CN115896041A - 一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用，属于噬菌体技术领域。本发明从肠炎沙门氏菌中分离一株同时裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体，对高温和pH值具有较高的稳定性，同时具有良好的安全性，为沙门氏菌的生物防控提供了一种安全高效的产品，具有较高的应用价值。

Description

一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用

技术领域

本发明属于噬菌体技术领域，具体涉及一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用。

背景技术

沙门氏菌是广泛存在于人和动物肠道内的肠杆菌科革兰氏阴性菌，作为全球食源性疾病的罪魁祸首之一，其传染源多为被感染的畜禽。沙门氏菌以消化道为主要传播途径，可通过畜禽粪便污染环境，动物产品及其副产品可携带沙门氏菌从而危害人类健康，加之其对养殖产业的负面影响，已成为公共卫生安全重点监测对象。(唐宁,殷茵,任慧英,张灿,刘文华.沙门氏菌高效价宽谱噬菌体的分离纯化及生物学特性测定[J].中国畜牧兽医,2021,48(07):2577-2583.)。并且，沙门氏菌致病性可随其耐受能力的增强而提高(MutzYDS,Rosario DKA,PaschoaLin VMF,Conte-Junior CA.SaLmoneLLa enterica:A hiddenrisk for dry-cured meat consumption？Crit Rev Food Sci Nutr.2020；60(6):976-990.doi:10.1080/10408398.2018.1555132.Epub 2019Jan 21.PMID:30663891.)，其威胁性也随之升高。还有证据表明，沙门氏菌可通过调控宿主信号通路诱发胆囊癌(Khan AA,Bano Y.SaLmoneLLa enterica subsp.enterica host-pathogen interactions andtheir impLications in gaLLbLadder cancer.Microb Pathog.2021Aug；157:105011.doi:10.1016/j.micpath.2021.105011.Epub 2021May 29.PMID:34062227.)，从而增加胆石症人群患癌的风险。

沙门氏菌对抗生素的耐药性日趋严重，已受到各个国家的广泛关注。2019年7月10日，我国农业农村部发布《中华人民共和国农业农村部公告(第194号)》公告，自2020年7月1日起，畜禽饲料“禁抗令”将全面实行。现今，为预防畜禽疾病，提高生存率，促进畜禽生长，就要积极寻找新的抗生素替代品，替抗产品的研发成为解决沙门氏菌耐药性的重要突破口。

噬菌体是侵染细菌、真菌等微生物的病毒总称。沙门氏菌噬菌体具有严格的宿主特异性，不会造成畜禽体内菌群紊乱等问题，与传统杀菌方法的局限性相比，噬菌体不受细菌耐药基因的限制还可与沙门氏菌共进化，能高效杀灭食品、环境中沙门氏菌。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体，具有较宽的裂解谱，在病害细菌防控中具有重要应用价值。

本发明提供了一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体，保藏编号为CCTCC NO：M 20221382。

本发明提供了一种用于抑制沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体制剂，包括所述广谱噬菌体和辅料。

本发明提供了一种防控沙门氏菌和/或大肠杆菌感染的药物，包括所述广谱噬菌体和医学上可接受的辅料。

本发明提供了所述广谱噬菌体或所述噬菌体制剂在制备防控动物养殖中沙门氏菌感染的药物中的应用。

优选的，所述动物养殖包括以下至少一种：家禽养殖、畜牧养殖和昆虫养殖。

本发明提供了所述广谱噬菌体或所述噬菌体制剂在防控饲料或饮用水中沙门氏菌感染中的应用。

本发明提供了所述广谱噬菌体或所述噬菌体制剂在防控饲料或饮用水中大肠杆菌感染中的应用。

优选的，所述饲料或饮用水中所述广谱噬菌体的MOI为1～100。

优选的，所述所述广谱噬菌体的溶液的体积与饲料或饮用水的质量比为1mL：9～11g。

本发明提供了一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体，保藏编号为CCTCC NO：M 20221382。经宿主谱测定，所述广谱噬菌体对沙门氏菌和大肠杆菌均具有裂解作用。说明本发明提供的噬菌体具有良好的跨种属裂解的特性，是一种有强裂解能力的宽宿主谱噬菌体。

同时，所述广谱噬菌体对高温和pH值均表现出较高的稳定性，所述广谱噬菌体在pH值3～11条件下活性较为稳定，对80℃以内的温度具有较高耐性，在70℃以下该噬菌体效价稳定。

同时所述广谱噬菌体还能有效保护动物免受沙门氏菌感染或有效清除动物体内沙门氏菌，具有良好的动物保护作用。因此，本发明提供的噬菌体可以单独或复配使用，对沙门氏菌有强裂解作用，为沙门氏菌的防控提供一种安全高效、无毒副作用的噬菌体产品，可应用于清除饲料以及环境中的沙门氏菌，安全高效地对沙门氏菌进行生物防控。

生物材料保藏信息

本发明提供的沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage)GSP044，保藏于中国典型培养物保藏中心，单位简称为CCTCC，地址为中国武汉，武汉大学，保藏时间为2022年9月6日。保藏编号为CCTCC NO：M 20221382。

附图说明

图1为沙门氏菌噬菌体GSP044在双层琼脂平板上的噬菌斑图片；

图2为沙门氏菌噬菌体GSP044的电镜图片；

图3为沙门氏菌噬菌体GSP044的最佳感染复数结果图；

图4为沙门氏菌噬菌体GSP044的一步生长曲线结果图；

图5为沙门氏菌噬菌体GSP044的pH稳定性结果图；

图6为沙门氏菌噬菌体GSP044的热稳定性结果图；

图7为沙门氏菌噬菌体GSP044的大蜡螟幼虫沙门氏菌预防及治疗试验结果图；

图8为沙门氏菌噬菌体GSP044防控饮水中的细菌污染结果图；

图9为沙门氏菌噬菌体GSP044防控饲料中的细菌污染结果图。

具体实施方式

本发明提供了一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体，保藏编号为CCTCC NO：M 20221382。

在本发明中，所述广谱噬菌体是从肠炎沙门氏菌中分离筛选得到的，编号为GSP044，属于长尾噬菌体病毒科。透射电子显微镜观察发现噬菌体具有多面体头部结构和不可伸缩的长尾部结构，头部直径约79.17nm，尾部长度约181.52nm，在固体培养基上可观察到空斑，大小约0.8～1mm。所述广谱噬菌体毒株的基因组序列提交至GenBank中，登录号为OP394141。

在本发明中，所述广谱噬菌体的增殖方法，优选包括以下步骤：

将肠炎沙门氏菌培养至OD₆₀₀0.4时，挑取噬菌体单斑放入肠炎沙门氏菌菌液中，在37℃振荡培养6h，观察菌液是否变澄清，离心过滤收集上清液，10倍梯度稀释后进行噬菌体效价的测定，储存到4℃冰箱。

在本发明中，所述广谱噬菌体通过最佳感染复数测定结果为0.01；通过一步生长曲线测定可知其潜伏期为20min，爆发期60min。通过pH、温度稳定性试验显示，所述广谱噬菌体在pH值3～11条件下活性较为稳定，温度80℃以内具有耐性，在70℃以下该噬菌体效价稳定；该广谱噬菌体对包括沙门氏菌和大肠杆菌在内的102株菌株进行宿主谱测定，能够裂解包括宿主菌在内的38株沙门氏菌和18株大肠杆菌。通过全基因组分析显示，所述噬菌体GSP044的基因组为双链结构，全基因组长110563bp，不存在毒力基因、抗生素耐药基因等威胁性。

在本发明中，大蜡螟幼虫安全性试验显示，所述广谱噬菌体对大蜡螟幼虫生长未产生影响。同时所述广谱噬菌体还具有沙门氏菌和大肠杆菌感染的保护作用，沙门氏菌感染大蜡螟幼虫的治疗试验表明，在预防组中，高剂量噬菌体对大蜡螟幼虫的保护率达93.33％；同时治疗组中，高剂量噬菌体对大蜡螟幼虫的保护率达80.00％；延后治疗组中，高剂量噬菌体对大蜡螟幼虫的保护率达60.00％；该噬菌体可在短时间内有效清除大蜡螟幼虫体内的沙门氏菌，大蜡螟幼虫得到了有效的保护。

本发明提供了一种用于抑制沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体制剂，包括所述广谱噬菌体和辅料。

本发明对所述噬菌体制剂的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的噬菌体制剂类型即可。所述辅料根据制剂剂型进行常规选择。本发明对所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制剂种类即可。

本发明提供了一种防控沙门氏菌和/或大肠杆菌感染的药物，包括所述广谱噬菌体和医学上可接受的辅料。

本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可。所述医学上可接受的辅料根据药物的剂型进行常规选择即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物制备方法即可。所述药物可用于对畜禽体内、体表、所用饲料、器皿以及畜禽生存环境中的沙门氏菌污染进行防控。

本发明提供了所述广谱噬菌体或所述噬菌体制剂在制备防控动物养殖中沙门氏菌感染的药物中的应用。

在本发明中，所述动物养殖优选包括以下至少一种：家禽养殖、畜牧养殖和昆虫养殖。在本发明实施例中，以大蜡螟幼虫为例说明所述广谱噬菌体对昆虫或其他动物防控或预防沙门氏菌感染中的作用。

本发明提供了所述广谱噬菌体或所述噬菌体制剂在防控饲料或饮用水中沙门氏菌感染中的应用。

在本发明中，所述饲料或饮用水中所述广谱噬菌体的MOI优选为1～100，更优选为10。所述广谱噬菌体的溶液的体积与饲料或饮用水的质量比优选为1mL：9～11g，更优选为1mL：10g。

下面结合实施例对本发明提供的一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

噬菌体GSP044的分离纯化方法

(1)实验材料：

采集猪场的污水，宿主菌为肠炎沙门氏菌SE006。

(2)试验方法：

将来自猪场的污水样品经6000rpm离心10min，取3mL上清、4mL 2×LB培养基和400μL摇过夜的SE006菌悬液加入15mL离心管中，于37℃摇床，180rpm过夜振荡培养。在培养液中加入其体积5％的氯仿，在37℃摇床避光震荡30min后，在4℃，7000rpm的条件下离心10min，采用双层平板法，即取100μL上清和100μL过夜培养的SE006菌液于7mLEP管中，加入4mL温度适宜的半固体培养基，充分混匀后迅速倒于下层LB琼脂培养基上，轻柔晃动平皿使半固体培养基均匀的覆盖在下层培养基上，待其凝固后放入37℃恒温培养箱倒置培养，观察是否出现透明或半透明的噬菌斑。

对上述出现噬菌斑的平板上挑取单个透亮噬菌斑，然后放入分装好的SM buffer中洗脱2h，使用0.22μm的滤器过滤得到噬菌体原液，放于4℃保存。将噬菌体原液进行10倍梯度稀释，各梯度稀释液用双层平板法进行单斑培养，出单斑后戳取单斑保存在SM buffer中，即为纯化一次噬菌体，重复上述方法对噬菌体纯化3～4次后，得到形态一致的噬菌斑，挑取单斑保存于SMbuffer，4℃保存。

实施例2

噬菌体GSP044的增殖与效价测定

采用液体增殖法，对纯化的噬菌体进行增殖。将20μL噬菌体(约10⁷PFU/mL)和200μL过夜菌液(约10⁸CFU/mL)混合，加入30mL的LB，37℃摇床振荡培养6h左右，按体积的5％加入氯仿，37℃避光震荡培养30min。将增殖液于4℃，7000rpm离心10min，用0.22μm滤器过滤上清，于4℃存放。通过10倍稀释法将增殖液进行梯度稀释，通过双层平板法，取100μLSE006菌悬液与100μL各梯度稀释液分别混合，加入4mL半固体培养基混匀后迅速平铺在准备好的下层LB琼脂培养基上，37℃倒置培养6h后记录噬菌斑数量，每个梯度重复三次。

噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑数量×稀释倍数×10，测得沙门氏菌噬菌体GSP044的效价为2.3×10¹⁰PFU/mL。

结果如图1所示，沙门氏菌噬菌体GSP044在双层LB琼脂培养基平板上形成噬菌斑，直径约0.8～1mm。

实施例3

噬菌体GSP044的宿主谱测定

采用点滴法进行，具体方法如下。取100μL过夜培养的不同菌株的菌液，加入4mL半固体培养基混匀后迅速平整的铺在下层培养基表面，凝固后按稀释梯度的顺序滴加10μL噬菌体稀释液于平板上，每个梯度重复三次，在超净台中晾干后放于37℃培养6h，观察是否有噬菌斑出现，记录结果。

根据表1的结果可知：噬菌体GSP044可裂解38株沙门氏菌，18株大肠杆菌，说明该噬菌体具有良好的跨种属裂解的特性，是一种有强裂解能力的宽宿主谱噬菌体。

表1噬菌体宿主谱测定结果

注：+++:0.1≤EOP≤1.5；++:0.001≤EOP<0.1；+:EOP<0.001；-:不感染。

实施例5

噬菌体GSP044的透射电镜形态观察

将噬菌体增殖液进行超高速冷冻离心，30000rpm离心2h，迅速弃掉上清，用总量约为1mL的SM buffer溶解重悬。采用磷钨酸复染法进行透射电镜观察。取10μL样品滴在铜网上静置约15min，用滤纸吸取多余的液体，在铜网上滴加2％(W/V)磷钨酸染色10min，干燥后用透射电子显微镜进行观察。

结果如图2所示，噬菌体GSP044头部呈现为多面体结构直径约为79.17nm，尾长约181.52nm，根据国际病毒分类委员会(ICTV)的分类方法，该噬菌体形态符合长尾噬菌体科特征，属于长尾噬菌体。

实施例6

噬菌体GSP044的最佳感染复数测定

沙门氏菌SE006在37℃过夜培养，然后经菌液稀释至10⁷CFU/mL，分装好后，按照MOI(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)为1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001的比例加入噬菌体。于37℃振荡培养4h后将其经12000rpm离心1min，迅速取100μL进行10倍梯度稀释，用双层平板法测定不同MOI下的噬菌体效价，需进行三次重复试验，根据测定的效价结果得最佳感染复数。

结果如图3所示，当感染复数为0.01时，沙门氏菌噬菌体GSP044的效价达到最高，因此沙门氏菌噬菌体GSP044的最佳感染复数为0.01。

实施例7

噬菌体GSP044的一步生长曲线

按照MOI为0.01的噬菌体增殖液和宿主菌混合，放入37℃摇床孵育10min后取出，7000rpm离心10min，弃去上清。用LB清洗沉淀2次，洗去未吸附的噬菌体，用等量LB重悬继续培养，此时取样标记为0min，12000rpm离心30s取上清进行梯度稀释，后每隔10min取样1次，通过双层平板法，测定噬菌体效价，重复三次平行试验。

结果如图4所示，噬菌体GSP044一步生长曲线显示其潜伏期约为20min，侵染宿主菌20min～80min内噬菌体量逐渐增加，80min后趋于平缓，爆发时间约为60min。结果表明噬菌体GSP044有优良的裂解能力。

实施例8

噬菌体GSP044的pH稳定性

取100μL噬菌体加入900μL已调整pH(pH＝1.0～13.0)的SM buffer中，37℃水浴1h，取100μL连续稀释用双层平板法测定效价，重复三次作对照。

结果如图5所示，噬菌体GSP044在pH值4～10内效价较为稳定，pH＝3及12＞pH≥11时，效价有所降低，pH≤2或pH≥12时，噬菌体失去活性。结果表明，噬菌体GSP044具有一定的耐酸碱能力。

实施例9

噬菌体GSP044的热稳定性

取1mL噬菌体分装在1.5mLEP管中，分别放于4℃冷藏柜以及37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴锅中分别孵育1h，取100μL进行10倍稀释，用双层平板法测定噬菌体效价，重复三次作对照。

结果如图6所示，噬菌体GSP044在4℃～60℃作用1h后能够维持初始效价，70℃作用60min时效价降低明显，80℃作用60min后噬菌体失去活性。结果表明，噬菌体GSP044在4℃～60℃内效价稳定性较强。

实施例10

噬菌体GSP044的基因组提取与分析

(1)噬菌体基因组提取

将噬菌体增殖液经30000rpm离心2h，弃上清，用总量约为1mL的SM buffer溶解重悬，加入DNaseⅠ和RNaseA使其终浓度为1μg/mL，混匀后放入37℃孵育1h，加入10％SDS(终浓度0.5％，m/v)和蛋白酶K(终浓度50μg/mL)混匀后放入56℃恒温水浴1h。加入等体积的酚仿(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)进行抽提，12000rpm离心10min，收集上层水相，重复抽提2次。水相转移至10mL EP管中，加入预冷的无水乙醇，放于-20℃过夜。离心收集沉淀后用预冷的75％无水乙醇洗涤沉淀3次，放于37℃晾干后，加入100μL无菌水放于-20℃备用。

(2)噬菌体基因组分析

噬菌体GSP044的基因组序列提交至GenBank，登录号为OP394141。GSP044的基因组核酸类型为DNA双链结构，基因组全长110563bp，通过BLAST工具同NCBI数据库中的噬菌体基因组进行全序列比对分析，该噬菌体基因组中不存在毒力基因、抗生素耐药基因和溶原相关蛋白，在临床应用中无潜在威胁性。

实施例11

噬菌体GSP044的安全性试验

(1)实验动物：六龄大蜡螟幼虫60只，购自川东农业养殖基地。

(2)试验方法：将大蜡螟幼虫分成4个组，每组15只。挑选无黑斑活力好，大小一致的幼虫。将沙门氏菌噬菌体GSP044用灭菌PBS稀释至10⁸、10⁷、10⁶PFU/mL,使用胰岛素注射器(U-40，30G)在大蜡螟幼虫左下腹后足处注入25μL，对照组注射等量灭菌PBS，放入37℃孵育观察。

注射后观察96h，结果如表2所示，该剂量噬菌体未引起大蜡螟幼虫死亡，未影响幼虫生长，表明该噬菌体在临床应用中无潜在威胁性，无其他毒副作用。

表2噬菌体GSP044的安全性试验

实施例12

噬菌体GSP044大蜡螟幼虫沙门氏菌攻毒治疗试验

(1)实验动物：六龄大蜡螟幼虫180只，购自川东农业养殖基地。

(2)试验方法：将大蜡螟幼虫分成3组包括提前预防组、同时治疗组、延后治疗组，每组分4个小组分别为对照组(PBS)、试验组(MOI＝100、MOI＝10和MOI＝1)，每小组15只大蜡螟幼虫。

过夜摇菌，调整菌液浓度至5×10⁶CFU/mL，调整噬菌体浓度至MOI＝100、10、1。预防组对试验组的大蜡螟幼虫右下腹后足注射25μL噬菌体，对照组注射25μLPBS，1h后在另一足处注射25μL菌液；延后组每只注射25μL菌液，1h后试验组注射25μL噬菌体，对照组注射25μLPBS；同时治疗组每只注射25μL菌液后，试验组在另一足处注射25μL噬菌体，对照组注射25μL PBS。放入37℃孵育观察。

结果如图7所示，预防组的对照组存活率为0，试验组中MOI＝100的存活率为93.33％，MOI＝10的存活率为80.00％和MOI＝1的存活率为33.33％；同时治疗组的对照组存活率为0，试验组中MOI＝100的存活率为80.00％，MOI＝10的存活率为60.00％和MOI＝1的存活率为12.50％；延后治疗组的对照组存活率为0，试验组中MOI＝100的存活率为60.00％，MOI＝10的存活率为53.33％和MOI＝1的存活率为6.67％。结果表明，噬菌体GSP044能有效清除大蜡螟幼虫体内的宿主菌，有替代抗生素防控沙门氏菌感染的临床应用潜力。

实施例13

噬菌体GSP044防控饮水中的沙门氏菌污染

过夜培养肠炎沙门氏菌SE006，调整菌液浓度为10⁵CFU/mL，试验组为取100μL肠炎沙门氏菌菌液加入800μL的灭菌水中再加入100μL噬菌体稀释液使其MOI分别为10、100；对照组为100μL菌液和100μLPBS混合加入800μL的灭菌水中，放于25℃恒温培养箱中，分别在1h、3h、6h、12h取样检测宿主菌含量。

结果如图8所示，在25℃条件下，MOI＝10或100时，在作用时间分别为1、3、6、12取样检测样品中的细菌载量，结果显示该噬菌体可明显降低饮水中的细菌数量(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)，说明噬菌体GSP044能有效控制饮水中的细菌污染。

实施例14

噬菌体GSP044防控猪饲料中的沙门氏菌污染

过夜培养肠炎沙门氏菌SE006，调整菌液浓度为10⁶CFU/mL，将纯化后的噬菌体GSP044增殖液效价调整MOI＝10、100。准备3组灭过菌的10g猪饲料，用小型喷雾器将1mL肠炎沙门氏菌菌液均匀喷洒在摊开的饲料表面。对照组喷洒1mLPBS，试验组(MOI＝10、100)喷洒1mL噬菌体GSP044，放于25℃恒温培养箱中静置孵育，分别在1h、3h、6h、12h和24h取样1g，检测宿主菌含量。

结果如图9所示，在25℃环境下，当MOI＝10或100时，随噬菌体与宿主菌作用时间的延长，宿主菌数量下降明显(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)，说明噬菌体GSP044能有效杀灭饲料中污染的宿主菌，可以应用于饲料中沙门氏菌的防控。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株兼性裂解沙门氏菌和大肠杆菌的广谱噬菌体，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO：M 20221382。

2.一种用于抑制沙门氏菌和大肠杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，包括权利要求1所述广谱噬菌体和辅料。

3.一种防控沙门氏菌和/或大肠杆菌感染的药物，其特征在于，包括权利要求1所述广谱噬菌体和医学上可接受的辅料。

4.权利要求1所述广谱噬菌体或权利要求2所述噬菌体制剂在制备防控动物养殖中沙门氏菌感染的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述动物养殖包括以下至少一种：家禽养殖、畜牧养殖和昆虫养殖。

6.权利要求1所述广谱噬菌体或权利要求2所述噬菌体制剂在防控饲料或饮用水中沙门氏菌感染中的应用。

7.权利要求1所述广谱噬菌体或权利要求2所述噬菌体制剂在防控饲料或饮用水中大肠杆菌感染中的应用。

8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述饲料或饮用水中所述广谱噬菌体的MOI为1～100。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述所述广谱噬菌体的溶液的体积与饲料或饮用水的质量比为1mL：9～11g。

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