CN103946399B - 新的噬菌体和包括其的抗菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的具有针对沙门氏菌的特异杀菌活性的噬菌体；用于预防或治疗传染病的组合物——包括噬菌体作为活性成分；包括噬菌体作为活性成分的抗生素；包括噬菌体作为活性成分的动物饲料或饮用水；包括噬菌体作为活性成分的消毒剂或清洁剂。本发明的新的噬菌体具有针对猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌的特异杀菌活性而不影响有益细菌，以及优良的耐酸性和耐热性和耐干燥性。因此，新的噬菌体可用于沙门氏菌病或沙门氏菌属食物中毒的预防或治疗，并还广泛用于动物饲料、家畜饮用水、消毒剂和清洁剂。

Description

新的噬菌体和包括其的抗菌组合物
[技术领域]
本发明涉及新的噬菌体和包括其的抗菌组合物。
[背景技术]
沙门氏菌属(Salmonella)具有50-52％的平均基因组GC含量——其与大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺菌属(Shigella)相似。沙门氏菌属是引起家畜以及人感染的致病性微生物。血清学划分具有肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，一种沙门氏菌，具有许多种血清型——包括鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、鸡瘟沙门氏菌(Salmonella pullorum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(ST)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)(SE)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)(SC)、德比沙门氏菌(Salmonella derby)(SD)。它们之中，猪霍乱沙门氏菌和德比沙门氏菌是适应猪的病原体，鸡沙门氏菌和鸡瘟沙门氏菌是禽适应的病原体，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌对人和动物是致病性的，伤寒沙门氏菌是人适应的病原体，它们都在其各自的物种中引起疾病，导致对农民和消费者的巨大损失(Zoobises Report；United Kingdom2003)。
最近，由于在制造具有沙门氏菌属——其引起对猪和肉卫生学的直接损害和在猪的消化道发现——的家畜产品过程中污染的高度危险(Jae-gil Yeh.Characterization andCounterplan of Salmonellosis in Pigs.Monthly Magazine of Pig Husbandry.2004)，从2003年7月1日开始HACCP(危害分析和临界控制点)的执行已成为韩国所有屠宰场的强制性要求。
副伤寒——猪消化道中由沙门氏菌属感染引起的急性或慢性传染病——的特征是胃肠炎和败血病，并主要发生在育肥期(fatting period)。特别地，引起该疾病的致病菌中的一些可通过肉摄入引起人食物中毒，因此它是具有主要公共卫生重要性的疾病。许多种类型的沙门氏菌可能是致病的。它们之中，已知引起猪霍乱的猪霍乱沙门氏菌和猪伤寒沙门氏菌是急性沙门氏菌属败血病的主要原因。急性肠炎发生在育肥期期间，并伴有无规律的食欲、严重水泻、高热、活力丧失、肺炎和神经症状。皮肤变色可发生在一些严重病例中。鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和德比沙门氏菌是慢性肠炎的主要原因。
沙门氏菌病通过沙门氏菌属污染的饲料或水经口途径引起，因此应预防这些途径。污染的饲料、原料或水、或携带病原体的成年猪可能是主要传染源。感染的急性期期间，每克粪便猪脱落多达106个猪霍乱沙门氏菌或107个鼠伤寒沙门氏菌。然而，许多实验性感染报道用108至1011剂量的沙门氏菌的成功的疾病复制。在将103个沙门氏菌注射进猪的实验中，注射的猪没有显示疾病症状，但是在同一圈中饲养的其它猪显示典型的临床症状。这些结果指示，大量沙门氏菌在自然感染的猪中生长，导致其它猪感染(Jung-Bok Lee.Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella andProliferative Enteropathy.Korea Swine Association.2009)。
目前，严重的病毒感染如猪生殖和呼吸综合征(PRRS)和猪环状病毒(PCV2)已对韩国养猪业造成巨大的经济损失，因此疾病管理已集中于这些疾病。由于这些细菌病可引起由禁止使用饲用抗生素开始的、与病毒疾病相当的巨大损失，疾病发生的研究或疾病管理应预先进行(Jung-Bok Lee.Control of the Recent Outbreaks of PorcineSalmonella and Proliferative Enteropathy,Infectious Disease Laboratory,College ofVeterinary Medicine,Konkuk University,Livestock Product Safety,2010)(Robert W.Wills,Veterinary Microbiology,1999)。同时，噬菌体(bacteriophage)——也称作噬菌体(phage)——是特化类型的病毒，其只感染特定细菌和控制细菌生长，并可只在宿主细菌内自我复制。噬菌体发现之后，最初大量努力放在它们用于传染病治疗的用途。然而，当广谱抗生素变得通常使用时，噬菌体由于具有特异目标谱而被看作不必要的。抗生素或抗微生物剂已广泛用于细菌感染引起的传染病的治疗。虽然如此，抗生素的误用和过度使用导致关于抗生素抗性和食物中残留抗生素的有害作用的日益高涨的关注。然而，目前饲用抗生素的去除可增加已被抗生素控制的包括沙门氏菌病在内的细菌病的发生，如实验数据或从其它国家所预料的。因此，对建立对沙门氏菌属管理的详细实用指南存在迫切需要(Jung-Bok Lee.Control of the Recent Outbreaks ofPorcine Salmonella and Proliferative Enteropathy,Infectious Disease Laboratory,Collegeof Veterinary Medicine,Konkuk University,Livestock Product Safety.2010)。
这些增长的关注已导致对噬菌体关注的再现。控制大肠杆菌O157:H的七种噬菌体在美国专利号6,485,902(2002)中公开，控制多种微生物的两种噬菌体在美国专利号6,942,858中公开(2005年授权于Nymox)。许多公司已积极设法利用噬菌体发展多种产品。EBI食品系统(欧洲)发展了用于预防单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)——称为Listerix-P100——引起的食物中毒的食品添加剂，其是USFDA批准的第一个噬菌体产品。基于噬菌体的产品LMP-102也被发展为针对单核细胞增生李斯特菌的食品添加剂，被批准为GRAS(公认安全的)。在2007年，发展了OmniLytics生产的基于噬菌体的洗涤剂以预防屠宰期间牛肉的大肠杆菌0157污染，其被USDA食品安全和检查服务局(FSIS)批准。在欧洲，产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)噬菌体NCIMB30008和酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutiricum)噬菌体NCIMB30008分别在2003和2005年被注册为针对饲料梭状芽胞杆菌污染的饲料防腐剂。这样的研究显示，对控制抗生素非易感的细菌和动物传染病的病原体引起的家畜产品污染的噬菌体的研究目前正在进行。
然而，大多数噬菌体生物控制研究已集中于大肠杆菌、李斯特菌和梭状芽胞杆菌的控制。沙门氏菌也是动物传染病的病原体，并且源于该病原体的损害未减少。如上面所提到的，由于沙门氏菌显示多种抗药性，全国性的抗微生物抗性监督已在韩国在关于接触性传染病预防的强制法令(执行命令16961)、关于接触性传染病预防的强制法令(卫生部和福利命令179)和国立卫生研究所组织(执行命令17164)下进行。相应地，存在发展噬菌体以控制沙门氏菌的需要。
[发明内容]
[技术问题]
为了克服广谱抗生素误用和过度使用后发生的问题，如抗药菌和食物中药物残留物，本发明人从天然来源分离了噬菌体，其中噬菌体具有针对引起家畜中主要疾病的沙门氏菌的特异杀菌活性。因此，他们发现除了显示优良的耐酸性和耐热性外，噬菌体具有针对猪霍乱沙门氏菌(SC)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)、德比沙门氏菌(SD)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)(SI)和新港沙门氏菌(Salmonella newport)(SN)的特异杀菌活性而不影响有益细菌，如针对其形态学、生物化学和遗传性质所鉴定的。进一步，他们发现噬菌体可应用于用于预防和治疗鼠伤寒沙门氏菌介导的疾病，如家畜沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒的组合物，和应用于用于有效预防和控制沙门氏菌属细菌增殖的多种产品，包括家畜饲料添加剂、家畜的饮用水、畜棚消毒剂和肉产品的清洁剂，由此完成本发明。
[问题的解决方案]
本发明的目的是提供具有针对猪霍乱沙门氏菌的杀菌活性的新的噬菌体。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌引起的传染病的组合物，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供抗生素，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供动物饲料或饮用水，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供消毒剂或清洁剂，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供利用噬菌体或组合物预防或治疗猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌引起的传染病的方法。
[发明的有益效果]
本发明的新的噬菌体具有针对猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌的特异杀菌活性而对有益细菌无影响，和优良的耐酸性和耐热性和耐干燥性。因此，新的噬菌体可用于预防或治疗沙门氏菌病或沙门氏菌食物中毒——其是猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌引起的传染病，并且还可广泛用于动物饲料、家畜饮用水、消毒剂和清洁剂。
[附图简述]
图1是ΦCJ11的电子显微镜照片，其属于形态型B1的管状病毒科，特征是等轴的壳体和长的非收缩性尾；
图2是显示沙门氏菌属细菌的菌苔中ΦCJ11蚀斑形成的照片，其中(A、B；SC、C；SG、D；ST、E；SI、F、G；SD、H；SN)，蚀斑形成在SC、ST、SI、SD和SN菌苔中观察到，但是未在SG菌苔中观察到；
图3是分离的噬菌体ΦCJ11的SDS-PAGE结果，其中主要蛋白在33kDa、55kDa和69.5kDa检测到，精确蛋白质标准物(Precision plus protein standard)(BIO-RAD)用作标记；
图4是分离的噬菌体ΦCJ11的PFGE结果，其中ΦCJ11的总基因组大小是大约140kbp，CHEF DNA大小标准λ系列梯状物(Size Standard Lambda Ladder)(Bio-Rad)用作DNA大小标记；
图5是利用针对ΦCJ11基因组DNA的每个引物组进行的PCR结果，其中A：SEQ ID NOs.5和6引物组，B：SEQ ID NOs.7和8引物组，C：SEQ ID NOs.9和10引物组，和D：SEQ ID NOs.11和12引物组，所有A、B、C和D泳道具有大约1kbp或更大至2kbp或更小的PCR产物；
图6是对噬菌体ΦCJ11耐酸性试验的结果，显示在pH2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0、9.0、9.8和11.0下存活的噬菌体数，其中直到pH5.5噬菌体ΦCJ11没有丧失其活性，但是与对照相比，噬菌体ΦCJ11在pH4和pH3.5显示减少的活性，并在pH3.0或更低完全丧失其活性；
图7是噬菌体ΦCJ11耐热性试验的结果，显示在37、45、53、60和70℃下0、10、30、60和120分钟存活的噬菌体数，其中噬菌体ΦCJ11即使暴露于60℃长达2小时仍保持其活性；
图8是在SpeedVac浓缩器辅助下干燥的噬菌体ΦCJ11耐干燥性试验的结果，其中当将在干燥条件下的滴度变化相对于预干燥滴度测定时，将活性保持在60℃长达1小时；和
图9是斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠单一口服施用ΦCJ11之后由于毒性的体重变化结果，其中在施用ΦCJ11之前和施用ΦCJ11之后1、3、7、10和14天之后体重变化的观察与对照组相比没有显示显著的变化(■；雄性对照，□；ΦCJ11雄性，●；雌性对照，○；ΦCJ11雌性)。
[实施发明的最佳方式]
在实现以上目的的一个方面，本发明提供新的具有针对猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌的特异杀菌活性的噬菌体。
本发明人从猪圈收集粪便和污水样品，并从中分离可裂解宿主细胞SC的噬菌体。他们还发现这些噬菌体可裂解ST、SD、SI和SN(图2和表1)。电子显微镜下的形态学检查证实，噬菌体(ΦCJ11)属于形态型B1的管状病毒科(图1)。另外，发现噬菌体ΦCJ11具有大约69.5kDa,55kDa和33kDa的主要结构蛋白，如蛋白模式分析所测量的(图3)，并且基因组分析显示ΦCJ11具有大约97-145.5kbp的总基因组大小(图4)。此外，分析其遗传特征的结果显示，噬菌体包括总基因组内由SEQ ID NOs.1至4表示的核酸分子(实施例6)。基于SEQ ID NOs.1至4，比较与其它物种的遗传相似性。发现，噬菌体显示与已知噬菌体非常低的遗传相似性，指示该噬菌体是新的噬菌体(表2)。为了更详细分析遗传特征，ΦCJ11-特异性引物组，即，SEQ ID NOs.5和6，SEQID NOs.7和8，SEQ ID NOs.9和10，和SEQ ID NOs.11和12用于进行PCR。发现每种PCR产物具有1.4kbp、1.2kbp、1.25kbp和1.5kbp的大小(图5)。
同时，当用ΦCJ11感染SC、ST、SD、SI和SN时，观察到噬菌斑(在软琼脂上由一个噬菌体的宿主细胞溶解产生的亮区)(图2)。在多种温度和pH条件下检查ΦCJ11的稳定性，结果ΦCJ11在pH3至pH11的宽范围pH环境(图6)和37℃至70℃的温度环境(图7)，并且甚至在干燥之后(图8)稳定地保持。并且，还发现野生型菌株SC、ST、SD、SI和SN落入ΦCJ11的宿主细胞范围(表3)。
最后，对无特定病原体的(SPF)新西兰白兔中ΦCJ11的皮肤和眼睛刺激试验的结果显示原发刺激指数(PII)是0.33，指示没有刺激，在整个实验期间在冲洗和未冲洗组中急性眼睛刺激指数(IAOI)是0，指示没有刺激。ΦCJ11口服施用的结果显示体重增长没有变化(图9)。同样，没有观察到死亡率、全身症状(表4)和器官异常(表5)，表示没有毒性。
相应地，本发明人将噬菌体称作“噬菌体ΦCJ11”，其中该噬菌体从来自猪圈的粪便和污水样品分离和具有针对SC、ST、SD、SI和SN的特异杀菌活性和以上特性，并在2011年9月9日保存在韩国微生物培养中心(361-221,Honje1,Seodaemun,Seoul)KCCM11208P登录号下。
在实现以上目的的另一方面，本发明提供用于预防或治疗一种或多种选自猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和新港沙门氏菌的沙门氏菌属细菌引起的传染病的组合物，其包括噬菌体作为活性成分。
具有针对猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和新港沙门氏菌的特异杀菌活性，本发明的噬菌体可用于预防或治疗这些细菌引起的疾病的目的。优选，传染病的实例包括猪霍乱沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的猪沙门氏菌病和沙门氏菌属食物中毒，和德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、新港沙门氏菌引起的急性或慢性猪肠炎，但是不限于此。
如本文所用，术语“沙门氏菌病”指沙门氏菌感染之后的症状，如发热、头痛、腹泻和呕吐。即，沙门氏菌病是沙门氏菌属细菌的感染，其由两种临床形式限定：与伤寒症相似的急性败血病形式和急性胃肠炎——包括肠炎、食物中毒、和急性败血病。
如本文所用，术语“预防”指所有这样的行为，其中疾病过程通过组合物的施用而被抑制或减缓。
如本文所用，术语“治疗”指所有这样的行为，其中状况向着更好方面发生转变或由组合物的施用而被抑制或有利地改变。
本发明的组合物包括1×102至1×1012PFU/mL，优选1×106至1×1010PFU/mL量的ΦCJ11。
另一方面，本发明的组合物可进一步包括药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指对生物体不引起显著刺激和不消除施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。为了将组合物配制成液体制剂，可使用药学上可接受的载体——其是无菌和生物相容的，如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其一种或多种混合物。需要时，可加入其它常规添加剂如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。进一步，可另外将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂加入组合物以制备可注射的制剂如水溶液、悬浮液和乳状液，或口服制剂如丸剂、胶囊、颗粒或片剂。
本发明的预防或治疗性组合物可施加于或喷雾到受害区域，或通过口服或肠胃外途径施用。肠胃外施用可包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或局部施用。
适合施加、喷雾或施用本发明的组合物的剂量将取决于多种因素，包括配制方法、施用方式、正被治疗的患者或动物的年龄、重量、性别、状况和饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应敏感性。具有本领域普通技术的医师或兽医可容易地确定需要的组合物的有效量和开处方。
包括本发明的组合物作为活性成分的口服剂型的实例包括片剂、锭剂、糖锭、水性或乳状悬浮剂、粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。对于制剂如片剂和胶囊，以下是有用的：粘合剂如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉或甘薯淀粉；和润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊，除了上面提到的化合物，可进一步使用液体载体如脂质。
包括本发明的组合物作为活性成分的胃肠外剂型可被配制成通过皮下、静脉内或肌肉内途径的注射剂、栓剂、或通过呼吸道可吸入的喷雾剂，如气雾剂。注射形式可通过使本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中溶解或悬浮和将溶液或悬浮液装入安瓿或小瓶单位形式而制备。对于喷雾剂，如气雾剂，用于喷雾水分散的浓缩物的推进剂或可湿性粉剂可与添加剂组合使用。
在实现以上目的的另一方面，本发明提供包括噬菌体作为活性成分的抗生素。
如本文所用，术语“抗生素”指施加给动物以杀死病原体的任何药物，并在本文用作防腐剂、杀菌剂和抗菌剂的一般术语。动物是包括人在内的哺乳动物。本发明的噬菌体，与常规的抗生素不同，对沙门氏菌属具有高特异性以杀死特定病原体而不影响有益细菌，而且不引起抗药性，以便它可作为具有相对长的生命周期的新的抗生素而被提供。
在实现以上目的的另一方面，本发明提供包括噬菌体作为活性成分的动物饲料或饮用水。
期望畜牧业和渔业中使用的饲用抗生素预防感染。然而，大多数目前可用的饲用抗生素是有问题的，因为由于残留在畜产品中，它们易于引起抗性株的出现，并可传递给人。摄取这样的残留抗生素可可使人病原体的对抗生素有抵抗力，导致疾病传播。另外，由于存在许多种饲用抗生素，多药抗性株的渐增的全球出现是严重的忧虑。因此，本发明的噬菌体可用作饲用抗生素，其是更生态友好的和能解决以上问题。
本发明的动物饲料可通过将噬菌体直接或以单独的饲料添加剂形式加入到动物饲料而制备。本发明的噬菌体可作为液体或以固体的形式，优选以干粉包含在动物饲料中。干燥处理可通过空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥进行，但不限于此。本发明的噬菌体可作为粉末形式以基于动物饲料的重量按重量计0.05至10％，优选按重量计0.1至2％的量加入。除了本发明的噬菌体，动物饲料还可包括其它常规添加剂用于长期保存。
本发明的饲料添加剂可另外包括其它非致病性微生物。可用的另外的微生物可选自枯草杆菌(Bacillus subtilis)——其可产生蛋白酶、脂肪酶和转化酶，乳杆菌属某种(Lactobacillus sp.)菌株——其可在缺氧条件下，如在牛胃中发挥分解的生理活性和功能，丝状真菌——包括米曲霉菌(Aspergillus oryzae)(J Animal Sci43:910-926,1976)，其可增加家养动物的重量，提高奶产量和辅助饲料的消化和吸收，和酵母——包括酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)(J Anim Sci56:735-739,1983)。
本发明的包括ΦCJ11的饲料可包括植物基饲料，如谷类、坚果、食物副产品、海藻、纤维、药物副产品、油、淀粉、膳食和谷类副产品，和动物基饲料如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物、脂肪、单细胞蛋白质、浮游动物，和食物废物，但不限于此。
本发明的包括ΦCJ11的饲料添加剂可包括粘合剂、乳化剂和用于预防品质退化的防腐剂、氨基酸、维生素、酶、有益菌种、调味料、非蛋白质氮、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取物和用于有效性改善的寡糖、和其它饲料预混合物，但是不限于此。
另外，混合有本发明的噬菌体的饮用水的供应可减家畜少肠中沙门氏菌属细菌的数目，由此获得无沙门氏菌属的家畜。
仍在实现以上目的的另一方面，本发明提供包括噬菌体作为活性成分的消毒剂或清洁剂。
仍在实现以上目的的另一方面，本发明提供利用噬菌体或组合物治疗由猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌引起的传染病的方法。
详细地，本发明的治疗方法包括将治疗有效量的噬菌体或组合物施加给具有由猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌或新港沙门氏菌引起的传染病的个体的步骤。
本发明的噬菌体或组合物可以以药物制剂的形式施用给动物或可以作为与动物饲料或饮用水的混合物并优选作为与动物饲料的混合物由动物摄取。
只要它到达靶组织，任何途径，不论口服或胃肠外，都可采用用于施用本发明的噬菌体或组合物。详细地，本发明的组合物可以以通常方式通过任何途径如口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻内和吸入途径施用。
对本领域技术人员将是明显的是，将通过治疗方法施用的本发明的噬菌体或组合物的日总剂量应通过医师的适当医学判断来确定。优选，给定患者的治疗有效量可根据医学领域中所周知的多种因素而改变，该多种因素包括将接受的反应的种类和程度、患者状况如年龄、体重、健康状态、性别和饮食、施用时间和途径、组合物的分泌速度、治疗时期、根据是否其它剂与其使用或不与其使用的具体组合物等。
[发明方式]
在下文中，本发明将参考实施例更详细地描述。然而，这些实施例仅用于说明的目的，本发明不意欲受这些实施例的限制。
实施例1：沙门氏菌噬菌体的分离
实施例1-1：噬菌体筛选和单个噬菌体分离
将50mL来自粪便和污水流出物的样品转移至离心管，并以4000rpm离心10分钟。然后，将上清液利用0.45μm滤器过滤。将18mL样品滤液与150μl猪霍乱沙门氏菌(“SC”)振荡培养基(OD600＝2)和2mL10×LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L和NaCl10g/L：LB培养基)混合。将混合物在37℃培养18小时，并将培养基以4000rpm离心10分钟。将上清液利用0.2μm滤器过滤。将3mL0.7％琼脂(w/v)和150μl SC振荡培养基(OD600＝2)混合，并置于LB板上(“顶层琼脂”)，并允许固化。将10μl培养滤液铺在其上，并在37℃培养18小时，噬菌体裂解物的滴定在顶层琼脂上进行，称作软琼脂覆盖方法。
将含有噬菌体裂解物的样品培养基适当稀释，并与150μl SC振荡培养基(OD600＝2)混合，之后是软琼脂覆盖方法，以获得单个蚀斑。单个蚀斑表示一个噬菌体，因此，为了分离单个噬菌体，将一个噬菌斑加入到400μl SM溶液(NaCl,5.8g/L、MgSO47H2O,2g/L、1M Tris-Cl(pH7.5)50mL)，置于室温4小时以分离单个噬菌体。为了大量纯化噬菌体，将100μl上清液从单个噬菌体溶液中取出，并与12mL0.7％琼脂和500μl SC振荡培养基(OD600＝2)混合，接着是在具有150mm直径的LB板上的软琼脂覆盖方法。当溶解结束时，将15mL SM溶液加入板。将板于室温轻轻摇动4小时以从顶层琼脂流出噬菌体。将含有流出的噬菌体的SM溶液回收，加入氯仿至1％的终体积，并充分混合10分钟。将溶液以4000rpm离心10分钟。将获得的上清液利用0.45μm滤器过滤，并储存在冰箱中。
实施例1-2：噬菌体的大规模批次
利用SC将选择的噬菌体大量培养。将SC振荡培养，并将1.5×1010cfu(菌落形成单位)的等分部分以4000rpm离心10分钟，并将沉淀重悬于4mL SM溶液中。将9.0×108PFU(蚀斑形成单位)的噬菌体接种其中(MOI：感染复数＝0.001)，并置于37℃20分钟。将溶液接种进150mL LB培养基中，并在37℃培养5小时。加入氯仿至1％的终体积，并将培养溶液摇动20分钟。分别加入DNase I和RNase A到1μg/mL的终浓度。将溶液置于37℃30分钟。分别加入NaCl和PEG(聚乙二醇)到1M和10％(w/v)的终浓度，并另外置于4℃3小时。将溶液在4℃以12,000rpm离心20分钟，丢弃上清液。将沉淀物重悬于5mL SM溶液，并置于室温20分钟。将4mL氯仿加入其中和充分混合，之后在4℃以4000rpm离心20分钟。将上清液利用0.2μm滤器过滤，并将噬菌体通过甘油密度梯度超速离心(密度：40％、5％甘油，在35,000rpm，4℃1小时)纯化。纯化的噬菌体被称作“噬菌体ΦCJ11”，并重悬浮于300μl SM溶液中，之后滴定。将噬菌体ΦCJ11在2011年9月9日保藏在韩国微生物培养中心(361-221,Honje1,Seodaemun,Seoul)登录号KCCM11208P下。
实施例2：对沙门氏菌属的ΦCJ11感染的检查
为了分析选择的噬菌体对除SC外的沙门氏菌属种类的溶解活性，进行了与其它沙门氏菌属种类的交叉感染的尝试。结果，ΦCJ11感染SC(猪霍乱沙门氏菌)、ST(鼠伤寒沙门氏菌)、SD(德比沙门氏菌)、SN(新港沙门氏菌)、SI(婴儿沙门氏菌)、SA(亚利桑那沙门氏菌(Salmonella arizonae))和SB(邦戈沙门氏菌(Salmonella bongori))，但是不感染SE(肠炎沙门氏菌)、SG(鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum))和SP(Salmonella pullorum)(表1和图2)。
[表1]
沙门氏菌属的ΦCJ11感染
*ATCC：美国模式培养物保藏中心
*SGSC：沙门氏菌属遗传保藏中心(Salmonella Genetic Stock Center)
而且，图2是显示沙门氏菌属细菌的菌苔中ΦCJ11蚀斑形成的照片。如图2(A、B；SC、C；SG、D；ST、E；SI、F、G；SD、H；SN)所示，蚀斑形成在SC、ST、SI、SD和SN菌苔中观察到，但是未在SG菌苔中观察到。
实施例3：ΦCJ11的形态学
将纯化的ΦCJ11在SM缓冲溶液中稀释，然后安放在铜网格上，用2％乙酸双氧铀染色3至5秒，并干燥。检查在透射电子显微镜(LIBRA120,Carl Zeiss透射电子显微镜，80kV，×120,000～×200,000的放大率)下进行(图1)。图1是ΦCJ11的电子显微镜照片。如图1所示，发现纯化的ΦCJ11属于形态型B1的管状病毒科，特征是等轴的壳体和长的非收缩性尾。
实施例4：ΦCJ11的蛋白质模式分析
将15μL以1011PFU/mL滴度纯化的ΦCJ11溶液与3μL5×SDS样品溶液混合，并加热5分钟。进行12％SDS-PAGE，然后将凝胶用考马斯蓝于室温染色1小时(图3)。图3是分离的噬菌体ΦCJ11的SDS-PAGE结果，其中精确蛋白质标准物(Precisionplus protein standard)(BIO-RAD)用作标记。如图3所示，主要蛋白在33kDa、55kDa和69.5kDa检测到。
实施例5：ΦCJ11总基因组DNA大小的分析
将纯化的ΦCJ11基因组DNA利用超速离心分离。详细地，向纯化的ΦCJ11培养基加入EDTA(乙二胺四乙酸(pH8.0))、蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)，终浓度分别是20mM、50ug/mL和0.5％(w/v)，之后在50℃温育1小时。加入等体积的苯酚(pH8.0)并充分混合。在室温以12,000rpm离心10分钟之后，将上清液与等体积的PC(苯酚:氯仿＝1:1)充分混合。在室温以12,000rpm进行另一次离心10分钟。然后，获得上清液，并与等体积氯仿混合，之后在室温以12,000rpm离心10分钟。将获得的上清液与1/10体积的3M乙酸钠和2体积的冷的95％乙醇混合，并置于-20℃1小时。在0℃和12,000rpm离心10分钟之后，将上清液全部去除，并将DNA沉淀物溶解于50μL TE(Tris-EDTA(pH8.0))。将提取的DNA稀释10倍，并测量OD260的吸光度以确定其浓度。将1μg总基因组DNA装载到1％PFGE(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶上，并在BIORAD CHEF DR II PFGE系统中在50-90秒的转换时间斜率(switchtime ramp)、6V/cm(200V)的条件下在14℃电泳22小时。CHEF DNA大小标准λ系列梯状物(Size Standard Lambda Ladder)(Bio-Rad)用作DNA大小标记(图4)。图4是分离的噬菌体ΦCJ11的PFGE结果。如图4所示，观察到呈现在48.5至1,000kbp之间的大约140kbp的DNA。
实施例6：ΦCJ11的遗传学分析
为了纯化的ΦCJ11的遗传分析，将5μgΦCJ11的基因组DNA用限制性酶PstI、XbaI和BamHI、EcoRI和SalI双重消化。将载体pCL1920(Promega)用限制性酶PstI、XbaI和BamHI、EcoRI和SalI消化，然后用CIP(小牛小肠碱性磷酸酶)处理。将消化的基因组DNA以3:1的比与载体混合，和在16℃连接2小时。将产生的重组载体转化进大肠杆菌DH5α，然后将大肠杆菌DH5α铺到含有壮观霉素和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB板上用于蓝/白菌落的选择。将选择的菌落在含有抗生素的培养基中震荡培养16小时。然后，利用质粒纯化试剂盒(Promega)提取质粒。
质粒的克隆通过利用FTR135和FTR136(SEQ ID NOs.13和14)引物组的PCR证实，并仅针对具有1kb或更长大小的插入片段进行选择。它们的核苷酸序列利用引物组来分析。因此获得的核苷酸序列分别在SEQ ID NOs.1至4中给出，每个具有1至2kbp或更小的大小，并借助于NCBI blastx和blastn程序分析序列相似性，结果概述在下面的表2中。
[表2]
ΦCJ11和其它噬菌体之间序列相似性的比较
实施例7：ΦCJ11-特异性引物序列的设计
为了鉴定ΦCJ11，在SEQ ID NOS.1至4的基础上设计ΦCJ11-特异性引物。利用SEQ ID NOS.5和6、SEQ ID NOs.7和8、SEQ ID NOs.9和10、和SEQ ID NOs.11和12的每个引物组进行PCR。将0.1μg噬菌体基因组DNA和0.5pmol的每种引物加入预混合物(Bioneer)，并将终体积调节到20μL。PCR进行30个循环：变性：94℃30秒，退火：55℃30秒，和聚合：72℃，1.5分钟(图5)。图5是利用针对ΦCJ11基因组DNA的每个引物组进行的PCR的结果。A；SEQ ID NOs.5和6的引物组，B；SEQ ID NOs.7和8的引物组，C；SEQ ID NOs.9和10的引物组，和D；SEQ ID NOs.11和12的引物组。所有A、B、C和D泳道都具有大约1至2kbp的PCR产物。如图5所示，因此获得的PCR产物具有大约1kbp或更大至2kbp或更小的大小，其中引物组为SEQ ID NOs.5和6、SEQ ID NOs.7和8、SEQ ID NOs.9和10、和SEQ IDNOs.11和12。
实施例8：噬菌体的pH稳定性
为了测定ΦCJ11在猪胃中低pH环境下是否稳定存活，测定宽范围pH(pH2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0、9.8和11.0)的ΦCJ11稳定性。制备多种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH2.1、pH4.0、pH5.5和pH6.4)、柠檬酸钠缓冲液(pH2.5、pH3.0和pH3.5)、磷酸钠缓冲液(pH6.9和pH7.4)和Tris-HCl(pH8.2、pH9.0、pH9.8和pH11.0))以具有0.2M的浓度。将每种pH溶液180μL与20μL噬菌体溶液(1.0×1011PFU/mL)混合，给予每种pH溶液1M的浓度，之后在室温温育2小时。将反应溶液连续稀释，并将每种稀释物10μL通过软琼脂覆盖方法在37℃培养18小时，测定噬菌体裂解物的滴度(图6)。图6是噬菌体ΦCJ11耐酸性试验的结果，显示在pH2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0、9.0、9.8和11.0存活的噬菌体数。噬菌体ΦCJ11直到pH5.5才丧失其活性。然而，与对照相比，噬菌体ΦCJ11在pH4和pH3.5显示减少的活性，并在pH3.0或更低完全丧失其活性。如图6所示，噬菌体在下至pH5.5没有丧失其活性和保持稳定，而它在pH3.0或更低丧失其活性。
实施例9：噬菌体的热稳定性
为了作为饲料添加剂使用，测定噬菌体对配制过程期间产生的热的稳定性。就此而言，将200μL具有1.0×1011PFU/mL滴度的ΦCJ11溶液在37℃、45℃、53℃、60℃和70℃温育0分钟、10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。将溶液连续稀释，并将每种稀释物10μL通过软琼脂覆盖方法在37℃培养18小时，测定噬菌体裂解物的滴度(图7)。图7是噬菌体ΦCJ11耐热性试验的结果，显示在37℃、45℃、53℃、60℃和70℃0、10、30、60和120分钟存活的噬菌体数。如图7所示，噬菌体ΦCJ11即使暴露于60℃长达2小时仍保持其活性。
实施例10：噬菌体的耐性
为了用作饲料添加剂，测定噬菌体ΦCJ11对配制过程的干燥条件组合的耐受。在获自热稳定性测定结果的基础上，干燥测定利用SpeedVac浓缩器进行。将200μL具有1.0×1011PFU/mL滴度的ΦCJ11溶液在真空下在60℃干燥2小时，并将因此获得的沉淀物在4℃完全再悬浮于200μL SM溶液一天，并测量滴度值(图8)。图8是在SpeedVac浓缩器辅助下干燥的噬菌体ΦCJ11耐干燥性试验的结果。如图8所示，当将在干燥条件下的滴度变化相对于预干燥滴度测定时，在60℃，活性保持长达1小时。
实施例11：噬菌体的感染谱
除实验中使用的SC(ATCC SC10708)外，测定ΦCJ11针对获自首尔国立大学兽医学学院禽疾病实验室的野生型(2个菌株)、猪霍乱沙门氏菌(5个菌株)、鼠伤寒沙门氏菌(17个菌株)、婴儿沙门氏菌(4个菌株)、新港沙门氏菌(6个菌株)、德比沙门氏菌(2个菌株)和都柏林沙门氏菌(3个菌株)的溶解活性。将每个菌株150μL振荡培养基(OD600＝2)混合，并将10μL具有108pfu/ml滴度的ΦCJ11溶液利用软琼脂覆盖方法在37℃培养18小时，监测蚀斑形成(表3)。在8个SC菌株中观察噬菌斑的形成。
[表3]
ΦCJ11感染的野生型菌株SC、ST、SD、SI、SN
*SGSC：沙门氏菌属遗传保藏中心
*ATCC：美国模式培养物保藏中心
*SNU：首尔国立大学兽医学学院禽类疾病实验室
实施例12：噬菌体的毒性测定
皮肤和眼睛刺激试验在无特定病原体的(SPF)新西兰白兔中进行，其通常在用于预防沙门氏菌病和沙门氏菌属食物中毒的噬菌体ΦCJ11的毒性试验中使用，并且积累其实验数据以允许容易地分析实验结果。观察兔正常的腹部皮肤(没有损伤的皮肤)和损伤的腹部皮肤，并将其与2.5cm×2.5cm纱布——施加了测试物质，并且每种施加0.5mL/部位——接触。使用测试物质之后1天，未观察到全身症状变化，观察到轻微的重量减轻，这可能归于由于测试物质闭塞施用的应激。在皮肤刺激试验中，原发刺激指数(PII)是0.33，指示没有刺激。对于眼睛刺激试验，给兔左眼施用测试物质，然后与没有施用测试物质的右眼比较。在实验期间，未观察到与测试物质施用有关的全身症状和体重的异常变化。测试物质施用之后，眼检查显示急性眼睛刺激指数(IAOI)是“0”，指示没有刺激。因此，这些结果表明新的噬菌体ΦCJ11没有毒性。
另外，毒性试验通过给斯普拉-道来大鼠(Sprague-Dawley rat)单一口服施用ΦCJ11进行。准备用1×1011PFU/kgФCJ11处理的测试物质施用组和用载体[20mMTris-HCl(pH7.0)+2mM MgCl2]作为赋形剂处理的赋形剂对照组，给每组10只大鼠(雌性和雄性各5只)口服施用单一剂量。监测死亡率、全身症状、体重变化和尸体解剖发现2周，并互相比较。监测每6小时进行，从施用当天在施用后30分钟至1小时开始。然后，监测全身症状一天一次，持续14天，并记录其全身症状(表4和5)。
[表4]
ФCJ11口服施用后的死亡率和全身症状
[表5]
ФCJ11口服施用后的尸体解剖发现
A具有症状的动物数/检测的动物数
如表4和5所示，它们都没有死亡，并且ΦCJ11既没有产生中毒症状，也没有产生显著的临床症状。结果概述在表4和5中。在施用之前和施用之后1、3、7、10和14天记录体重。与对照组相比没有观察到体重的显著变化。
同时，体重变化的结果表明，ΦCJ11不引起足以减少食欲或改变体重的毒性反应。这些结果显示在图9中。图9是斯普拉-道来大鼠单一口服施用ΦCJ11之后由于毒性引起的体重变化结果。如图9所示，在施用ΦCJ11之前和施用ΦCJ11之后1、3、7、10和14天之后体重变化的观察结果显示，与对照组相比没有发现显著的体重变化(■；雄性对照，□；ΦCJ11雄性，●；雌性对照，○；ΦCJ11雌性)。
因此，发现新的噬菌体ΦCJ11的ADL在雌性和雄性大鼠中超过1×1011PFU/kg，因此它是无毒的。

Claims (7)

1.分离的噬菌体，具有针对猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)的特异杀菌活性，其由登录号KCCM11208P确定。
2.用于治疗由选自猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、德比沙门氏菌(Salmonella derby)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、新港沙门氏菌(Salmonella newport)和其组合的沙门氏菌属细菌引起的传染病的组合物，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述由猪霍乱沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的传染病是沙门氏菌病或沙门氏菌属食物中毒，所述由德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和新港沙门氏菌引起的传染病是细菌感染型沙门氏菌属食物中毒。
4.抗生素，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
5.动物饲料或饮用水，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
6.消毒剂或清洁剂，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
7.权利要求1所述的噬菌体在制备用于治疗由一种或多种沙门氏菌属细菌引起的传染病的组合物中的应用，所述沙门氏菌属细菌选自猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、新港沙门氏菌和其组合。
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