CN117264910B - 耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用 - Google Patents

耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用，涉及生物领域，所述噬菌体2023年08月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231469。本发明的噬菌体裂解能力强，无潜伏期，裂解速度快，裂解周期短，能够裂解肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌，为一株广谱噬菌体；此外，所述噬菌体具有耐高热性和耐酸碱性，较强的杀菌能力，能够显著抑制沙门氏菌的生长，为禽类养殖业提供了一种新的预防和治疗思路和策略，有望改善禽类养殖的健康和生产效益。

Description

耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用。
背景技术
沙门氏菌是一种食源性致病菌，在世界范围内，仅由沙门氏菌引起的食源性病例位居全球榜首。沙门氏菌对所有日龄的鸡均有易感性，能够引起鸡群发生鸡白痢、鸡伤寒等疾病。鸡白痢主要感染雏鸡，引起白痢、呼吸困难等症状，并能通过种蛋垂直传播；鸡伤寒主要对青年鸡、成年鸡易感。病鸡会出现精神沉郁、食欲减退、排黄绿色稀粪等症状，严重者会排血便，出现“糊肛”现象。该病既能水平传播又能垂直传播，耐过鸡只会长期带菌，给养禽业带了极大困扰。世界贸易组织研究表明，若能将家禽的沙门氏菌感染率控制为原来的一半，则人类感染沙门氏菌的风险也可降低50%。
抗菌药物对于畜禽细菌病的治疗尤为重要，人们通常会选择抗生素作为治疗细菌性疾病的首选药物。然而由于抗生素的广泛使用，出现了一系列细菌的耐药性问题，这也给临床治疗带来了许多困扰，而新型抗感染药物的研制也愈发困难。
噬菌体是一种能够特异性裂解细菌的活体病毒，具有分布广泛、增殖速度快、生产成本低等优良特性，是一种极具潜力的抗生素替代品。由于高温条件影响噬菌体活性，限制了其在畜禽养殖业的推广应用。本研究旨在分离出能够适应高温环境的耐热沙门氏菌噬菌体，突破噬菌体应用的瓶颈，为耐药沙门氏菌病的治疗提供新的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。基于此，发明人通过大量实验，在济南养殖场中分离得到了一株耐高温耐酸碱的广谱沙门氏菌噬菌体vB_SalS_JNS02。所述噬菌体vB_SalS_JNS02具有高耐热性，能够在高温环境下存活和保持活性；具有强大的杀菌能力，能够迅速而有效地降低禽沙门氏菌细菌的数量，从而减少感染的风险和疾病的传播；具有广泛的宿主谱，能够裂解肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌；具有优越的治疗作用，能够迅速降低感染禽类的沙门氏菌细菌数量，减轻疾病症状，并促进禽类的康复。这为禽类养殖业提供了一种新的预防和治疗思路和策略，有望改善禽类养殖的健康和生产效益。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种噬菌体。根据本发明的实施例，所述噬菌体（沙门氏菌噬菌体vB_SalS_JNS02，Salmonella bacteriophagevB_SalS_JNS02）于2023年08月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231469，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明的噬菌体裂解能力强，无潜伏期，裂解速度快，裂解周期短，能够裂解肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌，为一株广谱噬菌体；此外，所述噬菌体具有高的耐热性和耐酸碱性，较强的杀菌能力，能够显著抑制沙门氏菌的生长，进而在动物体内起到较好的预防和治疗沙门氏菌感染性疾病的作用。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种微生物制剂。根据本发明的实施例，所述微生物制剂包括第一方面所述的噬菌体。因此，本发明的微生物制剂也具有较强的裂解能力和杀菌能力，能够显著抑制肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌。
在本发明的第三方面，本发明提出了第一方面所述的噬菌体或第二方面所述的微生物制剂在制备药物中的用途，所用药物用于预防和/或治疗和/或缓解因沙门氏菌所引起的相关疾病。
在本发明的第四方面，本发明提出了第一方面所述的噬菌体或第二方面所述的微生物制剂在制备沙门氏菌抑制剂中的用途。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种饲料添加剂、清洁剂或消毒剂。根据本发明的实施例，所述饲料添加剂、清洁剂或消毒剂包括第一方面所述的噬菌体或第二方面所述的微生物制剂。因此，本发明的饲料添加剂、清洁剂或消毒剂能够有效的预防和/或抑制沙门氏菌的生长。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括第一方面所述的噬菌体或第二方面所述的微生物制剂。因此，本发明的药物能够有效抑制沙门氏菌的生长，从而预防和/或治疗和/或缓解沙门氏菌感染性疾病。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种非治疗目的抑制沙门氏菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将所述沙门氏菌与第一方面所述的噬菌体进行接触。因此，采用本发明的方法能够显著抑制沙门氏菌的生长。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种治疗或预防家禽沙门氏菌感染性疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向所述家禽施用第一方面所述的噬菌体。因此，采用本发明的方法能够显著抑制沙门氏菌的生长，从而达到治疗或预防家禽沙门氏菌感染性疾病的目的，这为禽类养殖业提供了一种新的预防和治疗思路和策略，有望改善禽类养殖的健康和生产效益。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的噬菌斑形态图；
图2是根据本发明一个实施例的噬菌体透射电镜图；
图3是根据本发明一个实施例的噬菌体的最佳感染复数测定；
图4是根据本发明一个实施例的噬菌体对温度敏感性测定曲线图；
图5是根据本发明一个实施例的噬菌体对pH值敏感性测定曲线图；
图6是根据本发明一个实施例的噬菌体生长曲线；
图7是根据本发明一个实施例的噬菌体的抑菌曲线；
图8是根据本发明一个实施例的噬菌体治疗大蜡螟的生存率曲线图；
图9是根据本发明一个实施例的噬菌体治疗鸡后的肝脏组织中沙门氏菌量数据图；
图10是根据本发明一个实施例的噬菌体治疗鸡后的肠道组织中沙门氏菌量数据图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明提出了一种噬菌体及其用途、微生物制剂及其用途、饲料添加剂、清洁剂或消毒剂、药物、抑制沙门氏菌的方法和治疗或预防家禽沙门氏菌感染性疾病的方法，下面将分别对其进行详细描述。
噬菌体
在本发明的一个方面，本发明提出了一种噬菌体。所述噬菌体为沙门氏菌噬菌体vB_SalS_JNS02（Salmonella bacteriophagevB_SalS_JNS02），于2023年08月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231469，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明的噬菌体裂解能力强，无潜伏期，裂解速度快，裂解周期短，能够裂解肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌，为一株广谱噬菌体；此外，所述噬菌体具有高的耐热性和耐酸碱性，较强的杀菌能力，能够显著抑制沙门氏菌的生长，进而在动物体内起到较好的预防和治疗沙门氏菌感染性疾病的作用。
微生物制剂
在本发明的另一方面，本发明提出了一种微生物制剂。根据本发明的实施例，所述微生物制剂包括前述的噬菌体。因此，本发明的微生物制剂也具有较强的裂解能力和杀菌能力，能够显著抑制肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌。
根据本发明的实施例，所述微生物制剂还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述微生物制剂进一步包括药学、食品或饲料上可接受的辅料或载体。
根据本发明的实施例，所述微生物制剂进一步包括禽药上可接受的辅料或载体。
在本文中，“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中使用的。
在本文中，“食品上可接受的”是指可被动物食用的物质或组合物，其可根据不同国家的食品要求进行调整。
在本文中，“饲料上可接受的”是指可被动物食用的物质或组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂，药物稳定剂，或其组合物，这些载体都是所属技术领域技术人员已知的。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外，涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的噬菌体不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
在本文中，术语“禽药上可接受的辅料”是指在禽药中，辅料或载体是指药物配方中除了活性成分（药物）之外的非药物成分，用于提供药物的稳定性、可操作性、质量控制、适应性等方面的功能。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前述的噬菌体或前述的微生物制剂在制备药物中的用途，所用药物用于预防和/或治疗和/或缓解因沙门氏菌所引起的相关疾病。如前所述，本发明的噬菌体具有较好的耐高温性和较强的裂解能力，能够预防和抑制沙门氏菌的生长，从而能够预防和治疗因沙门氏菌所引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述用途还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物为禽类药物。
根据本发明的实施例，所述沙门氏菌所引起的相关疾病包括但不限于鸡白痢、鸡伤寒。
根据本发明的实施例，所述沙门氏菌选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌中的至少一种。
在本文中，“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将噬菌体或含有其的产品给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能该疾病的诊断尚未作出。
在本文中，术语“治疗”和“缓解”均是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖动物、特别是禽类的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
在本发明的又一方面，本发明提出了前述的噬菌体或前述的微生物制剂在制备沙门氏菌抑制剂中的用途。如前所述，本发明的噬菌体具有较好的耐高温性和较强的裂解能力，能够预防和抑制沙门氏菌的生长。
根据本发明的实施例，所述沙门氏菌选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌中的至少一种。
饲料添加剂、清洁剂、消毒剂或药物
在本发明的又一方面，本发明提出了一种饲料添加剂、清洁剂或消毒剂。根据本发明的实施例，所述饲料添加剂、清洁剂或消毒剂包括前述的噬菌体或前述的微生物制剂。因此，本发明的饲料添加剂、清洁剂或消毒剂能够有效的预防和/或抑制沙门氏菌的生长。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括前述的噬菌体或前述的微生物制剂。因此，本发明的药物能够有效抑制沙门氏菌的生长，从而预防和/或治疗和/或缓解沙门氏菌感染性疾病。
根据本发明的实施例，所述药物还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物为禽类药物。
根据本发明的实施例，所述药物进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
根据本发明的实施例，所述药物的制剂形式为注射剂、口服给药剂型、喷雾剂型或肠外给药剂型。
根据本发明的实施例，所述噬菌体在所述药物中的效价大于106PFU/mL。
方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种非治疗目的抑制沙门氏菌的方法，其特征在于，包括将所述沙门氏菌与前述的噬菌体进行接触。由此，利用本发明的方法可以实现高效抑制沙门氏菌，并且操作简便。
根据本发明的实施例，所述沙门氏菌选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述接触是在温度为4~90℃，pH值为3~12的条件下进行的。在一些实施例中，温度为4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃；pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。本发明的噬菌体具有耐高温和耐酸碱的特性，在上述培养条件下仍具有较强的杀菌活性。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种治疗或预防家禽沙门氏菌感染性疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向所述家禽施用第一方面所述的噬菌体。因此，采用本发明的方法能够显著抑制沙门氏菌的生长，从而达到治疗或预防家禽沙门氏菌感染性疾病的目的，这为禽类养殖业提供了一种新的预防和治疗思路和策略，有望改善禽类养殖的健康和生产效益。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1宿主菌的培养、噬菌体的分离与纯化
选取肠炎沙门氏菌ATCC14028（宿主菌）在沙门显色培养基中三区划线，37℃温箱过夜培养。挑取显色培养基中单菌落接种于LB液体培养基中，37℃摇床180 rpm培养4 h，得到沙门氏菌ATCC14028菌液。
将100 μL沙门氏菌ATCC14028菌液与1 μL污水过滤液混合，加入4 mL LB半固体培养基中，充分混匀，平铺于LB固体平板中，室温静置30 min，待半固体培养基凝固后，倒置于37℃温箱，孵育过夜，观察有无噬菌斑。
将含有噬菌斑的固体培养基扣下放置于SM缓冲溶液（pH 7.2）中，过夜浸泡，然后用0.22 μm滤器除菌，得到过滤液，取100 μL过滤液与100 μL沙门氏菌ATCC14028菌液混合后加入4 mL LB半固体培养基中，制备双层板，37℃温箱过夜培养，观察噬菌斑情况。将所述单一噬菌斑扩大培养，再次利用双层板培养重复5次，以纯化噬菌体，即得到纯化后的噬菌体vB_SalS_JNS02。
取100 μL已纯化的噬菌体加入900 μL SM缓冲溶液（pH 7.2），10倍倍比稀释，测定噬菌体滴度，试验重复三次取平均值。计算公式为：噬菌体滴度（PFU/mL）=稀释倍数×噬菌斑个数×10。
结果表明，采用双层平板法纯化得到一株烈性噬菌体，并将其命名为vB_SalS_JNS02。经过5代分离纯化后，噬菌斑形态呈现出直径约1-2 mm的透亮的圆形（如图1所示），其噬菌体滴度为3.6×1011PFU/ml。噬菌体vB_SalS_JNS02送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M20231469，保藏日期为：2023年08月14日。
实施例2 噬菌体生理生化鉴定
1.形态鉴定
取少许纯化噬菌体原液滴于覆有Formvar膜（碳支持膜）的铜网上，以2%磷钨酸(PTA，pH=7.0)染色5-10 min，将铜网置于干燥的滤纸上，自然干燥后用HITACHI H-7650透射式电镜观察。
结果如图2所示，表明噬菌体vB_SalS_JNS02有一正多面体的头部，直径约66nm，有一长尾巴，约138nm。根据目前ICTV分类标准，该噬菌体为长尾科噬菌体。
2.全基因组测序
在富集的噬菌体vB_SalS_JNS02中加入10% PEG8000和0.5M NaCl放置4℃过夜，利用λ噬菌体 DNA提取方法提取核酸。全基因组送安诺优达基因科技（北京）有限公司进行全基因组测序。
结果表明，噬菌体全基因组vB_SalS_JNS02全长为42,450bp，不携带毒力基因、耐药基因和溶原性基因。
3.最佳感染复数（MOI）测定
挑取宿主菌ATCC14028单菌落放置LB培养基中，37℃，180 rpm振荡培养至对数期，调整宿主菌ATCC14028为1.0×108CFU/mL。MOI（噬菌体与宿主菌数量的比值）分别按照0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10的比例混合宿主菌ATCC14028，37℃，180 rpm振荡培养2 h。将混合物10,000 rpm离心1 min，吸取上清液，利用双层平板法测定噬菌体效价，每个MOI值重复3次。最高效价的MOI值即为最佳感染复数（OMOI）。
结果如图3所示，表明当噬菌体vB_SalS_JNS02数量与宿主菌数量的比值（MOI）为0.001时，效价达到峰值，最高效价为2.9×1011PFU/mL。
4.温度敏感性测定
将噬菌体vB_SalS_JNS02置于4℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃分别作用30min和60min。按照上述提到的双层培养方法检测噬菌体效价，每个温度重复3次。
结果如图4所示，显示噬菌体vB_SalS_JNS02在4℃-70℃作用60 min后，噬菌体效价仍能够保持原有效价；经80℃作用60min后，噬菌体效价下降至105PFU/mL；经90℃作用30min后，噬菌体约有400-600 PFU/ml的存活。
5.pH敏感性测定
将SM缓冲溶液的pH值调整为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，取100 μL噬菌体vB_SalS_JNS02与100 μL不同pH值的SM缓冲溶液混合，置于37℃温箱中温育2 h，双层平板法检测噬菌体效价。每个pH重复3次。
结果如图5所示，表明噬菌体vB_SalS_JNS02在pH为3-12的酸碱环境中均能存活，且能保持效价在1010PFU/mL左右，说明该噬菌体稳定性强，能适应不同的酸碱环境。
6.一步生长曲线
将噬菌体vB_SalS_JNS02与宿主菌ATCC14028按最佳感染复数（MOI=0.001）混合，37℃，180 rpm振荡培养5 min。10000 rpm离心1 min，弃掉上清液，用10ml LB液体培养基重悬沉淀。置于摇床中，37℃，180 rpm振荡培养。在0 min开始，每隔10 min时取样，每组重复3次，测定噬菌体效价，绘制一步生长曲线。
结果如图6所示，显示噬菌体vB_SalS_JNS02在0分钟开始裂解，无潜伏期，且裂解速度快，裂解周期短，30min即可到达平台期，能够达到1010PFU/mL以上。
实施例3 噬菌体裂解谱及杀菌实验
1.裂解谱
取100 μL生长对数期菌液，包括肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）ATCC14028（宿主菌）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）、科瓦利斯沙门氏菌（Salmonella Corvallis）、德比沙门氏菌（Salmonella Derby）、罗森沙门氏菌（Salmonella Rissen）、伦敦沙门氏菌（Salmonella London）、韦太夫雷登沙门氏菌（Salmonella Weltevreden）、巴拿马沙门氏菌（Salmonella Panama）、赛罗沙门氏菌（Salmonella Cerro）、哈瓦那沙门氏菌（Salmonella Havana）、肯塔基沙门氏菌（Salmonella Kentucky）、姆班达卡沙门氏菌（Salmonella Mkmdaka）、黄金海岸沙门氏菌（Salmonella Gold-coast）、火鸡沙门氏菌（Salmonella Turkey）、阿贡纳沙门氏菌（Salmonella Agona）以及印第安纳沙门氏菌（Salmonella Indiana）（均购自中国微生物物种资源库），与5 ml LB半固体培养基混合制备双层平板。取2.5 μL点于晾干的双层板上，37℃温箱过夜培养。
结果如表1所示，表明噬菌体vB_SalS_JNS02能够裂解肠炎沙门氏菌ATCC14028、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌等6种不同血清型沙门氏菌，为一株广谱噬菌体。
表1 噬菌体vB_SalS_JNS02的裂解能力
2.杀菌实验
分别取100 μL生长对数期宿主菌ATCC14028，按照不同MOI=0.0001-10加入噬菌体（MOI=0.0001，MOI=0.001，MOI=0.01，MOI=0.1，MOI=1，MOI=10），以宿主菌ATCC14028（不加入噬菌体）为阳性对照，以SM缓冲溶液作为阴性对照，每个梯度做3个平行。测定其OD600值，每间隔1 h测定一次，共测定24 h。
结果如图7所示，表明当MOI=0.0001-10时，不同浓度的噬菌体vB_SalS_JNS02均能对宿主菌ATCC14028的生长起到一定的抑制作用，抑制时间在1-14小时左右，当MOI=1时对细菌生长的抑制效果最好。
实施例4 治疗实验
1.大蜡螟虫治疗实验
选取120只大蜡螟，随机分为6组，每组20只。分组如表2所示，以1×107CFU/只作为肠炎沙门氏菌ATCC14028攻毒剂量，然后按照表2中的处理方式进行治疗。噬菌体注射数目为1×106PFU/只。各实验组处理后将大蜡螟置于30℃温箱中放置24 h，每3 h观察大蜡螟生长情况，记录死亡数量，计算死亡率。
结果如图8所示，表明攻菌24 h后阳性组幼虫全部死亡，空白组、噬菌体组幼虫全部存活。预防组存活率为100%，同时治疗组存活率为70%，延后治疗组存活率为85%，由此可看出噬菌体vB_SalS_JNS02对沙门氏菌具有显著的防治效果，且噬菌体预防效果最好。
表2大蜡螟动物试验分组
组别 数目/只 处理
空白组 20 注射25 μL无菌水
噬菌体组 20 注射25 μL噬菌体
阳性组 20 注射25 μL沙门氏菌
预防组 20 注射25 μL噬菌体，1 h后注射25 μL沙门氏菌
同时治疗组 20 注射25 μL噬菌体后，立即注射25 μL沙门氏菌
延后治疗组 20 注射25 μL沙门氏菌，1 h后注射25 μL噬菌体
2.雏鸡治疗实验
购买120只1日龄SPF鸡，预饲2天后，按照表3进行分组和处理，其中噬菌体治疗为口服1×108PFU/只噬菌体，攻毒沙门氏菌数目为口服1×109CFU/只，每组在第3、7天各处死3只。每组分别在隔离器内饲养，隔离器内温度设为35℃，正常饮水喂料，饲养环境均相同，饲养至10日龄。
结果如图9所示，表明攻菌后第7天，噬菌体治疗组（D组、E组和F组）中的鸡全部存活，而C组（阳性组）死亡10只。E组（同时治疗组）肝脏载菌量较C组（阳性组）下降了1.37-lgCFU/g，F组（延后治疗组）较C组（阳性组）下降了2.02-lgCFU/g。
相较于C组（阳性组），第3天时各组盲肠载菌量如图10所示，分别下降了0.84-lgCFU/g （D预防组）、1.21-lgCFU/g （E同时治疗组）、1.45-lgCFU/g（F延后治疗组）；第7天时各组分别下降了0.41-lgCFU/g（D预防组）、1.36-lgCFU/g（E同时治疗组）、4.23-lgCFU/g（F延后治疗组）。
表3实验分组
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (16)

1.一种沙门氏菌噬菌体（Salmonella bacteriophage），其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体于2023年08月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231469。
2.一种微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，进一步包括药学、食品或饲料上可接受的辅料或载体。
4.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，进一步包括禽药上可接受的辅料或载体。
5.权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗因沙门氏菌所引起的疾病，所述沙门氏菌选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物为禽类药物。
7.权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体在制备沙门氏菌抑制剂中的用途，所述沙门氏菌选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌中的至少一种。
8.一种饲料添加剂或消毒剂，其特征在于，包括权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体。
9.一种药物，其特征在于，包括权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物为禽类药物。
11.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
12.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式为注射剂、口服给药剂型或喷雾剂型。
13.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式为肠外给药剂型。
14.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体在所述药物中的效价大于106PFU/mL。
15.一种非治疗目的抑制沙门氏菌的方法，其特征在于，包括将所述沙门氏菌与权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体进行接触，所述沙门氏菌选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌中的至少一种。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述接触是在温度为4~90℃，pH值为3~12的条件下进行的。
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