TWI459951B

TWI459951B - 新穎噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物

Info

Publication number: TWI459951B
Application number: TW101134620A
Authority: TW
Inventors: Si Yong Yang; Jae Won Kim; Young Wook Cho; Young Sa Kim; Eun Mi Shin
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-11-11
Also published as: US9717768B2; EP2761029A2; WO2013042964A3; TW201318633A; WO2013042964A2; KR101432872B1; BR112014006768A2; CN103946399B; EP2761029A4; JP2014527815A; US20170128504A1; ES2612916T3; KR20130031004A; US20140348799A1; JP5872700B2; EP2761029B1; CN103946399A; US10166264B2

Description

新穎噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物

本發明係有關一種新穎噬菌體及含其之抗細菌組成物。

沙門氏桿菌之平均基因組GC含量為50至52%，其類似大腸桿菌(Escherichia coli )與志賀氏菌(Shigella) 所見者。沙門氏桿菌屬為一種會感染牲畜與人類之致病性微生物。其中一種沙門氏桿菌(Salmonella bacterium)： 腸道沙門氏桿菌(Salmonella enterica) 之血清分類具有各種不同血清型，包括雞沙門氏桿菌(Salmonella gallinarum )、雛白痢沙門氏桿菌(Salmonella pullorum )、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) (ST)、腸炎沙門氏桿菌(Salmonella enteritidis )(SE)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)、豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) (SC)、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) (SD)。其中霍亂沙門氏桿菌與德貝沙門氏桿菌為感染豬之病原菌，雞沙門氏桿菌與雛白痢沙門氏桿菌為感染禽類之病原菌，鼠傷寒沙門氏桿菌與腸炎沙門氏桿菌為感染人類與動物之病原菌，而傷寒沙門氏桿菌為感染人類之病原菌，其均會引起各別物種之疾病，造成農民與消費者之嚴重損失(Zoobises Report；英國2003)。

近年來，執行HACCP(危害分析重要管制點(Hazard analysis and critical control points))已自2003年7月1日成為韓國所有屠宰場之強制要求，因為在牲畜產品之生產過程中受到沙門氏桿菌感染之風險很高，會直接傷害豬與肉品衛生，且會出現在豬之消化道中(Jae-gil Yeh之“豬之沙門氏桿菌症之特徵與對策(Characterization and Counterplan of Salmonellosis in Pigs)，Monthly Magazine of Pig Husbandry.2004).

副傷寒係一種由沙門氏桿菌感染豬之消化道所引起之急性或慢性疾病，其特徵為腸胃炎與敗血病，主要發生在肥育期。特定言之，有些引起這種疾病之細菌病原菌可能讓人類透過攝取肉品而造成食物中毒，因此具有高度之公共衛生重要性。有各種不同沙門氏桿菌為致病性病原菌。其中已知會引起豬霍亂之豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 與豬傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhisuis) 為急性沙門氏桿菌敗血病之主因。急性腸炎發生在肥育期，併發不規則食慾、嚴重水瀉、高燒、無活力、肺炎與神經症狀。有些嚴重病例會出現皮膚脫色。鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、腸炎沙門氏桿菌(Salmonella enteritidis )與德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 為慢性腸炎之主因。

沙門氏桿菌症係經過口服途徑攝入被沙門氏桿菌污染的食物或水，因此應預防此等途徑。被污染之飼料、原料、水、或帶有此等病原菌之成豬即為感染之主要來源。在急性感染期間，每克豬糞排出高達10⁶ 個豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 或10⁷ 個鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 。然而，許多實驗性感染報告指出，使用10⁸ 至10¹¹ 個沙門氏桿菌才可成功複製疾病。在實驗中注射10³ 個沙門氏桿菌至豬體內，接受注射之豬不會出現症狀，但同一欄中的其他豬則出現典型臨床症狀。此等結果顯示，天然感染之豬體內會出現大量沙門氏桿菌生長，造成其他豬感染(Jung-Bok Lee之“新近爆發之豬沙門氏桿菌與增生性腸病之控制(Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and Proliferative Enteropathy)”，韓國養豬協會(Korea Swine Association),2009)。

目前，嚴重病毒感染(如：豬生殖與呼吸症候群(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)(PRRS)與豬環狀病毒(Porcine Circovirus)(PCV2))已在韓國養豬業中造成巨大經濟損失，因此疾病之管理多著重在此等疾病。由於此等細菌性疾病可能造成之傷害遠大於病毒性疾病，因此已開始禁止飼料添加抗生素且應提早研究疾病之發生或進行疾病管理(Jung-Bok Lee之“新近爆發之豬沙門氏桿菌與增生性腸病之控制(Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and Proliferative Enteropathy)”(Infectious Disease Laboratory,College of Veterinary Medicine,Konkuk University,Livestock Product Safety,2010))(Robert W.Wills,Veterinary Microbiology,1999)。同時，細菌噬菌體(亦稱為噬菌體)為一種僅感染特定細菌之專一性病毒，其會控制細菌生長且僅在細菌宿主內自行複製。在發現細菌噬菌體後，最初極有信心將其應用在治療傳染性疾病。然而，當普遍使用廣效性抗生素時，細菌噬菌體卻因其專一靶向性質而被視為沒有必要使用。抗生素或抗微生物劑已廣泛用於治療由細菌性感染引起之傳染性疾病。儘管如此，誤用及濫用抗生素仍會產生抗生素抗性問題及在食物中殘留抗生素之有害效應。然而，排除目前飼料添加用抗生素可能增加細菌性疾病之發生，包括已被抗生素控制之沙門氏桿菌症，如同實驗數據或其他國家所預期。因此極需要針對沙門氏桿菌管理建立詳細之操作指南(Jung-Bok Lee之“新近爆發之豬沙門氏桿菌與增生性腸病之控制(Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and Proliferative Enteropathy)”，(Infectious Disease Laboratory,College of Veterinary Medicine,Konkuk University,Livestock Product Safety.2010))。

這些不斷發生之問題讓細菌噬菌體重新受到重視。美國專利案案號6,485,902(2002)已揭示用於控制大腸桿菌(E.coli )O157：H7之七種細菌噬菌體，且美國專利案案號6,942,858(頒予Nymox，2005)揭示用於控制各種不同微生物之兩種細菌噬菌體。許多公司已積極嘗試使用細菌噬菌體發展各種不同產品。EBI食品系統(EBI food system)(歐洲)已發展出一種食物添加劑，用於預防由單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) 引起之食物中毒，稱為Listerix-P100，其係由USFDA核准之第一種噬菌體產品。亦已發展一種基於噬菌體之產品LMP-102作為對抗單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) 之食品添加劑，已由GRAS(公認安全性(Generally Regarded As Safe))核准使用。在2007年，OmniLytics已製造一種在牛之屠宰期間用於預防大腸桿菌(E.coli) 0157污染之基於噬菌體之洗液，已由美國農業部食品安全暨檢驗服務局(USDA's Food Safety and Inspection Service(FSIS))核准使用。在歐洲，已於2003與2005年註冊使用產孢梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes) 噬菌體NCIMB 30008與梭狀芽孢桿菌(Clostridium tyrobutiricum) 噬菌體NCIMB 3000，分別作為對抗飼料中梭狀芽孢桿菌污染之飼料防腐劑。此等研究顯示，使用細菌噬菌體控制對抗生素無感受性之細菌及人畜共生病原菌對畜產品之污染之研究仍在持續進行中。

然而，大多數噬菌體生物防治研究著重在控制大腸桿菌(E.coli) 、李斯特氏菌(Listeria) 與梭狀芽孢桿菌(Clostridium )。沙門氏桿菌亦為人畜共生病原菌，而由此病原菌引起之傷害並未降低。如上述，由於沙門氏桿菌出現多重抗藥性，因此韓國已依據“預防接觸性傳染病之實施條例(執行指令16961)(the Enforcement Decree of the Act on the Prevention of Contagious Disease(Executive Order 16961))”、“預防接觸性傳染病之實施法令(衛生福利部指令179)(Enforcement Ordinance of the Act on the Prevention of Contagious Disease(Ministry of Health and Welfare's Order 179))”與國家衛生署(執行指令17164)(Organization of the National Institute of Health(Executive Order 17164))”進行全國性抗微生物之抗性追蹤。因此需要發展一種可以控制沙門氏桿菌之細菌噬菌體。

為了克服因誤用或濫用廣效性抗生素所引發之問題(如：抗藥性細菌與食物中之藥物殘留性)，本發明者已自天然來源單離出一種噬菌體，其中該噬菌體對引發牲畜主要疾病之沙門氏桿菌具有專一性殺細菌活性。因此，由其形態、生化與遺傳特性來判別，他們發現該噬菌體對豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) (SC)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) (ST)、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) (SD)、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) (SI)與新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) (SN)具有專一性殺細菌活性，不會影響有益細菌，此外亦展現優異之抗酸性與抗熱性。此外，他們發現該噬菌體可應用於組成物中，供預防或治療鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 所介導之疾病，如：牲畜之沙門氏桿菌症與沙門氏桿菌食物中毒，及應用於供有效預防與控制沙門氏桿菌增生之各種不同產品，包括牲畜飼料添加劑、牲畜飲用水、畜棚消毒劑與肉品清潔劑，因而完成本發明。

本發明之一目的係提供一種對豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 具有殺細菌活性之新穎噬菌體。

本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之組成物，供預防或治療由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 引起之傳染性疾病。

本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之抗生素。

本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之動物飼料或飲用水。

本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之消毒劑或清潔劑。

本發明另一目的係提供一種使用該噬菌體或該組成物預防或治療由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 所引起傳染性疾病之方法。

第1圖為屬於長尾噬菌體科(Siphoviridae) 型態B1之ΦCJ11之電子顯微鏡照片，其特徵在於等長殼體與非收縮性長尾；第2圖為顯示沙門氏桿菌菌苔中所形成ΦCJ11噬菌斑之照片，其中(A,B：SC，C：SG，D：ST，E：SI，F,G：SD，H：SN)，於SC、ST、SI、SD與SN之菌胎中觀察到溶菌斑形成，但未出現在SG之菌胎中；第3圖為單離之噬菌體ΦCJ11之SDS-PAGE結果，其中在33 kDa、55 kDa與69.5 kDa檢測到主要蛋白質，並採用Precision plus蛋白質標準物(BIO-RAD)作為標記物；第4圖為單離之噬菌體ΦCJ11之PFGE結果，其中ΦCJ11之總基因組大小為約140 kbp，且採用CHEF DNA大小標準物Lambda Ladder(Bio-Rad)作為DNA大小標記物；第5圖為使用ΦCJ11基因組DNA之各引子組進行PCR之結果，其中A：SEQ ID NO.5與6之引子組，B：SEQ ID NO.7與8之引子組，C：SEQ ID NO.9與10之引子組，及D：SEQ ID NO.11與12之引子組，且所有A、B、C與D條帶均含有約1 kbp或以上至2 kbp或以下之PCR產物；第6圖為噬菌體ΦCJ11之抗酸性分析結果，其顯示噬菌體在pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0、9.0、9.8與11.0之存活數，其中與對照組比較，噬菌體ΦCJ11直到pH 5.5 均仍未喪失其活性，但噬菌體ΦCJ11在pH 4與pH 3.5出現活性下降，且在pH 3.0或以下時完全喪失活性；第7圖為噬菌體ΦCJ11之抗熱性分析結果，其顯示噬菌體在37、45、53、60與70℃下0、10、30、60與120分鐘後之存活數，其中噬菌體ΦCJ11即使曝露在60℃下長達2小時仍保有其活性；第8圖為噬菌體ΦCJ11在利用SpeedVac濃縮器乾燥後之耐乾性分析結果，其中測定乾燥條件下之效價變化，並與乾燥前之效價比較，該活性可在60℃下維持長達1小時；及第9圖為對Sprague-Dawley大鼠經口投與一劑ΦCJ11後因毒性造成之體重變化結果，其中投與ΦCJ11之前及投與1、3、7、10與14天後，與對照組比較，沒有觀察到顯著變化(■；雄對照組，口；雄ΦCJ11，●；雌對照組，○；雌ΦCJ11)。

[有益效果]

本發明新穎噬菌體具有針對豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 之專一性殺細菌活性，但不會影響有益細菌，且具有優異之抗酸性與抗熱性，與耐乾性。因此，該新穎噬菌體可用於預防或治療沙門氏桿菌症或沙門氏桿菌食物中毒，其係由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 引起之傳染性疾病，該噬菌體亦廣泛用於動物飼料、牲畜飲用水、消毒劑與清潔劑。

[最佳模式]

達成上述目的之一項態樣中，本發明提供一種對豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 具有專一性殺細菌活性之新穎噬菌體。

本發明者從豬舍所收集之糞便與污水樣本中單離出會溶解宿主細胞SC之噬菌體。他們亦發現此等噬菌體會溶解ST、SD、SI與SN(第2圖與表1)。在電子顯微鏡下檢視之形態證實該噬菌體(ΦCJ11)屬於長尾噬菌體科(Siphoviridae )型態B1(第1圖)。此外，由蛋白質型態分析法發現該噬菌體ΦCJ11之主要結構蛋白為約69.5 kDa、55 kDa與33 kDa(第3圖)，且基因組(genome)分析法顯示ΦCJ11之總基因組大小為約97至145.5 kbp(第4圖)。此外，其基因特徵之分析結果顯示，該噬菌體在總基因組中包括如SEQ ID NO.1至4代表之核酸分子(實例6)。依據SEQ ID NO.1至4，比較其與其他物種之遺傳相似性。已發現該噬菌體與已知噬菌體顯示極低之遺傳相似性，此表示該噬菌體為一種新穎噬菌體(表2)。為了進一步詳細分析遺傳特徵，採用ΦCJ11-專一性引子組，亦即SEQ ID NO.5與6、SEQ ID NO.7與8、SEQ ID NO.9與10、及SEQ ID NO.11與12進行PCR。發現各PCR產物之大小分別為1.4 kbp、1.2 kbp、1.25 kbp與1.5 kbp(第5圖)。

同時，當使用ΦCJ11感染SC、ST、SD、SI與SN時，觀察到該噬菌體噬菌斑(宿主細胞被其中一種噬菌體溶解而在軟瓊脂上形成之透明區域)(第2圖)。在各種不同溫度與與pH條件檢測Φ CJ11之安定性，發現Φ CJ11可在pH 3.5至pH 11.0之寬廣pH範圍環境(第6圖)及於37℃至70℃之高溫環境(第7圖)，及甚至在乾燥後(第8圖)仍保持安定。此外，亦發現野生型菌株SC、ST、SD、SI與SN落在Φ CJ11之宿主細胞範圍內(表3)。

最後，於Φ CI11對無專一性病原菌(SPF)之紐西蘭白兔之皮膚與眼睛刺激試驗中顯示，現狀皮膚刺激指數(PII)為0.33，表示沒有刺激性，且洗滌組與未洗滌組在整個實驗期間之急性眼睛刺激指數(IAOI)為0，表示沒有刺激性。Φ CJ11之經口投藥結果顯示，體重增量沒有變化(第9圖)。此外，未觀察到死亡率、一般症狀(表4)與器官異常(表5)，表示沒有毒性。

因此，本發明者稱該噬菌體為“噬菌體Φ CJ11”，其中從豬舍所收集之糞便與污水樣本中單離出噬菌體，且具有對抗SC、ST、SD、SI與SN之專一性殺細菌活性及上述特徵，且於2011年9月9日寄存在韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms(361-221,Honje 1,Seodaemun,Seoul))，登錄編號KCCM11208P(亦於2012年12月21日寄存於財團法人食品工業發展研究所(台灣(R.O.C.)，(300)新竹市食品路331號，寄存編號為BCRC 970061)。

達成上述目的之另一項態樣中，本發明提供一種供預防或治療由選自：豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 與新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 所組成群中之一或多種沙門氏桿菌所引起傳染性疾病之組成物，其包含該噬菌體作為活性成份。

本發明噬菌體具有對抗豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 與新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 之專一性殺細菌活性，可用於預防或治療此等細菌所引起之疾病。較佳者，傳染性疾病實例包括由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 或鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 引起之豬沙門氏桿菌症與沙門氏桿菌食物中毒，及由德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 、新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 引起之急性或慢性豬腸炎，但不受此限制。

本文所採用術語“沙門氏桿菌症”係指感染沙門氏桿菌後之症狀，如：發燒、頭痛、下痢、與嘔吐。亦即該沙門氏桿菌症係感染沙門氏桿菌屬之細菌，可由兩種臨床型式來定義：類似傷寒之急性敗血症與急性腸胃炎，包括腸炎、食物中毒、與急性敗血症。

本文所採用術語“預防”係指藉由投與組成物來限制或延滯疾病進展之所有作用。

本文所採用術語“治療”係指藉由投與組成物使病症好轉或受到限制或達成有利修飾之所有作用。

本發明組成物之ΦCJ11含量為1×10² 至1×10¹² PFU/mL，較佳含量為1×10⁶ 至1×10¹⁰ PFU/mL。

另一方面，本發明組成物可進一步包括醫藥上可接受之載劑。

本文所採用術語“醫藥上可接受之載劑”係指不會顯著刺激生物體且不會影響所投與化合物之生物活性與性質之載劑或稀釋劑。調配組成物形成液態製劑時，可使用無菌且生物上可相容之醫藥上可接受之載劑，如：食鹽水、無菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)、緩衝生理食鹽水、白蛋白輸液、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、及其中一或多種之混合物。若必要時，可添加其他習知之添加劑，如：抗氧化劑、緩衝劑與制細菌劑。此外，可再添加稀釋劑、勻散劑、表面活性劑、黏結劑與潤滑劑至組成物中，製成注射用調配物，如：水溶液、懸浮液與乳液，或口服調配物，如：丸劑、膠囊、粒劑或錠劑。

本發明預防性或治療性組成物可塗覆或噴灑至患部，或經口或非經腸式途徑施用。非經腸式投藥法包括經靜脈內、腹膜內、肌肉、皮下或局部投藥。

適合塗覆、噴灑或投與本發明組成物之劑量將隨各種不同因素而定，包括調配方法、投藥模式、患者之年齡、體重、性別、病症、及所治療患者或動物之飲食、投藥時間、投藥途徑、排泄速率、及反應敏感度。熟悉此相關技術之醫師或獸醫很容易決定及處方所需組成物之有效量。

包括本發明組成物作為活性成份之口服劑型實例包括錠劑、糖錠、口含錠、水性或乳化懸浮液、粉劑或粒劑、乳液、硬式或軟式膠囊、糖漿或酏劑。調配如錠劑與膠囊時，適合使用下列：黏結劑，如：乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、支鏈澱粉、纖維素或明膠；賦形劑，如：磷酸二鈣；崩解劑，如：玉米澱粉或甘藷澱粉；與潤滑劑，如：硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂基富馬酸鈉、或聚乙二醇蠟。膠囊中除了上述化合物外，可進一步使用液態載劑，如：脂質。

包括本發明組成物作為活性成份之非經腸式劑型可調配成經由皮下、靜脈內或肌肉途徑之注射劑、栓劑、或經由呼吸道之吸入式噴液，如：氣霧劑。注射劑型之製法可由本發明組成物與安定劑或緩衝劑共同溶解或懸浮於水中，並取該溶液或懸浮液裝入安瓿或小瓶單位劑型中。噴灑液(如：氣霧劑)中可使用供噴灑水分散性濃縮劑或濕化粉劑之推進劑，與添加劑組合使用。

另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種包含該噬菌體作為活性成份之抗生素。

本文所採用術語“抗生素”係指任何施用至動物以殺死病原菌之藥物，在本文中作為抗菌劑、殺細菌劑與抗細菌藥劑之通稱名詞。該動物可為哺乳動物，包括人類。不同於習知之抗生素，本發明噬菌體對沙門氏桿菌具有高度專一性，因此可殺死專一性病原菌，不會影響有益細菌，且不會誘發抗藥性，因此可提供作為具有相當長生命循環之新穎抗生素。

另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種包含該噬菌體作為活性成份之動物飼料或飲用水。

畜牧業與漁業所使用之飼料添加用抗生素係用於預防感染。然而，目前可取得之大多數飼料添加用抗生素均具有誘發抗藥性菌株之問題，且因會殘留在牲畜產品中而傳送至人體。攝入收此等殘留抗生素可能造成人類病原菌亦對抗生素產生抗性，造成疾病傳播。此外，由於有許多種飼料添加用抗生素，因此全球日益增加出現之多重抗藥性菌株將成為嚴重問題。因此，可使用本發明噬菌體作為飼料添加用抗生素，其對環境較有利且可以解決上述問題。

本發明動物飼料製法可直接添加噬菌體或呈分開之飼料添加劑加至動物飼料中。本發明噬菌體可呈液體或固體型式(較佳呈乾燥粉末)包含在動物飼料中。乾燥過程可採用風乾法、天然乾燥法、噴霧乾燥法與冷凍乾燥法進行，但不受此限。本發明噬菌體可呈粉末型式添加，其添加量佔動物飼料重量之0.05至10重量%，較佳為0.1至2重量%。動物飼料中除了本發明噬菌體外，亦可包括可供長期防腐之習用添加劑。

本發明之飼料添加劑可額外包括其他非病原性微生物。該可使用之其他微生物可選自下列各物所組成群中：可產生蛋白醇、脂酶與轉化酶之枯草桿菌(Bacillus subtilis) 、具有生理活性且在厭氧條件下(如：牛胃中)具有分解功能之乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)菌株、可提高家畜體重、增加乳產量及促進飼料消化與吸收之絲狀真菌(包括米麴菌(Aspergillus oryzae) (J Animal Sci 43：910-926,1976)與酵母，包括釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae) (J Anim Sci56：735-739,1983)。

包括本發明ΦCJ11之飼料可包括植物性飼料，如：穀粒、堅果、食品副產物、海藻、纖維、藥物副產物、油類、澱粉、磨粉、穀類副產物，及動物性飼料，如：蛋白質、無機物、脂肪、礦物質、脂肪、單細胞蛋白質、浮游動物與食品廢棄物，但不受限於此。

包括本發明ΦCJ11之飼料添加劑可包括黏結劑、乳化劑、與用於預防品質損壞之防腐劑、胺基酸、維生素、酵素、益生菌、調味劑、非蛋白質氮、矽酸鹽、緩衝劑、著色劑、供改善效率之抽出物與寡醣，及其他飼料預混合物，但不受限於此。

此外，供應與本發明噬菌體混合之飲用水可降低牲畜腸內之沙門氏桿菌數量，藉以得到無沙門氏桿菌之牲畜。

另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種包含該噬菌體作為活性成份之消毒劑或清潔劑。

另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種使用該噬菌體或組成物治療由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 引起之傳染性疾病之方法。

詳言之，本發明之治療法包括將醫療有效量之噬菌體或組成物投與患有由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 或新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 所引起傳染性疾病之個體之步驟。

本發明之噬菌體或組成物可呈醫藥調配物型式投與動物或可呈與動物飼料或飲用水混合之混合物讓動物食入，較佳呈與動物飼料混合之混合物。

只要其可到達目標組織，不論口服或非經腸式，任何途徑均可用於投與本發明噬菌體或組成物。詳言之，本發明組成物可依典型方式，經由任何途徑投藥，如：經口、直腸、局部、靜脈內、腹膜內、肌肉、動脈內、穿皮式、鼻內、與吸入途徑。

熟悉此相關技術者咸了解，利用醫療法投與之本發明噬菌體或組成物之每日總劑量應由醫師透過適當醫學判斷來決定。較佳者，針對特定患者之醫療有效量可能隨醫學技藝習知之各種不同因素變化，包括所要達成反應之種類與程度、患者之條件，如：年齡、體重、健康狀態、性別與飲食、投藥時間途徑、組成物之分泌速率、醫療之時間期、依據是否同時使用其他藥劑之具體組成物，等等。

[發明模式]

下文將參照實例更詳細說明本發明。然而，此等實例僅供說明用，且本發明不受限於此等實例。

實施例1：沙門氏桿菌噬菌體單離法實施例1-1：噬菌體篩選法與單一噬菌體單離法

從豬舍與污水取50mL樣本移至離心管中，於4000rpm下離心10分鐘。然後，使用0.45μm濾器過濾上清液。取18mL樣本濾液與150μl豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) (“SC”)振盪培養基(OD₆₀₀ =2)及2mL 10× Luria-Bertani培養基(蛋白腖10g/L、酵母抽出物5g/L與NaCl 10g/L：LB培養基)混合。混合物於37℃下培養18小時，培養基於4000 rpm下離心10分鐘。上清液使用0.2μm濾器過濾。混合3mL 0.7%瓊脂(w/v)與150μl SC振盪培養基(OD₆₀₀ =2)，塗佈在LB分析板(“上層瓊脂(top-agar)”)上，使其固化。塗開10μl培養基濾液，於37℃下培養18小時，於上層瓊脂上滴定噬菌體溶胞物之效價，稱為軟瓊脂覆層法。

取含噬菌體溶胞物之樣本培養基經過適當稀釋，與150μl SC振盪培養基(OD₆₀₀ =2)混合後，進行軟瓊脂覆層法，因此得到單一噬菌斑。單一噬菌斑代表一個噬菌體，且因此單離一個細菌噬菌體，取一個噬菌體噬菌斑加至400μl SM溶液(NaCl，5.8g/L、MgSO₄ 7H₂ O，2g/L、1M Tris-Cl(pH 7.5)50ml/L)，於室溫下靜置4小時，以單離出單一噬菌體。為了大量純化噬菌體，自單一噬菌體溶液中取出100μl上清液，與12mL 0.7%瓊脂及500μl SC振盪培養基混合後，於直徑150mm之LB分析板上進行軟瓊脂覆層法。當完全溶胞後，添加15mL SM溶液至分析板。分析板於室溫下溫和振盪4小時，使噬菌體自上層瓊脂溶離出。回收含溶離之噬菌體之SM溶液，添加氯仿至最終體積1%，均勻混合10分鐘。溶液於4000rpm下離心10分鐘。所得上清液使用0.45μm濾器過濾，存放在冰箱中。

實施例1-2：大批量細菌噬菌體

取選拔之噬菌體使用SC大量培養。SC經過振盪培養，取一份1.5×10¹⁰ cfu(菌落形成單位)於4000rpm下離心10分鐘，取集結粒再懸浮於4ml SM溶液中。接種9.0×10⁸ PFU(噬菌斑形成單位)噬菌體(MOI：感染倍數=0.001)，置於37℃下20分鐘。接種溶液至150ml LB培養基中，於37℃下培養5小時。添加氯仿至最終體積1%，培養液振盪20分鐘。添加DNase I與RNase A至最終濃度分別為1 μg/ml。溶液置於37℃下30分鐘。添加NaCl與PEG(聚乙二醇)最終濃度分別為1 M與10%(w/v)，並再置於4℃下3小時。溶液於4℃與12,000 rpm下離心20分鐘，上清液棄置不要。取集結粒再懸浮於5mL SM溶液中，置於室溫下20分鐘。添加4mL氯仿並混合均勻後，於4℃與4000 rpm下離心20分鐘。上清液使用0.2μm濾器過濾，噬菌體經過甘油密度梯度超離心法純化(密度：40%、5%甘油，於35,000 rpm與4℃下1小時)。純化之噬菌體稱為“噬菌體ΦCJ11”，並再懸浮於300μlSM溶液後，滴定。噬菌體ΦCJ11於2011年9月9日寄存在韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms(361-221,Honje 1,Seodaemun,Seoul))，登錄編號KCCM11208P。

實施例2：ΦCJ11感染沙門氏桿菌之檢測法

為了分析所選拔噬菌體對SC以外之沙門氏桿菌菌種之溶胞活性，試圖使用其他沙門氏桿菌菌種進行交叉感染。結果，ΦCJ11會感染SC(豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis )、ST(鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium )、SD(德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby )、SN(新港沙門氏桿菌(Salmonella newport )、SI(嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis )、SA(Salmonella arizonae )與SB(Salmonella bongori )，但不感染SE(腸炎沙門氏桿菌(Salmonella enteritidis )、SG(雞沙門氏桿菌(Salmonella gallinarum) 、與SP(雛白痢沙門氏桿菌(Salmonella pullorum ))(表1與第2圖)。

此外，第2圖為出示沙門氏桿菌細菌菌胎中所形成ΦCJ11噬菌斑之照片。如第2圖(A,B：SC,C：SG,D：ST,E：SI,F,G：SD,H：SN)所示，噬菌斑之形成出現在SC、ST、SI、SD與SN之菌胎中，但未出現在SG之菌胎。

實施例3：ΦCJ11之形態

取純化之ΦCJ11於SM緩衝液中稀釋後，塗覆在銅網格上，使用2%乙酸鈾染色3至5秒，及乾燥。在穿透式電子顯微鏡下檢視(LIBRA 120,Carl Zeiss穿透式電子顯微鏡，80 kV，放大倍數×120,000~×200,000)(第1圖)。第1圖為ΦCJ11之電子顯微鏡照片。如第1圖所示，發現該純化之ΦCJ11屬於長尾噬菌體科(Siphoviridae )型態B1，其特徵在於等長殼體與非收縮性長尾。

實施例4：ΦCJ11之蛋白質型態分析法

取15μL純化至效價10¹¹ PFU/mL之ΦCJ11溶液與3 L 5×SDS樣本溶液混合，加熱5分鐘。進行12% SDS-PAGE後，使用考瑪希藍於室溫下染色1小時(第3圖)。第3圖為單離之噬菌體ΦCJ11之SDS-PAGE結果，其中使用Precision plus蛋白質標準物(BIO-RAD)作為標記物。如第3圖所示，在33kDa、55kDa與69.5kDa處檢測到主要蛋白質。

實施例5：ΦCJ11之總基因組DNA大小之分析

採用超離心法單離純化之ΦCJ11之基因組DNA。詳言之，在純化之ΦCJ11培養基中添加EDTA(乙二胺四乙酸(pH 8.0))、蛋白酶K與SDS(十二烷基硫酸鈉)，最終濃度分別為20 mM、50 ug/mL與0.5%(w/v)，然後於50℃下培養1小時。添加等體積酚(pH 8.0)，並混合均勻。於室溫與12,000rpm下離心10分鐘後，取上清液與等體積PC(酚：氯仿=1：1)均勻混合。再次於室溫與12,000 rpm下離心10分鐘。然後取得上清液，與等體積氯仿混合後，於室溫與12,000 rpm下離心10分鐘。取所得之上清液與1/10份體積之3M乙酸鈉及2份體積之冷95%乙醇混合，置於-20℃下1小時。於0℃與12,000rpm下離心10分鐘後，完全移除上清液，取DNA集結粒溶於50μL TE(Tris-EDTA(pH 8.0))。取萃取之DNA稀釋10倍，並測定OD₂₆₀ ，以決定其濃度。添加1μg總基因組DNA至1% PFGE(脈衝式凝膠電泳)瓊脂凝膠上，於BIORAD CHEF DR II PFGE系統中，在時間切換梯度50至90秒，6 V/cm(200V)之條件下，於14℃下進行電泳22小時。採用CHEF DNA Size Standard Lambda Ladder(Bio-Rad)作為DNA大小標記物(第4圖)。第4圖為單離之噬菌體ΦCJ11之PFGE結果。如第4圖所示，在48.5至1,000 kbp之間觀察到約140 kbp之DNA。

實施例6：ΦCJ11之遺傳分析

為了純化之ΦCJ11之遺傳分析，取5μg ΦCJ11之基因組DNA經過限制酶PstI 、XbaI 與BamHI 、EcoRI 與SalI 之雙重分解。載體pCL1920(Promega)使用限制醇PstI 、XbaI 與BamHI 、EcoRI 與SalI 分解後，以CIP(仔牛腸鹼性磷酸醇)處理。分解之基因組DNA依3：1之比例與載體混合，於16℃下黏合2小時。所得重組載體轉化至大腸桿菌(E.coli) DH5a中，然後塗覆在包含觀黴素(specinomycin)與X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-哌喃半乳糖苷)LB分析板上，供選拔藍色/白色菌落。取選拔之菌落於包含抗生素之培養基中振盪培養16小時。然後使用質體純化套組(Plasmid purification kit(Promega))萃取質體。

使用引子組FTR135與FTR136(SEQ ID NO.13與14)進行PCR，證實選殖之質體，並僅選拔1kb或更長之嵌段。使用引子組分析其核苷酸序列。所得核苷酸序列分別示於SEQ ID NO.1至4，其大小分別為1至2kbp或更小，並藉助於NCBI blastx與blastn程式分析序列相似性，其結果示於下表2。

實施例7：ΦCJ11-專一性引子序列之設計

為了判別ΦCJ11，依據SEQ ID NO.1至4設計ΦCJ11-專一性引子。使用各引子組SEQ ID NO.5與6、SEQ ID NO.7與8、SEQ ID NO.9與10、及SEQ ID NO.11與12進行PCR。添加0.1μg噬菌體之基因組DNA及0.5 pmol各引子至預混合物(Bioneer)中，調整最終體積至20μL。PCR如下進行30次循環：變性：94℃ 30秒；黏合：55℃ 30秒；及聚合：72℃ 1.5分鐘(第5圖)。第5圖為使用ΦCJ11基因組DNA之各引子組進行PCR之結果。A：引子組SEQ ID NO.5與6；B：引子組SEQ ID NO.7與8；C：引子組SEQ ID NO.9與10；及D：引子組SEQ ID NO.11與12。所有A、B、C與D條帶均具有約1至2 kbp之PCR產物。如第5圖所示，使用引子組SEQ ID NO.5與6、SEQ ID NO.7與8、SEQ ID NO.9與10、及SEQ ID NO.11與12得到之PCR產物之大小為約1 kbp或以上至2 kbp或以下。

實施例8：細菌噬菌體之pH安定性

為了決定ΦCJ11是否可在豬胃之低pH環境下存活之安定性，在寬廣之pH範圍下分析ΦCJ11(pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0、9.8與11.0)。製備各種不同pH溶液(乙酸鈉緩衝液(pH 2.1、pH 4.0、pH 5.5與pH 6.4)、檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5、pH 3.0，與pH 3.5)、磷酸鈉緩衝液(pH 6.9與pH 7.4)與Tris-HCl(pH 8.2、pH 9.0、pH 9.8與pH 11.0))，其等濃度為0.2 M。各pH溶液取180μL與20μL噬菌體溶液(1.0×10¹¹ PFU/mL)混合，產生濃度1M之各pH溶液，然後於室溫下培養2小時。反應溶液經過連續稀釋，各取10μL稀釋液於37℃下培養18小時，進行軟瓊脂覆層法，來測定噬菌體溶胞物之效價(第6圖)。第6圖為噬菌體ΦCJ11抗酸性分析結果，其出示噬菌體在pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0、9.0、9.8與11.0下之存活數。噬菌體ΦCJ11直到pH 5.5仍未喪失其活性。然而，與對照組比較，噬菌體ΦCJ11在pH 4與pH 3.5顯示下降之活性，並在pH 3.0或以下完全喪失其活性。如第6圖所示，噬菌體在pH降至5.5時仍未喪失其活性且保持安定，但在pH 3.0或以下即喪失其活性。

實施例9：噬菌體之熱安定性

為了作為飼料添加劑使用，分析噬菌體對調配過程中所產生熱之安定性。因此，取200μL ΦCJ11溶液(效價1.0×10¹¹ PFU/mL)於37℃、45℃、53℃、60℃與70℃下培養0分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘與120分鐘。連續稀釋溶液，各取10μL稀釋液，採用軟瓊脂覆層法，於37℃下培養18小時，測定噬菌體溶胞物之效價(第7圖)。第7圖為噬菌體ΦCJ11之抗熱性分析結果，其顯示噬菌體在37℃、45℃、53℃、60℃與70℃下0、10、30、60與120分鐘之存活數。如第7圖所示，當噬菌體ΦCJ11曝露在60℃長達2小時時仍維持其活性。

實施例10：噬菌體之耐乾性

為了作為飼料添加劑使用，分析噬菌體ΦCJ11在調配過程中所設定之乾燥條件下之耐受性。依據熱安定性分析法所得之結果，採用SpeedVac濃縮器進行乾燥分析法。取200μL ΦCJ11溶液(效價1.0×10¹¹ PFU/mL)於60℃下真空乾燥2小時，取所得集結粒完全再懸浮於4℃之200μL SM溶液中一天，測定效價值(第8圖)。第8圖為藉助於SpeedVac濃縮器乾燥之噬菌體ΦCJ11之耐乾性結果。如第8圖所示，當與乾燥前之效價比較乾燥條件下之變化時，其在60℃下維持其活性長達1小時。

實施例11：噬菌體之感染範圍

實驗中除了使用SC(ATCC SC10708)外，亦分析ΦCJ11對抗野生型(2種菌株)、豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) (5種菌株)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) (17種菌株)、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) (4種菌株)、新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) (6種菌株)、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) (2種菌株)與都伯林沙門氏桿菌(Salmonella dublin) (3種菌株)之溶胞活性，該等菌株均來自首爾國立大學獸醫醫學院禽類疾病實驗室(Laboratory of Avian Diseases,College of Veterinary Medicine,Seoul National University)，各菌株取150μL振盪培養基(OD₆₀₀ =2)混合，採用軟瓊脂覆層法，與10μL ΦCJ11溶液(效價10¹⁰ PFU/mL)於37℃下培養18小時，追蹤噬菌斑之形成(表3)。在SC之8種菌株中觀察到噬菌體噬菌斑之形成。

實施例12：噬菌體之毒性分析法

皮膚與眼睛刺激性試驗係於無專一性病原菌(SPF)之紐西蘭白兔(其共用於噬菌體ΦCJ11供預防沙門氏桿菌症與沙門氏桿菌食物中毒之毒性試驗)中進行，並累積其實驗數據，以方便分析實驗結果。使用已施加試驗物質(每個部位施加0.5mL)之2.5cm×2.5cm紗布覆蓋並接觸兔子之正常腹部皮膚(未損傷皮膚)與損傷之腹部皮膚。未觀察到一般症狀之變化，在施用試驗物質一天後觀察到輕微體重下降，其很可能係因閉鎖性施加試驗藥物引起之壓力所致。在皮膚刺激試驗中，現狀皮膚刺激指數(PII)為0.33，表示沒有刺激性。進行眼睛刺激性試驗時，在兔子左眼施加試驗物質，然後與沒有施用試驗物質之右眼比較。在實驗期間，未觀察到與施用試驗物質相關之一般症狀及體重變化。施用試驗物質後，眼睛實驗顯示急性眼睛刺激性指數(IAOI)為“0”，表示沒有刺激性。因此，此等結果顯示該新穎噬菌體ΦCJ11沒有毒性。

此外，對Sprague-Dawley大鼠經口投與一劑ΦCJ11，進行毒性分析法。試驗物質投藥組接受1×10¹¹ PFU/kg之ΦCJ11處理，賦形劑對照組接受作為賦形劑之媒劑[20 mM Tris-HCl(pH 7.0)+2mM MgCl₂ ]處理，每組10隻大鼠(雌鼠與雄鼠各5隻)，經口投與單一劑量。追蹤死亡率、一般症狀、體重變化與驗屍結果歷時2週，並相互比較。在投藥當天，從投藥後30分鐘至1小時內開始，每6小時追蹤一次。然後一天追蹤一次一般症狀，歷時14天，並記錄(表4與5)。

如表4與5所示，沒有任何動物死亡，且ΦCJ11未產生任何毒性症狀，亦無顯著臨床症狀。其結果綜合示於表4與5。在投藥前及投藥後1、3、7、10與14天時記錄體重。與對照組比較，沒有觀察到體重之顯著變化。

同時，體重變化之結果顯示，ΦCJ11不會引起足以降低食慾或改變體重之毒性反應。此等結果示於第9圖。第9圖為對Sprague-Dawley大鼠經口投與單一劑ΦCJ11後因毒性引起之體重變化。如第9圖所示，在投藥前與投藥1、3、7、10與14天後觀察到之體重變化顯示，其體重沒有與對照組出現顯著變化(■；雄對照組，□；雄ΦCJ11，●；雌對照組，○；雌ΦCJ11)。

因此，已發現雌鼠與雄鼠中該新穎噬菌體ΦCJ11之ADL均超過1×10¹¹ PFU/kg，因此其沒有毒性。

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 新穎噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物

<130> OPA12111

<150> 10-2011-0094648

<151> 2011-09-20

<160> 14

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 1643

<212> DNA

<213> 噬菌體CJ11

<400> 1

<210> 2

<211> 1464

<212> DNA

<213> 噬菌體CJ11

<400> 2

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<211> 1324

<212> DNA

<213> 噬菌體CJ11

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<211> 1666

<212> DNA

<213> 噬菌體CJ11

<400> 4

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<223> 引子

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<212> DNA

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<223> 引子

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<212> DNA

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<223> 引子

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<213> 人工序列

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<400> 11

<210> 12

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<213> 人工序列

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<223> 引子

<400> 12

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 13

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 14

由於本案的圖為試驗數據，故本案無指定代表圖。

Claims

一種對豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 具有專一性殺細菌活性之單離噬菌體，其識別之登錄號為BCRC 970061。
一種供預防或治療由沙門氏桿菌所引起傳染性疾病之組成物，該沙門氏桿菌係選自下列各物所組成群：豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis )、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium )、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby )、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis )、新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 與其組合，該組成物包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中該由豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 或鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 引起之傳染病疾病為沙門氏桿菌症或沙門氏桿菌食物中毒，且該由德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby )、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 與新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 引起之傳染性疾病為細菌性感染型沙門氏桿菌食物中毒。
一種抗生素，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
一種動物飼料或飲用水，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
一種消毒劑或清潔劑，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
一種如申請專利範圍第1項所述之噬菌體之用途，其係用於製造預防或治療由一或多種沙門氏桿菌引起之傳染性疾病之組成物，其中，該沙門氏桿菌係選自下列各物所組成群：豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 、新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 與其組合。
一種如申請專利範圍第2項所述之組成物之用途，其係其係用於製造預防或治療由一或多種沙門氏桿菌所引起之傳染性疾病之藥物，其中，該沙門氏桿菌係選自下列各物所組成群：豬霍亂沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis) 、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium) 、德貝沙門氏桿菌(Salmonella derby) 、嬰兒沙門氏桿菌(Salmonella infantis) 、新港沙門氏桿菌(Salmonella newport) 與其組合。