1,9,2:-:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N135 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N136 살모넬라 체스터S. Chester B 1,4,5,12:e,h:e, n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N141 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N142 살모넬라 티피무리움S.Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N143 살모넬라 체스터S. Chester B 1,4,5,12:e,h:e, n,x ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N144 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAH N145 살모넬라 티피무리움S.Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 - + + + + + + + +
SAJS 1 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 2 살모넬라 켄터키S. Kentucky C3 8,20:i:z6 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 6 살모넬라 켄터키S. Kentucky C3 8,20:i:z6 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 8 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 15 살모넬라 체스터S. Chester B 1,4,5,12:e,h:e, n,x + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 16 살모넬라 체일레이S. Chailey C2 6,8:z4,z23:e,n,z1 5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 41 살모넬라 체스터S. Chester
S.Chester 		B 1,4,5,12:e,h:e, n,x + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 42 살모넬라 티피무리움S.Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 43 살모넬라 티피무리움S. Typhimurium B 1,4,5,12:i:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 54 살모넬라 체일레이S. Chailey C2 6,8:z4,z23:e,n,z1 5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 55 살모넬라 켄터키S. Kentucky C3 8,20:i:z6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 66 살모넬라 체일레이S. Chailey C2 6,8:z4,z23:e,n,z1 5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 67 살모넬라 센다이S. Sendai D 1,9,12:a:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 68 살모넬라 리센S. Rissen C1 6,7,14:f,g:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 69 살모넬라 체일레이S.Chailey C2 6,8:z4,z23:e,n,z1 5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 94 살모넬라 센다이S. Sendai D 1,9,12:a:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 95 살모넬라 체일레이S. Chailey C2 6,8:z4,z23:e,n,z1 5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 96 살모넬라 센다이S. Sendai D 1,9,12:a:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 107 살모넬라 센다이S. Sendai D 1,9,12:a:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 108 살모넬라 세럼반S. Seremban D 9,12:i:1,5 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 119 살모넬라 세럼반S. Seremban D 9,12:i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 120 살모넬라 브렌돈루프S.Braenderup C1 6,7,14:e,h:e,n,z 15 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 121 살모넬라 브렌돈루프S. Braenderup C1 6,7,14:e,h:e,n,z 15 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 122 살모넬라 브렌돈루프S.Braenderup C1 6,7,14:e,h:e,n,z 15 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 123 살모넬라 세럼반S.Seremban D 9,12:i:1,5 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 134 살모넬라 아나툼S. Anatum E1 3,10,15,34:e,h: 1,6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 135 살모넬라 리센S. Rissen C1 6,7,14:f,g:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 136 살모넬라 리센S. Rissen C1 6,7,14:f,g:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 137 살모넬라 뮌헨S. Muenchen C2 6,8:d:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 138 살모넬라 리센S. Rissen C1 6,7,14:f,g:- + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 139 살모넬라 뮌헨S. Muenchen C2 6,8:d:1,2 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 140 살모넬라 리센S. Rissen C1 6,7,14:f,g:- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 141 살모넬라 타코라디S. Takoradi C2 6,8:i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 142 살모넬라 뮌헨S.Muenchen C2 6,8:d:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 143 살모넬라 뮌헨S. Muenchen C2 6,8:d:1,2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 144 살모넬라 엔테리티디스S. Enteritidis D 1,9,12:g,m:1,7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 145 살모넬라 타코라디S.Takoradi C2 6,8:i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
SAJS 30 살모넬라 타코라디S. Takoradi C2 6,8:i:1,5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
합계 (용해 가능한 균주수 / 총 균주수) 153/1 60 157/1 60 158/16 0 157/16 0 157/160 158/160 158/16 0 157/16 0 158/16 0
참고: ++: 완전히 용해됨, 플라크가 매우 투명함 +: 완전히 용해됨, 플라크가 투명함;-: 용해되지 않음.실험 결과: 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물은 지역별, 혈청형별 살모넬라 균주에 대해 비교적 우수한 살균력을 나타냈으며, 이를 통해 살모넬라 파지 SG8P3는 넓은 용해 스펙트럼을 갖췄고, 양식업에서 항체 대체용으로 선택 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7: 살모넬라 파지 SG8P3이 비숙주 병원성 박테리아에 대한 용해성 실험
B군 연쇄상구균과 유즙분비이상 연쇄상구균 등을 포함한 28 개의 비숙주 병원성 박테리아 단일 균락을 선별하여 3mL의 TSB가 들어있는 시험관에 각각 접종한 후, 37°C, 160rpm에서 8시간 동안 진탕 배양하여 각 균주별 세균액을 수득한다. 300μL의 실험용 세균 현탁액을 취하여 각각 5mL의 TSB 반고체 배지와 혼합하여 TSA 한천 플레이트 위에 펴준다. 살모넬라 파지 SG8P3의 파지 용액(실시 예1에서 제조) 10μL를 취해 플레이트 상에 점적하여, 자연 풍건 후 37°C에서 18~24시간 동안 배양하여 결과를 관찰한다. 실험은 세 번 반복한다.
실험 결과를 보면, 살모넬라 파지 SG8P3는 28개의 실험용 비숙주 병원성 박테리아 중 어느 하나도 식별할 수 없음을 알 수 있다(표 5).실험용 파지는 숙주 특이성이 강하고 미생물 군락에 손상 주지 않음을 알 수 있다.
살모넬라 파지 SG8P3이 비숙주 병원성 박테리아에 대한 용해성 실험
비숙주 병원성 박테리아 세균번호 SG8P3
B군 연쇄상구균
Streptococcus agalactiae 		W1 -
W2 -
W4 -
W8 -
유즙분비이상 연쇄상구균
Streptococcus dysgalactiae 		T2 -
T4 -
T6 -
T8 -
녹농균
Pseudomonas aeruginosa 		TL2 -
TL4 -
TL6 -
TL8 -
TL10 -
폐렴간균
Klebsiella pneumoniae 		K2 -
K6 -
K8 -
K10 -
아시네토박터 바우마니
Acinetobacter baumannii 		B3 -
B6 -
B9 -
황색포도상구균
Staphylococcus aureus 		JP1 -
JP13 -
JP15 -
JP22 -
대장균
Escherichia coli 		D1 -
D10 -
D15 -
D27 -
실시예 8 : 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물의 액체내 살균 효과1. 살모넬라 계수법 (역가)
BS 살모넬라의 선택성 배지를 사용하여 희석 도포법을 통해 박테리아 수를 계산한다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 흑색 금속광택을 띤 균락은 양성을 나타냈다.
2. 살모넬라 파지 SG8P3의 액체내 살균 효과 실험
살모넬라를 대수 성장기까지 배양하고, 다수 시험관에 나누어 부어넣고, 살모넬라의 최종 농도가 1000cfu/mL로 될 때까지 동등 체적의 액체 LB 배지로 세균용액을 희석한 후, 농도가 다른 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) (실시예 1에서 제조)를 접종하여, 샘플에 함유된 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)의 농도가 각각 1x102 PFU/mL, 1x103 PFU/mL, 1x104 PFU/mL, 1x105 PFU/mL, 1x106 PFU/mL로 되게 한다. 동시에, 대조군과 공백군(CK)을 설정하여, 대조군은 최종농도가 1x103 cfu/mL인 살모넬라를 투여하고; 공백군은 동일 양의 생리 식염수를 투여한다. 4시간 후 살모넬라 잔량을 검출한다. 실험 결과를 표 6에 나열한다.
농도별 살모넬라 파지 SG8P3의 액체내 살균 효과
시간 살모넬라균 최종농도(cfu/mL)
1x102
PFU/mL
파지 SG8P3		 1x103
PFU/mL
파지 SG8P3		 1x104
PFU/mL
파지 SG8P3		 1x105
PFU/mL
파지 SG8P3		 1x106
PFU/mL
파지 SG8P3
대조군
CK
0h 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 0
2h 6.3x102 5.2x102 4.1x102 3.1x102 1.8x102 7.6x105 0
4h 1.2x102 1.1x102 98 80 43 6.4x108 0
표 6의 테스트 결과를 보면, 살모넬라 파지 SG8P3의 농도가 104～106 PFU/mL일 때 액체 LB배지에서 살모넬라에 대한 파지 SG8P3의 살균 효과가 가장 좋고 사멸율이 99%이상으로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해 살모넬라 파지 SG8P3가 생물학적 살균제로서의 잠재력을 갖고 있음을 알 수 있다.3. 고농도 살모넬라 파지 SG8P3 조합물의 액체내 살균 효과 실험I
살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phageSG8P3) 조합물1~조합물8 및 조합물10~ 조합물12, 제조법은 실시예 6에 기재한다.
살모넬라를 대수 성장기까지 배양하여, 다수 시험관에 나누어 부어넣고, 살모넬라 최종 농도가 1x103 cfu/mL가 되도록 액체 LB 배지로 박테리아 용액을 희석한 후, 최종농도가 1x106 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)의 조합물 1~조합물 8 및 조합물 10~조합물 12을 접종한다. 대조군과 공백군(CK)을 설정하여, 대조군에 최종농도가 1x103cfu/mL인 살모넬라를 투여하고, 공백군은 동일 양의 생리 식염수를 투여한다. 4시간 후 살모넬라균 잔량을 검출하며, 검출법은 본 실시예의 1단계를 참조한다. 실험 결과는 표 7에 나열한다.
고농도 살모넬라 파지 SG8P3 조합물의 액체내 살균 효과
시간 살모넬라균 최종농도(cfu/mL)
조합
물 1		 조합
물 2		 조합
물 3		 조합
물 4		 조합
물 5		 조합
물 6		 조합
물 7		 조합
물 8		 조합
물 10		 조합
물 11		 조합
물 12		 대조군 CK
0h 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 1x103 0
2h 1.6x102 1.7x102 1.6x102 1.2x102 98 1.1x102 97 89 1.6x102 1.6x102 1.5x102 7.6x105 0
4h 40 40 41 39 35 31 33 28 42 41 41 6.4x108 0
표 7 실험 결과를 보면, 살모넬라 파지 SG8P3의 농도가 1x106 PFU/mL의 고농도인 경우,이를 함유한 조합물은 살균 효과가 좋을뿐만 아니라 다른 조합성분에 대한 길항 작용이 없으며, 화학적 살균 물질과 결합하여 사용할 수 있음을 나타낸다.이와 같은 결과를 통해 살모넬라 파지 SG8P3의 조합물은 생물학적 살균제로서의 잠재력을 갖고 있음을 알 수 있다.실시예 9 : 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물을 사용하여 병아리 사육 과정에서 살모넬라 감염의 예방 및 제어하는데 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물 1 ~ 조합물 8의 제조법은 실시예 6를 참조한다.
실험용 병아리 550 마리를 3일간 적응 적으로 사육한 후, 무작위로 그룹 당 50 마리씩, 11개 그룹으로 나눈다.각 실험군에 용량이 1x108 PFU/kg인 실험용 파지와 1x108cfu/kg의 살모넬라 투여; 대조군에 1x108cfu/kg의 살모넬라 투여; 공백군은 동일 양의 생리 식염수를 투여하며, 15일간 연속 투여한다. 병아리의 일상 성장상황 및 생존율 통계결과는 표 8을 참조한다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물이 병아리 생존율에 미치는 영향
시간 파지SG8P3그룹 조합물1 조합물2 조합물3 조합물4 조합물5 조합물6 조합물7 조합물8 대조군 공백군
1d 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 98% 100%
2d 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 80% 100%
3d 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 60% 100%
4d 98% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 48% 100%
5d 98% 98% 98% 98% 98% 100% 100% 100% 100% 42% 100%
6d 96% 98% 97% 98% 98% 99% 99% 99% 100% 36% 100%
7d 94% 97% 97% 98% 97% 98% 99% 99% 100% 20% 100%
8d 92% 97% 96% 97% 97% 97% 98% 98% 100% 0% 100%
9d 92% 96% 96% 97% 97% 97% 97% 97% 100% 0% 100%
10d 90% 96% 95% 96% 95% 96% 95% 96% 100% 0% 100%
11d 88% 94% 94% 95% 95% 95% 95% 96% 98% 0% 100%
12d 86% 92% 90% 91% 91% 92% 92% 93% 98% 0% 100%
13d 84% 90% 88% 89% 90% 90% 90% 93% 96% 0% 99%
14d 82% 88% 86% 87% 87% 87% 88% 89% 96% 0% 97%
15d 79% 86% 84% 84% 83% 87% 87% 86% 95% 0% 95%
표 8를 보면, 대조군 병아리에 설사와 풀로럼이 다량 발생했고, 실험 7일만에 병아리 전부가 사망하는 결과가 나왔다.공백군의 생존율은 95% 였고; 살모넬라 파지 SG8P3만 투여한 병아리의 생존율은 79%; 살모넬라 파지 SG8P3 조합물 8을 투여한 병아리의 생존율은 95%; 기타 조합물을 투여한 병아리의 생존율도 83% 이상을 보여, 살모넬라 파지 SG8P3를 기타 성분과 조합하여 사용할 수 있으며, 관련 성능은 영향 받지 않음을 알 수 있다. 이와 같은 테스트를 통해 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phageSG8P3) 및 그 조합물은 생물학적 살균제 또는 사료 첨가제로 사용되어, 닭 양식 과정에서 발생할 수 있는 살모넬라 감염을 효과적으로 퇴치할 수 있음을 알 수 있다.실시예 10: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 사용한 보존 중 계육샘플에 대한 살모넬라 오염의 방지
1. 파지 계수법 : 실시예 2에 기재된 방법과 동일하다.
2. 파지 계수법 : 실시예 8에 기재된 방법과 동일하다.
3.살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물 1 ~ 조합물 8의 제조법은 실시예 6를 참조한다.
4. 고압 증기로 멸균한 닭 가슴살로 1cm 크기의 정사각형 조각 165개를 잘라내어 그룹 당 15조각씩 11개 그룹(단일 파지 SG8P3 그룹, 조합물 1~ 조합물 8, 대조군 및 공백군)으로 나누어, 멸균 페트리 접시에 방치한다. 실험군은 샘플 조각 당 1x105 cfu의 살모넬라 및 용량이 1x108 PFU / kg인 시험용 파지를 접종하며; 대조군은 샘플 조각 당 1x105 cfu의 살모넬라 및 동일 양의 멸균 수를 투여하며; 공백군은 동일 양의 멸균 식염수를 투여한다. 처리된 각 샘플을 온도가 37°C 인큐베이터에 방치하여 배양한다. 2시간 간격으로 계육 한 조각씩 취하여 10mL의 멸균수에 넣고 충분히 진탕하여, 액체에 함유된 살모넬라의 함량을 측정하며 실험을 3 회 반복 진행한다. 실험 결과는 표 9에 나열한다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물이 보존 중 계육샘플에 대한 살모넬라 오염 방지효과
시간 살모넬라균 최종농도(cfu/mL)
파지 SG8P3 그룹 조합물1 조합물2 조합물3 조합물4 조합물5 조합물6 조합물7 조합물8 대조군 공백군
0h 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 0
2h 7.6x103 6.5x103 6.6x103 5.3x103 5.2x103 4.6x103 4.7x103 4.8x103 3.8x103 4x106 0
4h 5.5x103 4.1x103 3.2x103 2.3x103 8.9x102 8.6x102 9.6x102 8.9x102 8.8x102 8x107 0
6h 3.9x102 3.7x102 3.5x102 3.9x102 4x102 3.8x102 2.5x102 2.1x102 1.2x102 6.7x108 0
8h 92 89 89 86 90 76 71 66 64 8.6x109 0
표 9에 명시된 결과를 보면. 접종하여 8시간 후 대조군 계육 표면에 다량 살모넬라가 번식한데 반해; 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물을 첨가한 각 실험군의 계육 표면 살모넬라 수량은 지속적으로 매우 낮은 수준에서 통제되고 있음을 알수 있다. 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물은 계육 표면의 살모넬라를 효과적으로 사멸할 수 있고, 계육 보존 중에 살모넬라 오염을 방지하기 위한 생물학적 살균제로 사용될 수 있다.실시예 11: 병아리 양식 과정에 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물을 사용한 대장균 감염 방지 효과
살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1), 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2) 원액의 제조법 및 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물 8~조합물9에 대한 제조법은 전부 실시예 6을 참조한다.
실험용 병아리 350 마리를 3일간 적응 적으로 사육한 후, 무작위로 그룹 당 50 마리씩, 7개 그룹으로 나눈다.각 실험군에 1x108 PFU/kg의 실험용 파지와 1x108cfu/kg의 대장균 투여; 대조군에 1x108cfu/kg의 대장균 투여; 공백군은 동일 양의 생리 식염수를 투여하며, 15일간 연속 투여한다. 병아리의 일상 성장상황 및 생존율 통계결과는 표 10을 참조한다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물이 병아리 생존율에 미치는 영향
시간 파지 SG8P3 그룹 파지 EC35P1그룹 파지 J1P2그룹 조합물8 조합물9 대조군 공백군
1d 98% 100% 97% 98% 100% 98% 100%
2d 92% 100% 90% 93% 100% 90% 100%
3d 73% 100% 70% 78% 100% 68% 100%
4d 58% 100% 51% 60% 100% 46% 100%
5d 44% 100% 42% 49% 100% 33% 100%
6d 40% 99% 37% 41% 100% 13% 100%
7d 34% 99% 27% 35% 100% 7% 100%
8d 22% 99% 16% 28% 99% 0% 100%
9d 12% 97% 11% 16% 99% 0% 100%
10d 10% 97% 7% 11% 99% 0% 100%
11d 5% 95% 0% 7% 97% 0% 100%
12d 0% 92% 0% 0% 97% 0% 100%
13d 0% 92% 0% 0% 95% 0% 99%
14d 0% 91% 0% 0% 95% 0% 97%
15d 0% 89% 0% 0% 95% 0% 97%
표 10에 나열된 결과를 보면, 실험을 진행하여 8일째 되는 날에 대조군의 모든 병아리가 사망했으며;공백군의 생존율은 97%로 나타났다; 황색포도상구균 파지 J1P2 단일 투여 그룹, 살모넬라 파지 SG8P3 단일 투여 그룹 및 조합물8을 투여한 그룹의 병아리는 바이러스 투여 11일째 및 12일째 되는 날에 전부 사망하였으며; 대장균 파지 EC35P1만을 투여한 그룹의 병아리 생존율은 89%; 조합물 9를 투여한 병아리의 생존율은 95%에 달했다. 상기 결과로부터 살모넬라 파지 SG8P3는 기타 성분과 조합하여 사용할 수 있으며, 이와 같은 조합 성분의 성능에 영향을 주지 않으며; 또한, 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물은 대장균에 의한 세균성 질병을 예방하기 위한 생물학적 살균제 또는 사료 첨가제로 사용가능함을 알 수 있다.실시예 12: 병아리 양식 과정에 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물을 사용한 황색포도상구균의 감염 방지
살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1), 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2) 원액의 제조법 및 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물 8~조합물9에 대한 제조법은 전부 실시예 6을 참조한다.
실험용 병아리 350 마리를 3일간 적응 적으로 사육한 후, 무작위로 그룹 당 50 마리씩, 7개 그룹으로 나눈다.각 실험군에 1x108 PFU/kg의 실험용 파지와 1x108cfu/kg의 황색포도상구균 투여; 대조군에 1x108cfu/kg의 황색포도상구균 투여; 공백군은 동일 양의 생리 식염수를 투여하며, 15일간 연속 투여한다. 병아리의 일상 성장상황 및 생존율 통계결과는 표 11을 참조한다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물이 병아리 생존율에 미치는 영향
시간 파지 SG8P3 그룹 파지 EC35P1그룹 파지 J1P2그룹 조합물8 조합물9 대조군 공백군
1d 90% 91% 100% 95% 100% 98% 100%
2d 80% 80% 100% 83% 100% 90% 100%
3d 67% 71% 100% 71% 100% 65% 100%
4d 53% 60% 100% 54% 100% 43% 100%
5d 41% 44% 98% 42% 100% 32% 100%
6d 36% 37% 98% 39% 100% 17% 100%
7d 24% 29% 98% 31% 100% 10% 100%
8d 12% 21% 97% 25% 99% 1% 100%
9d 4% 17% 96% 15% 99% 0% 100%
10d 0% 11% 96% 9% 98% 0% 100%
11d 0% 3% 95% 5% 98% 0% 100%
12d 0% 0% 94% 0% 97% 0% 100%
13d 0% 0% 91% 0% 95% 0% 99%
14d 0% 0% 87% 0% 94% 0% 97%
15d 0% 0% 86% 0% 94% 0% 97%
표 11에 나열된 결과를 보면, 대조군의 병아리는 9일째 되는 날에 전부 사망했고; 공백군의 생존율은 97%; 살모넬라 파지 SG8P3 단일 투여 그룹, 대장균 파지 EC35P1 단일 투여 그룹 및 조합물 8 투여 그룹의 병아리는 각각 바이러스의 공격을 받은 후 10일째 및 12일째 되는 날에 모두 사망하였고; 황색포도상구균 파지 J1P2 단일 투여 그룹의 병아리 생존율은 86%, 조합물 9 투여 그룹의 병아리 생존율은 94%를 나타냈다. 상기 실험을 통해, 살모넬라 파지 SG8P3는 다른 성분의 성능에 영향 주지 않고 함께 사용할 수 있고; 또한, 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물은 황색포도상구균에 의한 세균성 질병을 예방하기 위한 생물학적 살균제 또는 사료 첨가제로 사용가능함을 알 수 있다.실시예 13: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 사용한 보존 중 계육 샘플에 대한 대장균 오염의 방지
1. 파지 계수법: 실시예 2에 기재된 방법과 동일하다.
2. 대장균 계수법 : 대장균 계수를 위해 에오신 메틸렌 블루 선택성 배지 및 희석 도포법을 적용한다. 37°C에서 24시간 동안 배양 한 후, 플레이트에 짙은 보라색 금속 광택의 균락이 생성되는 데 이는 대장균 균락이다.
3.살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1), 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2) 원액의 제조법 및 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage phageSG8P3) 조합물 8~조합물9에 대한 제조법은 전부 실시예 6을 참조한다.
4. 고압 증기로 멸균한 닭 가슴살로 1cm 크기의 정사각형 조각 105개를 잘라내어 그룹 당 15조각씩, 7개 그룹으로 나누어, 멸균 페트리 접시에 방치한다. 실험군은 샘플 조각 당 1x105 cfu의 대장균 및 용량이 1x108 PFU / kg인 시험용 파지를 접종하며; 대조군은 샘플 조각 당 1x105 cfu의 대장균 및 동일 양의 멸균 수를 투여하며; 공백군은 동일 양의 멸균 식염수를 투여한다. 처리된 각 샘플을 온도가 37°C 인큐베이터에 방치하여 배양한다. 2시간 간격으로 계육 한 조각씩 취하여 10mL의 멸균수에 넣고 충분히 진탕하여, 액체에 함유된 대장균의 함량을 측정하며 실험을 3 회 반복 진행한다. 실험 결과는 표 12에 나열한다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물이 보존 중 계육샘플에 대한 대장균 오염 예방효과
시간 대장균 최종농도(cfu/mL)
파지 SG8P3 그룹 파지 EC35P1그룹 파지 J1P2그룹 조합물8 조합물9 대조군 공백군
0h 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 0
2h 7.7x104 7.5x103 6.5x104 5.8x104 6.3x103 4.3x106 0
4h 4.5x104 5.2x103 3.3x104 1.9x104 8.5x102 7.8x107 0
6h 5.9x103 4.0x102 5.5x103 4.1x103 3.1x102 5.5x108 0
8h 2.6x103 91 3.9x103 1.2x103 70 6.9x109 0
표12의 결과를 보면, 8시간 후 대조군의 계육 표면에 다량 대장균이 번식했고; 대장균에 대한 파지 J1P2 그룹, 파지 SG8P3 그룹 및 조합물 8의 억제 효과가 약했고, 접종 8시간 후에도 계육 표면에는 103 cfu/mL의 대장균이 남아 있었다; 파지 EC35P1 그룹이 대장균에 대한 억제 효과가 상대적으로 좋았으며; 조합물9를 첨가한 계육 표면의 대장균은 지속적으로 극히 낮은 수준을 유지한 것으로 나타났다. 살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물은 계육 표면의 대장균을 효과적으로 사멸할 수 있고, 계육 보존 중에 대장균 오염을 방지하기 위한 생물학적 살균제로 사용될 수 있다.실시예 14: 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 사용한 보존 중 계육 샘플에 대한 황색포도상구균의 오염 방지
1. 파지 계수법: 실시예 2에 기재된 방법과 동일하다.
2. 황색포도상구균의 계수법 : 황색포도상구균 계수를 위해 고염 만니톨 한천 선택성 배지 및 희석 도포법을 적용하여, 37°C에서 24시간 동안 배양하여 플레이트 상에 생성된 노란색 균락은 황색포도상구균 균락이다.
3.살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1), 대장균 파지 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 및 황색포도상구균 파지J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2) 원액의 제조법 및 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage phageSG8P3) 조합물 8~조합물9에 대한 제조법은 전부 실시예 6을 참조한다.
4. 고압 증기로 멸균한 닭 가슴살로 1cm 크기의 정사각형 조각 105개를 잘라내어 그룹 당 15조각씩, 7개 그룹으로 나누어, 멸균 페트리 접시에 방치한다. 실험군은 샘플 조각 당 1x105 cfu의 황색 포도상구균 및 용량이 1x108 PFU / kg인 시험용 파지를 접종하며; 대조군은 샘플 조각 당 1x105 cfu의 황색포도상구균 및 동일 양의 멸균 수를 투여하며; 공백군은 동일 양의 멸균 식염수를 투여한다. 처리된 각 샘플을 온도가 37°C인 인큐베이터에 방치하여 배양한다. 2시간 간격으로 계육 한 조각씩 취하여 10mL의 멸균수에 넣고 충분히 진탕하여, 액체에 함유된 황색포도상구균의 함량을 측정하며 실험을 3 회 반복 진행한다. 실험결과는 표13에 나열한다.
살모넬라 파지 SG8P3 및 그 조합물이 보존 중 계육 샘플에 대한 황색포도상구균 오염 방지효과
시간 황색포도상구균 최종농도(cfu/mL)
파지 SG8P3 그룹 파지 EC35P1그룹 파지 J1P2그룹 조합물8 조합물9 대조군 공백군
0h 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 0
2h 7.4x104 7.0x104 6.9x103 5.5x104 5.0x103 3.5x106 0
4h 4.9x104 5.0x104 4.3x103 2.1x104 7.2x102 6.6x107 0
6h 6.2x103 4.8x103 3.5x102 4.2x103 2.6x102 4.1x108 0
8h 4.0x103 3.7x103 96 3.2x103 64 4.9x109 0
표 13에 나열된 결과를 보면, 8시간 후, 대조군의 계육 표면에 다량 황색포도상구균이 번식되었고; 파지 EC35P1그룹, 파지 SG8P3그룹 및 조합물 8이 황색포도상구균에 대한 억제효과가 약한 것으로 나타났다. 접종 8시간 후에도 계육 표면은 여전히103 cfu/mL의 황색포도상구균이 남아 있었다; 파지 J1P2 그룹은 황색포도상구균에 대해 상대적으로 좋은 억제 효과를 나타냈고; 조합물 9를 첨가한 후, 계육 표면의 황색포도상구균은 지속적으로 극히 낮은 수준에서 통제된 것으로 나타났다. 살모넬라 박테리오파지 SG8P3 및 그 조합물은 계육 표면에 있는 황색포도상구균을 효과적으로 사멸했고, 계육 보존 중 황색포도상구균의 오염을 방지하기 위한 생물학적 살균제로 사용할 수 있다.실시예 15 : 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물의 시제 또는 키트의 제조 및 사용
시제 또는 키트에는 5~10 mL의 역가가 1x107 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 또는 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)의 조합물, 1L LB 반고체 배지 및 1L LB 고체 배지를 함유한다.
시제 또는 키트를 사용하는 방법은 다음과 같다: 역가가 1 x 107 PFU/mL인 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)의 파지액 또는 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3) 조합물의 액체를 취하여, 이중층 플레이트 점적법을 사용하여 실험용 파지의 용해 스펙트럼을 측정한다.측정할 단일 균락을 선정하여 표적 액체 배지에 접종하고, 목표 온도에서 측정 대기 균주의 번식특성와 연결시켜 진탕 배양하여 측정 대기 균주용액을 준비한다. 측정할 균주 현탁액 300μL를 취하여 5mL의 LB 반고체 배지와 혼합하여 LB 고체 플레이트에 펴 바르며, 10μL의 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)액체 또는 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)의 조합물을 플레이트 상에 점적한다. 자연 풍건 후 측정할 균주는 그의 번식 특성에 따라 목표 온도에서 배양하고 그 결과를 관찰한다.
본 발명의 상세한 실시방식에 기재된 실시예는 전부 본 발명의 바람직한 예이며, 이에 따라 본 발명의 보호 범위를 제한하는 것은 아니므로, 본 발명의 구조, 형태 및 원리에 따라 진행된 모든 등가 변경은 전부 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

Claims (12)

  1. 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지에 있어서, 상기 살모넬라 파지는 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)이며, 보존 번호는 CCTCC NO: M2020205인 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 파지 SG8P3 (Salmonella pullorum phage SG8P3)는 꼬리를 가진 파지로, 20면체 헤드, 길이 80~100nm, 가로 지름 50~70nm 및 수축성 근초를 가지며, 꼬리 길이는 90 ~ 110nm이고, 지름이 15 ~ 25nm인 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)는 75°C에서 우수한 고온 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지.
  4. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3)은 비교적 넓은 스펙트럼 범위의 살모넬라 사멸 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 임의 한 항에 기재된 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지의 조합물에 있어서, 조합물은 상기 살모넬라 파지(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 다른 파지 또는 화학적 살충제 중 적어도 하나를 함유는 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지의 조합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 다른 살모넬라 파지는 살모넬라 풀로룸 파지 SG4P1(Salmonella pullorum phage SG4P1), 보존 번호는 CCTCC M2018765; 미오비리대과 BP-66 (Myoviridae sp. BP- 66), 보존 번호 CCTCC NO: M 2015146; 미오비리대과 BP-63 (Myoviridae sp. BP-63), 보존번호 CCTCC NO: M 2015145; 칠리키 바이러스과 파지 BP-12 (Chilikevirus sp. BP-12), 보존번호 CCTCC NO: M 2015141; 대장균 파지 EC35P1 (Escherichia coli phage EC35P1), 보존 번호 CCTCC NO: M 2020438; 또는, 황색포도상구균 파지 J1P2(Staphylococcus aureus phage J1P2), 보존 번호 CCTCC NO : M2016285 중 하나인 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지의 조합물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조합물은 화학적 살균제를 포함하는 것을 특징으로 하는 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지의 조합물.
  8. 제5항에 기재된 와이드 용해 스펙트럼을 가진 고온 내성 살모넬라 파지 또는 살모넬라 파지의 조합물을 함유하는 시제 또는 키트.
  9. 제1항 내지 제5항 중 임의 한 항에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 생물학적 살균제로 사용하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 파지 및 그 조합물의 응용.
  10. 제1항 내지 제5항 중 임의 한 항에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 살모넬라에 따른 감염을 포함하나 단 이에 한정되지 않는 세균 감염에 대하여 잠재적인 치료제 또는 건강제품으로 사용하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 파지 및 그 조합물의 응용.
  11. 제1항 내지 제5항 중 임의 한 항에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 살모넬라에 따른 세균 감염 및 이에 한정되지 않는 세균 감염을 치료 및 예방하는 의료기기에 사용하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 파지 및 그 조합물의 응용.
  12. 제1항 내지 제5항 중 임의 한 항에 있어서, 살모넬라 파지 SG8P3(Salmonella pullorum phage SG8P3) 및 그 조합물을 사료 첨가제로 사용하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 파지 및 그 조합물의 응용.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115896041A (zh) * 2022-10-24 2023-04-04 华中农业大学 一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用
CN115896041B (zh) * 2022-10-24 2024-05-03 华中农业大学 一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用

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