CN114107222B - 一株广谱耐高温沙门菌烈性噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染性病防治技术领域，具体涉及一株广谱耐高温沙门菌烈性噬菌体及应用。所述沙门氏菌噬菌体保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211353。本发明的沙门菌噬菌体对沙门菌耐药菌株具有较好的杀灭效果，对沙门菌感染亦有较好的治疗效果，适于作为防控沙门菌的生物制剂，可在沙门菌综合防控中应用。

Description

一株广谱耐高温沙门菌烈性噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，涉及一株噬菌体及其在抑菌方面的应用，本发明具体涉及一株广谱耐高温烈性噬菌体及其应用。

背景技术

沙门菌(Salmonella)属于肠杆菌科革兰氏阴性菌，是一种常见的食源性病原微生物，血清型众多，目前已知2600多种血清型，我国已发现26个菌群、161个血清型。沙门菌宿主范围广分布广泛，临床上多表现为败血症和肠炎，也可使孕畜流产。目前，沙门菌在猪肉供应链中的污染十分普遍，在食源性细菌感染中约占70-80％，给我国养殖业造成了重大的经济损失。此外，沙门菌在自然界中具有广泛的宿主，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间进行传播。抗生素是预防和治疗此类细菌感染的首选，由于抗菌药物长期、广泛、不合理的使用(包括作为动物饲料添加剂)，使得该类细菌的耐药性日趋严重，耐药菌的出现不仅导致动物发病率逐渐上升，使得畜禽养殖成本增加，还会对人体健康造成较大的威胁。因此，寻找能有效防治沙门菌感染的新方法成为当务之急。

噬菌体是一种能够特异性吸附和裂解细菌的病毒，与抗生素相比，具有特异性强、指数增殖、广泛分布、研发时间短等优势，且噬菌体治疗不会使细菌产生耐药性，使得噬菌体有望成为新的抗菌工具，这为食源性病原菌的生物防控开辟了新的道路。

但噬菌体的应用仍存在许多问题和局限性。(1)噬菌体具有高度特异性，只能裂解其易感宿主菌，即其治疗具有专一性，无法达到广谱抗生素的治疗效果，使噬菌体作为抗菌剂广泛应用受到限制。(2)给药途径的确定较为困难，噬菌体位于血液中容易失活且耐酸碱性弱，不同噬菌体制剂使用的最佳条件均不相同，需要一段较长的时间来对该制剂进行探讨研究最佳的使用方案。因此，急需寻找广谱、酸碱耐受良好的噬菌体是本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对上述问题，本发明的目的是提供一种广谱耐高温烈性噬菌体及其应用，以实现以下发明目的：

筛选并保存一种广谱沙门菌噬菌体，对耐药沙门菌有不同程度的裂解作用。

热稳定性、酸碱稳定性良好，特异性裂解多种血清型沙门菌。

提供一种沙门菌广谱烈性噬菌体的制备方法，得到的噬菌体产品，效价高。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明以甲型副伤寒沙门菌为宿主菌进行噬菌体分离，得到一株广谱耐热烈性噬菌体。申请人将该广谱耐热烈性噬菌体命名为沙门菌噬菌体ph2-2，Salmonellabacteriophage ph2-2，该沙门菌噬菌体已于2021年11月01日送至中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M20211353。

本发明的沙门菌噬菌体ph2-2对沙门菌有强的裂解作用。在本发明中，该株噬菌体从电镜形态上分析，属于肌尾噬菌体科科，故将其命名为沙门菌噬菌体ph2-2。在4-80℃和pH为4-12条件下均能存活；在-80℃保存7个月后活性稳定。该噬菌体保存的保护剂为含20％甘油的培养溶液。

本发明的沙门菌噬菌体ph2-2可在制备杀灭沙门菌的药物中的应用，应用方式为将沙门菌噬菌体纯化后，用于抑制和杀灭沙门菌。

该沙门菌噬菌体可用于防止沙门菌污染和沙门菌过度生长，其中所述的沙门菌包括鼠伤寒沙门菌、德比沙门菌、甲型副伤寒沙门菌和婴儿沙门菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)经富集后的沙门菌噬菌体原液效价高。在本发明中，噬菌体ph2-2的效价≥10⁹pfu/mL。

(2)在不同条件下，本发明噬菌体裂解能力强。在本发明中，分别比较了噬菌体ph2-2在MOI＝10，MOI＝1，MOI＝0.1，MOI＝0.01，MOI＝0.001的条件下对甲型副伤寒沙门菌201007的抑菌作用，并发现在不同的MOI条件下均具有一定的活性。

(3)pH范围更广。在本发明中，噬菌体ph2-2的pH稳定性范围为5-11，具有较宽的pH适用范围。

(4)热稳定性好。在本发明中，噬菌体LPST10和LPSE1在4-70℃效价基本不变。

综上所述，本利用本发明的沙门菌噬菌体ph2-2的生物制剂包含能有效抑制和裂解沙门菌的噬菌体，该生物制剂不仅能在动物处于活体状态的时候使用课以预防沙门菌，也可以在动物成为食品原料或产品中进行应用，还可以应用于养殖、和食品生鲜加工场地的应用。

附图说明

图1：本发明的沙门菌噬菌体ph2-2双层平板噬菌斑图。

图2：本发明的噬菌体ph2-2裂解不同血清型沙门菌的宿主谱阳性结果图。附图标记说明：

图2中的A图表示的是甲型副伤寒沙门菌；图2中的B图表示的是鼠伤寒沙门菌；图2中的C图表示的是婴儿沙门菌；图2中的D图表示的是德比沙门菌。

图3：本发明沙门菌噬菌体ph2-2的电镜观察图。

图4：本发明沙门菌噬菌体ph2-2的生长曲线。

图5：噬菌体ph2-2最佳感染复数图；

图6：在MOI值为0.1条件下，噬菌体ph2-2对甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌裂菌能力结果图。

附图标记说明：图6中的A图表示甲型副伤寒沙门菌201007；图6中的B图表示鼠伤寒沙门菌1344。

图7：不同温度对噬菌体ph2-2的作用结果图。

图8：不同pH对噬菌体ph2-2的作用结果图。

图9：紫外照射不同时间对噬菌体ph2-2的作用结果图。

图10：酒精作用不同时间对噬菌体ph2-2的作用结果图。

图11：小鼠治疗性试验结果图。

附图标记说明：图11中的A图表示小鼠灌胃(ig)攻菌组与治疗组体重变化；图11中的B图表示小鼠腹腔注射(ip)攻菌组与治疗组体重变化。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐述本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

以下实施例中，所涉及菌株代号均以本发明人的命名方式编号。

以下实施例中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨17g，氯化钠5g，大豆胨3g，葡萄糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，pH7.3±0.2。

TSA固体培养基的配方为：胰酪胨15g，大豆木瓜蛋白酶水解物5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.3±0.2。

半固体琼脂培养基配方为：TSA固体培养基2.8g，TSB液体培养基1.5g，蒸馏水100ml，pH 7.0。

PBS缓冲液：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.56g Na₂HPO₄，0.2g KH₂PO₄，依次加入800mL的单蒸水中，待完全溶解后，定容至1000.0mL，121℃蒸汽灭菌30min，4℃保存备用。

LB液体培养基：5.0g胰蛋白胨，2.5g酵母浸出物，5.0g NaCl，溶于约400mL去离子水中，完全溶解后调pH值至7.0，定容至500mL，121℃蒸气灭菌30min，室温保存。

实施例1沙门菌噬菌体ph2-2的分离及纯化

样品处理：从屠宰场采集生猪肛拭子用生理盐水浸泡过夜，7000rpm离心10min后取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。

宿主菌制备：选取甲型副伤寒沙门菌201007单菌落接种于1ml LB肉汤中，220r/min、37℃培养16-18h，得到宿主菌悬液，备用。

噬菌体增值：将宿主菌201007菌液按1：100比例转接于LB培养基，220r/min、37℃培养1.5-3h，至对数期。将宿主菌、噬菌体滤液、LB培养基按体积比为1：1：2的比例加入灭菌的锥形瓶，混匀后，220r/min、37℃培养2.5-3.5h，富集噬菌体。

噬菌体分离：上述噬菌体增值液4℃静置2h后，取20ml 4℃7000rmp离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到噬菌体原液，用于噬菌体分离。

采用双层平板法进行噬菌体分离,取300uL此宿主菌的菌悬液于无菌10ml EP管中,加入1ml噬菌体原液,再加入已融化的半固体至8mL，迅速倒入已准备好的底层为TSA培养基的平皿，倾斜旋转平皿使其分布均匀,待琼脂凝固后,37℃恒温倒置培养过夜，观察结果。如果原液内有噬菌体存在,则可在上层琼脂平板上形成蚕蚀的透明空斑,与黄白色的雾状菌苔形成鲜明的对比。

噬菌体纯化：采用点斑法进行噬菌体纯化。使用无菌200uL枪头挑取一个形态大小较为均一的噬菌斑，接种到3ml的PBS中，震荡后4℃静置2h，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌。滤液分别用PBS稀释至10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，备用。取300uL宿主菌悬液于无菌10ml EP管中,再加入已融化的半固体琼脂培养基至8mL，迅速倒入已准备好的底层为TSA培养基的平皿，倾斜旋转平皿使其分布均匀,待琼脂凝固后,按稀释度分别取10uL噬菌体滤液点于平皿上，晾干后37℃恒温倒置培养过夜。使用无菌10uL枪头挑取单个噬菌斑接种到1ml的PBS中，震荡后4℃静置2h，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌，标记为F1。重复此步骤3-5次，每次观察到的噬菌斑大小、形态保持均匀一致，得到纯化的噬菌体，命名为ph2-2。结果如图1所示。

噬菌体保藏：取纯化好噬菌体滤液600uL，50％无菌甘油400uL，加入到1.5ml EP管中混匀，-80℃保存。

实施例2沙门菌噬菌体ph2-2效价的测定

将噬菌体ph2-2原液分别用PBS稀释至10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，取300uL宿主菌悬液于无菌10ml EP管中,再加入已融化的半固体琼脂培养基至8mL，迅速倒入已准备好的底层为TSA培养基的平皿，倾斜旋转平皿使其分布均匀,待琼脂凝固后,按稀释度分别取10uL噬菌体滤液点于平皿上，晾干后37℃恒温倒置培养过夜。重复试验3次，计数时取10^-7稀释度的三个重复实验的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×100。

噬菌体ph2-2原液的效价为1.8×10¹⁰PFU/ml。

实施例3沙门菌噬菌体ph2-2宿主谱的测定

试验选择106株沙门菌分离株(见表1)和8种其他种属菌株(见表1)来做噬菌体ph2-2的宿主谱分析，具体操作如下：

分别培养宿主菌菌株至对数期，将噬菌体ph2-2原液分别用PBS稀释至10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7。取300μL对数期上述菌液于无菌10ml EP管中,再加入已融化的半固体琼脂培养基至8mL，迅速倒入已准备好的底层为TSA培养基的平皿，倾斜旋转平皿使其分布均匀,按稀释度分别取10uL噬菌体滤液点于平皿上，晾干后37℃恒温倒置培养过夜。统计结果，计算成斑率。成斑率(EOP)＝测定菌株效价/宿主菌效价。

结果如表1所示：表中“++++”表示EOP＞1，形成完全透亮且密集的噬菌斑；“+++”表示EOP为0.1-1之间，形成较透亮较密集的噬菌斑；“++”表示EOP为0.001-0.1之间，形成较透亮但有朦胧背景的多个独立噬菌斑；“+”表示EOP≤0.001，形成微透亮的少数独立噬菌斑；“-”表示完全不形成单个噬菌斑，不裂解该菌株。

结果显示：噬菌体ph2-2可裂解多种不同血清型的沙门菌，可裂解鼠伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、婴儿沙门菌、德比沙门菌，可不同程度地裂解全部试验的106株沙门菌分离株，裂解率为100％，表现出广谱性；均不能裂解金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、链球菌，具有种属间特异性。

表1沙门菌噬菌体ph2-2宿主谱的测定

表注：上述参试菌株为公开使用的常规菌株，可以常规途径获取。

实施例4：沙门菌噬菌体ph2-2的透射电镜观察

将所得噬菌体ph2-2超速离心后重悬，采用常规磷钨酸负染色法，即，吸取10uL噬菌体ph2-2悬液于铜网上，自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸去多余的液体，然后滴加10uL磷钨酸(PTA)染色5-10min，自然干燥，在透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)下观察噬菌体形态。

结果如图3所示，经纯化后的噬菌体ph2-2的头部是立体对称的，呈二十面体结构，呈典型的规则多面体形状，头部直径为70.00nm，尾长110.00nm，尾径为32.00nm。分析指出ph2-2属于肌尾噬菌体科。

实施例5沙门菌噬菌体ph2-2最佳感染复数(MOI)的测定

将宿主菌培养至对数前中期，分别加入MOI值为100、10、1、0.1、0.01、0.001的噬菌体ph2-2，在37℃，220r/min条件下共培养3h，取培养液12000r/min离心10min，取上清经0.22um微孔滤膜过滤，通过双层平板法测定噬菌体的效价，实验重复3次，计算出不同感染复数下的噬菌体效价，并确定噬菌体的最佳MOI。

结果如图4所示：当其MOI＝0.1时，噬菌体ph2-2效价达到最高(3.0×10¹⁰PFU/ml)，因而可以确定噬菌体ph2-2感染沙门菌的最佳MOI为0.1。

实施例6沙门菌噬菌体ph2-2一步生长曲线的绘制

在最佳感染复数测定的实验基础上，在20mL宿主菌中以最佳MOI值加入噬菌体混合37℃温孵10min，后12000r/min离心1min，弃上清用后用等温TSB培养基重悬沉淀，此过程重复三次，以彻底去除未结合的噬菌体。等体积的TSB培养基重悬沉淀，37℃振荡培养，从0时刻起每隔10min取样，4℃12000r/min离心10min，收集上清液，测定噬菌体的滴度。每10分钟测量一次噬菌体滴度，持续150分钟。试验重复3次。以感染时间(t)为横坐标，噬菌体滴度(PFU/mL)为纵坐标，绘制一步生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算裂解量。计算公式：裂解量＝裂解末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。

结果表明，在最佳MOI＝0.1时，噬菌体ph2-2感染宿主菌后的10min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约为10min，从10min后效价开始上升，一直持续到第100min，之后其滴度趋于稳定，说明噬菌体ph2-2的裂解期约为90min。根据裂解量＝爆发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度计算得到，噬菌体ph2-2的裂解量为1.4×10¹⁰/2.94×10⁷＝476PFU/cell，见图5。

实施例7沙门菌噬菌体ph2-2裂菌曲线的绘制

采用光学密度(OD600)在96孔板中测量分析噬菌体的裂解活性。

测定沙门菌201007和1344对数期的CFU和噬菌体的PFU，三次重复。将对数期的沙门菌菌和与噬菌体按不同MOI(0.001、0.01、0.1、1.0、10)混合，加入96孔板中，37℃180rpm摇动，加入等体积LB培养基和对数期沙门菌作为对照。OD ₆₀₀值通过酶标仪测定。测定12h，该试验重复三次。

结果如图6所示，噬菌体ph2-2在不同MOI值(MOI＝0.001-100)下，对宿主菌201007(图6中的A图)在5h内表现出很强的抗菌活性；针对鼠伤寒沙门菌1344(图6中的B图)，在6h内表现出很强的抗菌活性。

实施例8沙门菌噬菌体ph2-2的热稳定性试验

在不同温度(4、20、40、50、60、70和80℃)下分别处理100uL纯化的噬菌体(1.8×10¹⁰PFU/m L)20min、40min和60min，倍比稀释后采取双层平板法测其滴度。重复试验三次。

结果如图7所示：pH2-2在4-60℃范围内有较高的活性，70℃作用40min后活性略降低，80℃作用20min时依然保持活性，但活性下降，随后40min内保持稳定，表明噬菌体热稳定性较高。

实施例9沙门菌噬菌体ph2-2的pH稳定性试验

取100uL(1.8×10¹⁰PFU/m L)噬菌体于1.5m L无菌EP管中，并分别加入900uL不同pH值(3～12)的PBS缓冲液，37℃水浴1h，倍比稀释，采用双层平板法测定其滴度。重复实验三次。

结果如图8所示：ph2-2在pH 5.0-11.0范围内有较高的活性，而pH低于5.0或者大于12.0时失活；ph3-3在pH 5.0-7.0范围内有较高的活性，而pH 9.0-11.0范围内活性下降，低于5.0或者大于12.0时失活。

实施例10沙门菌噬菌体ph2-2的紫外稳定性试验

取噬菌体液1m L于6孔板中，每株设3个平行，在紫外灯下(20W，90cm)分别处理0、5、15、30min，再转移至暗处平衡30min，分别测定不同处理时间下噬菌体效价。

结果如图9所示：ph2-2在紫外线照射下5min时活性不变，15min后开始略下降，至30min时活性下降仍较少，表明噬菌体紫外稳定性较高。

实施例11沙门菌噬菌体ph2-2的酒精稳定性试验

将噬菌体原液10ul加入990ul 75％酒精中，同时以10ul噬菌体原液加990ulddH2O作为对照。每隔10min分别取样，倍比稀释后双层平板法测定噬菌体滴度。

结果如图10所示：ph2-2在酒精作用下20min内有较高的活性，30min时活性略下降，表明噬菌体酒精稳定性较高。

实施例12沙门菌噬菌体ph2-2在小鼠肠炎治疗性中的试验

1.接种用沙门菌的制备

根据实验室前期测得沙门菌分离株1344的LD₅₀，将上述菌株培养至浓度约10⁷CFU/mL，50ml，室温下7000r/min离心15min集菌，无菌PBS洗涤3次，5ml PBS重悬，配制其浓度约10⁸CFU/mL的菌液备用。

2.小鼠模型的建立

取40只4-6周龄c57小鼠，分为8组，记录初始体重，试验前断水断食12h，试验开始后连续记录各组小鼠情况(腹泻、体重、死亡)。

分组及处置情况如下:

A1组(PBS对照组)：小鼠5只，每只灌胃0.1mL无菌PBS，6h后灌胃无菌PBS 0.1ml，此后4天每隔12h重复灌相同剂量PBS，4天后停止灌胃，每天观察其健康情况至试验结束。

A2组(噬菌体治疗组)：小鼠5只，每只灌胃0.1mL菌液(菌浓度为10⁸CFU/mL)，感染6h后，灌胃ph2-20.1mL(10⁸PFU/mL，MOI＝1)。此后4天每隔12h重复灌相同剂量噬菌体，4天后停止灌胃，每天观察其健康情况至试验结束。

A3组(攻菌感染组)：小鼠5只，每只灌胃0.1mL菌液(菌浓度为10⁸CFU/mL)，感染6h，此后4天每隔12h重复灌相同剂量PBS，4天后停止灌胃，每天观察其健康情况至实验结束。

A4组(噬菌体对照组)：小鼠5只，每只灌胃0.1mL噬菌体ph2-2(10⁸PFU/mL)，此后4天每隔12h重复灌相同剂量噬菌体，4天后停止灌胃，每天观察其健康情况至实验结束。

B1组(PBS对照组)：小鼠5只，每只腹腔注射0.1mL无菌PBS，6h后腹腔注射无菌PBS0.1ml，此后每隔12h重复腹腔注射相同剂量PBS，至试验结束。

B2组(噬菌体治疗组)：小鼠5只，每只腹腔注射0.1mL菌液(菌浓度为10⁷CFU/mL)，感染6h后，腹腔注射ph2-2 0.1mL(10⁷PFU/mL，MOI＝1)。每隔12h重复注射相同剂量噬菌体，连续治疗至实验结束。

B3组(攻菌感染组)：小鼠5只，每只腹腔注射0.1mL菌液(菌浓度为10⁷CFU/mL)，感染6h，此后每隔12h重复注射相同剂量PBS，至试验结束。

B4组(噬菌体对照组)：小鼠5只，每只腹腔注射0.1mL噬菌体ph2-2(10⁷PFU/mL)，此后每隔12h重复注射相同剂量噬菌体，连续注射至试验结束。

2.试验结果

PBS对照组与噬菌体对照组在灌胃与观察期内以及腹腔注射期间，无死亡现象，各组小鼠皮肤、被毛、粘膜未见异常，各项体征、肢体活动状况及行动反应能力也无异常现象，体重变化和死亡率见图11。

沙门菌灌胃感染组小鼠分别于第7、8、10天死亡1、2、1只，最终小鼠存活率为20％；沙门菌腹腔注射感染组小鼠分别于第36、48、60h死亡1、1、3只，最终小鼠存活率为0。两组小鼠均出现体重减轻，死亡前一天出现弓腰蜷缩、被毛粗乱，睁眼无力以及脱水状态。

噬菌体灌胃治疗组小鼠于第6天死亡1只，1只小鼠在治疗前5天出现体重减轻，随后5天体重逐渐恢复，其他小鼠无异常现象，最终治愈率为80％；噬菌体腹腔注射治疗组小鼠于48h内体重减轻，48h后体重逐渐恢复。

结果表明，本发明的沙门菌噬菌体ph2-2能有效治疗鼠伤寒沙门菌1344引起的感染性肠炎。

Claims (2)

1.一株广谱耐高温沙门氏菌烈性噬菌体(Salmonella bacteriophage)ph2-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211353。

2.权利要求1所述的耐热沙门氏菌烈性噬菌体(Salmonella bacteriophage)ph2-2在沙门氏菌防控中的应用。

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