CN117660233A - 一株快速稳定降解脂多糖且无溶血活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株快速稳定降解脂多糖且无溶血活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株快速稳定降解脂多糖且无溶血活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌S9菌株已于2023年09月28日保藏于广东省菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63846。研究显示，S9菌株无溶血活性，具有生物安全性，能高效降解脂多糖；S9菌株的发酵液能够直接去除90EU的脂多糖，在极短时间内达到100％的去除率；且其发酵液在加热、酶解处理后仍能快速稳定地降解脂多糖。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌S9菌株能够高效稳定降解脂多糖，从而达到抗炎效果，能更广泛地应用到去除脂多糖的药物或环境中，为防控内毒素污染提供新的可治理的高效菌株和方法，充实了微生物菌种资源库。

Description

一株快速稳定降解脂多糖且无溶血活性的解淀粉芽孢杆菌及 其应用
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一株快速稳定降解脂多糖且无溶血活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
细菌内毒素(Endotoxin)又称脂多糖(LPS)，广泛存在于革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌等的细胞外膜中，是革兰氏阴性菌分裂或死亡时释放出来的具有内毒素生物活性的物质。内毒素普遍存在于食品、饲料、环境、医疗器械、药品以及革兰氏阴性菌感染的患者体内，并对人类和动物健康具有潜在的危害。其中，在集约化、规模化的畜禽养殖模式下，舍内外环境中内毒素蓄积是畜禽亚健康、降低料肉转化比和畜禽疫苗免疫不应答的主要原因；而去除环境中的内毒素可以提高料肉转化比、减少禽畜肠道内内毒素含量，提高其免疫力与抗病力。
在人体感染革兰氏阴性细菌后，由于革兰氏阴性菌死亡崩解后释放在体内，并且能通过组织液流入血液，脂多糖可以通过细胞信号转导系统激活特定效应细胞产生活性因子，同时次级淋巴细胞分泌多克隆抗体，促进血小板分泌生长和凝集分子，使中性粒细胞释放活性氧化分子；进而激活凝血系统、引起机体发热、内皮细胞损伤、肠道屏障功能改变，导致激素水平、机体代谢以及神经内分泌的改变，严重者可导致低血压、中毒性休克、弥漫性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭甚至死亡，会引发败血症或脓毒血症病。在非感染条件下，少量的LPS也会从肠道转运到循环中，可以引起低度炎症，导致代谢综合征的发生。因此，内毒素的降解消除对于保障人类及动物的健康具有重要的意义。
现有研究中对内毒素的降解消除技术主要集中在利用物理吸附材料吸附清除或是利用多粘菌素B、抗菌肽等昂贵药物中和或降解。现有处理技术对材料稳定性、生物安全性要求高，成本昂贵。与现有技术方法相比，微生物法消除内毒素不仅安全、对环境污染小、成本低，而且能在一定程度上产生抗炎效果。如现有技术公开了一株能够降解脂多糖的解淀粉芽孢杆菌D1菌株，在4h反应后对60EU/mL内毒素的降解率达到97％；但由于多数解淀粉芽孢杆菌具有溶血活性，为条件致病菌，并不能直接应用于人和动物中，如制备药物制剂，用于败血症或脓毒血症病人体内LPS降解应用，及食品加工后LPS的降解应用。现有技术公开的一株益生菌凝结芽孢杆菌SA12菌株，在4h对80EU/mL的脂多糖去除为91.55％，其降解作用还有待提升。且目前仍然缺乏具有益生功能的安全菌株，能够对于内毒素的完全降解消除，并能直接用于食品、药品、动物饲料以及药品制造、临床医疗等环境中、以及革兰氏阴性菌感染患者体内。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有降解脂多糖菌株的安全问题，提供一株快速稳定降解脂多糖且无溶血活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S9菌株。
本发明另一目的是提供S9菌株的应用。
本发明又一目的是提供一种脂多糖降解制剂。
本发明再一目的是提供一种降解脂多糖的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明分离鉴定得到一株无溶血活性并且能用于快速稳定降解脂多糖的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S9菌株，该菌株已于2023年09月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：63846。研究显示，S9菌株从酒饼中筛选分离纯化而得，菌株的菌落形态为圆形，呈不透明乳白色，表面光滑湿润，质地粘稠；细胞呈杆状，革兰氏阳性。S9菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长约1389bp。
本发明通过哥伦比亚血平板和内毒素降解测定显示S9菌株无溶血活性，具有安全性，能高效降解脂多糖。S9菌株不仅能减少样品中脂多糖毒性，还能够在短时间内稳定快速地完全降解脂多糖。且S9菌株的发酵上清液、代谢产物或酶系均能快速稳定地降解脂多糖，在高温下也具有很好的稳定性，能够用于各类加工药品、食品、饲料产业中降解脂多糖。
本发明提供的S9菌株无溶血活性，说明其无毒无害，可以应用于具有生命体的环境中；还能够耐高温，说明其稳定性好，可以应用于各类药品、食品、饲料环境中，并且应用于人体内和家禽家畜体内而不会产生过敏，可直接用于饲料脱毒，代替目前常用的吸附剂去除毒素，如饲料添加剂的制备；同时，该类有效代谢产物还能用于制备治疗脂多糖引发的败血症或脓毒血症病治疗相关的药物、或用于食品添加剂。
因此，本发明提供解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液、和/或从其发酵培养液中分离出来的代谢物或酶系在降解脂多糖，或在各类加工药品、食品、临床制药、饲料产业中降解脂多糖、在制备脂多糖降解菌剂、在制备败血症或脓毒血症病治疗药物、或在制备食品添加剂中的应用。
本发明提供一种脂多糖降解制剂，含解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液、和/或从其发酵培养液中分离出来的代谢物或酶系。
优选地，所述发酵液为去除菌体的上清液。
优选地，所述发酵液浓度为1.0×105～1.0×1010CFU/mL。
更优选地，所述发酵液浓度为1.0×108CFU/mL。
本发明还提供一种降解脂多糖的方法，采用解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液对脂多糖或含脂多糖的样本进行降解处理。
优选地，所述发酵液为菌株发酵上清液或从发酵上清液分离出来的代谢产物或酶系。
更优选地，所述代谢产物为煮沸加热后去除菌体的上清液。
更优选地，所述代谢产物为酶解加热后去除菌体的上清液。
进一步地，所述发酵液的制备方法为：取接种量为0.1％～0.5％的S9菌株置于发酵培养基中，在pH 4.0～9.0，30～37℃，150～200rpm条件下发酵8～24h，即得。
优选地，所述发酵培养基采用TSB培养基。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一株无溶血活性并能降解脂多糖的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)S9菌株，该菌株无溶血活性，具有很好的安全性，还具有极其显著的脂多糖降解能力；S9菌株能够在短时间内稳定快速地完全降解脂多糖，采用菌株的发酵上清液、代谢产物或酶系的稀释溶液处理90EU的脂多糖，能够在体外快速稳定地降解脂多糖，达到完全降解的效果，能够更好地应用于食品、药品、动物饲料以医疗器械等环境中、以及革兰氏阴性菌感染患者体内。本发明提供的无溶血活性解淀粉芽孢杆菌S9菌株能够更高效、作用更加广泛的降解消除内毒素，为防控内毒素污染提供新的可治理的高效菌株和方法。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌S9形态特征(左为菌落图；右为革兰氏染色结果图)。
图2为解淀粉芽孢杆菌S9进化树。
图3为不同解淀粉芽孢杆菌的溶血效果图。
图4为不同解淀粉芽孢杆菌对内毒素的降解效果图。
图5为解淀粉芽孢杆菌S9不同细胞成分对内毒素的降解效果图。
图6为解淀粉芽孢杆菌S9不同发酵液成分对内毒素的降解效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中采用的培养基配方如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉浸膏10g/L，无水葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温80 1g/L，琼脂15g/L，用蒸馏水配制而成。
TSA培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/100L，氯化钠5g/L，K2HPO42.5g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂15g/L，用蒸馏水配制而成。
TSB培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/100L，氯化钠5g/L，K2HPO42.5g/L，葡萄糖2.5g/L，用蒸馏水配制而成。
实施例1菌株的分离筛选
1、菌株的分离
采用99mL无菌生理盐水稀释1g捣碎的酒饼(来源于本课题组存储的发酵酒饼)置于加有适量玻璃珠锥形瓶中，放于室温200rpm/min摇床中30min，使得样品混合均匀，微生物得到充分分散，此三角瓶中的菌悬液的菌浓度即为10-2。
在超净工作台里用无菌生理盐水，进行浓度梯度稀释菌悬液，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9菌悬液稀释梯度，将10-7、10-8和10-9菌悬液在灭菌后的MRS固体培养基中涂布，37℃培养，之后挑取每个形态的菌落对其进行分区划线纯化培养，并重复两次，最后得出单菌落，保藏备用。
2、形态学鉴定
将单菌落接种于TSB培养基平板上37℃倒置培养12h，观察其菌落形态。在培养基培养12h的菌落形态如图1所示，菌落呈现不透明乳白色，表面光滑湿润，菌株通过革兰氏染色呈阳性；经测定该菌的适宜生长温度范围37～50℃，适宜生长pH范围6～7。
3、分子生物学鉴定
纯化后的菌株于TSB培养基培养活化24h后，采用SDS法对纯化后的细菌进行DNA提取，使用通用引物27f和1492r(27f：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对细菌保守序列进行扩增。再将扩增产物送至测序公司进行测序，并将得到的序列进行拼接，将拼接后的序列在NCBI数据库进行比对。
根据多次重复比对结果，显示分离得到的菌株的16S rRNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)同源性最高，同时利用Mega软件邻接法进行进化树构建结果如图2所示，相似性达100％；其菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，最终将分离得到的新菌株分类地位确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并将该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S9菌株，并于2023年09月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：63846，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2解淀粉芽孢杆菌的溶血活性测试
溶血活性是指细菌分泌的溶血素使细胞溶解的现象，溶血素作为细菌致病的重要毒力因子，在动物细菌性疾病的发病过程中起着不容轻视的作用，也是评价益生菌安全性的重要指标之一。溶血现象可分为：完全溶血、不完全溶血和不溶血。完全溶血也称为β-溶血，使平板中菌落周围出现透明色圈，有致病性；不完全溶血也称为α-溶血，使平板中菌落周围出现草绿色圈，为条件致病菌；不溶血，平板中菌落周围不会有任何变化，无致病性。
采用S9菌株、解淀粉芽孢杆菌D1菌株(D1菌株为本发明课题组前期分离得到、并记载于现有技术的解淀粉芽孢杆菌，D1菌株已于2021年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62088)、和S12菌株(S12菌株是与S9菌株同时分离出，并进行鉴定得到的另一株解淀粉芽孢杆菌)，取不同菌液点样于哥伦比亚血平板(购自于广州环凯微生物)上，置于37℃恒温培养24h，观察菌株在血平板上的表现。
解淀粉芽孢杆菌的溶血活性测定结果如图3所示，显示S9菌株在血平板上生长，但对平板上的血细胞无致病性影响，平板周围不发生任何变化，说明S9菌株无溶血活性，具有生物安全性。而菌D1菌株、S12菌株在血平板上出现草绿色圈，表现为α-溶血。由此，显示S9菌株无溶血活性具有更好的生物安全性，说明其无毒无害，是可以直接应用于生命体的环境中，够更好地应用于食品、药品、动物饲料以医疗器械等环境中、以及革兰氏阴性菌感染患者体内。
实施例3解淀粉芽孢杆菌降解脂多糖的能力测定
脂多糖检验方法采用鲎试剂动态显色法，购自湛江安度斯生物有限公司。脂多糖来源于中国食品药品检定研究院细菌内毒素工作标准品90EU/支。
1、菌株培养
配制TSB培养基，将30g TSB粉末放入1L无菌水中混匀，将其放入至试管中，每管为5mL，灭菌后以0.1～0.5％的接种量分别将S9菌株、D1菌株两株解淀粉芽孢杆菌接入，在37℃，180rmp摇床中培养12h。
2、样品处理
从培养好的菌液中吸取5mL的菌液至于去热源的离心管中，离心条件为4000rmp，10min，将发酵液转移到去热源的试管，并设置不同实验处理组。
实验的处理组为：S9发酵液、D1发酵液；
对照组为：没有接入菌液的空白TSB培养基。
分别取菌株的发酵液和TSB空白培养基，各加入1mL 90EU的脂多糖中，在30～37℃条件下分别反应0h、4h；取0h反应后溶液和4h反应后溶液分别稀释400倍、800倍以及1600倍稀释液，然后各取0.1mL的稀释后的溶液，加到除热原微孔板内，每一浓度加3孔，再分别加入0.1mL鲎试剂，采用中速振摇10s混匀后，将微孔板放入已预热好的内毒素自动分析仪ELx808中进行检测，同时建立标准曲线，采用0.005EU/mL、0.05EU/mL、0.5EU/mL和5EU/mL浓度的标准内毒素，每一浓度内毒素溶液至少3个平行孔，阴性对照平行2孔，检测的结果取三个平行处理的结果平均值。
脂多糖的降解率定义为：可降解成分中，已降解部分的质量占可降解成分初始质量的百分比。
3、实验结果
脂多糖降解结果如图4所示，在菌株D1的发酵液组中，0h处理脂多糖后，脂多糖含量略高于对照组，随着处理时间的增加，4h时大部分脂多糖被降解，但降解效果不如S9菌株。在菌株S9的发酵液组中，0h处理脂多糖后，脂多糖含量由146.754EU/mL降至低于8EU/mL；在4h处理脂多糖后，脂多糖基本完全降解。解淀粉芽孢杆菌S9菌株发酵上清液可以在短时间极其显著地降解脂多糖，降解效率高达99％。
综上，可知本发明分离的S9菌株对脂多糖的降解效果优于D1菌株，能快速降解很高浓度的脂多糖。
实施例4S9菌株不同细胞组分对脂多糖的降解实验
选用灭菌的TSB液体培养基以0.1～0.5％的接种量将S9接入，在37℃，180rmp摇床中培养12h，从培养好的菌液中吸取5mL的菌液至于去热源的离心管中，离心条件为4000rmp，10min，将上清液转移到去热源的试管，菌泥加入去热源的水，制备得到解淀粉芽孢杆菌S9的胞外提取物、胞内提取物，以探究解淀粉芽孢杆菌S9菌株不同细胞组分对脂多糖的降解效果。
实验的处理组为：S9菌体Bacteria、去除菌体的上清液Supernatant；
对照组为：没有接入菌液的空白TSB培养基。
分别取菌悬液，菌液上清液置于TSB培养基内，准备TSB空白培养基，各加入1mL90EU的脂多糖中，在30～37℃条件下分别振荡反应；取反应后溶液分别稀释100倍、200倍以及400倍稀释液，然后各取0.1mL的稀释后的溶液，加到除热原微孔板内，每一浓度加3孔，再分别加入0.1mL鲎试剂，采用中速振摇10s混匀后，将微孔板放入已预热好的内毒素自动分析仪ELx808中进行检测，同时建立标准曲线，采用0.005EU/mL、0.05EU/mL、0.5EU/mL和5EU/mL浓度的标准内毒素，每一浓度内毒素溶液至少3个平行孔，阴性对照平行2孔，检测的结果取三个平行处理的结果平均值。
实验结果如图5所示，在对照组中TSB培养基(未去除脂多糖)和90EU的脂多糖总共含脂多糖144.4EU/mL；而在S9菌体组加入脂多糖振荡后，脂多糖含量为115.42EU/mL，大部分脂多糖未被降解。在上清液组加入脂多糖振荡后，脂多糖含量迅速降到低于0.20EU/mL，脂多糖降解率达到100％。通过菌体和上清液作为解淀粉芽孢杆菌S9的胞内代谢物和胞外代谢物，进一步探究S9菌株有效介导内毒素降解过程的成分是否存在于菌体内。从实验结果看出，S9菌株的有效成分大部分属于菌株的胞外代谢产物。
实施例5S9菌株不同代谢组分对脂多糖的降解实验
由实施例4结果显示解淀粉芽孢杆菌S9菌株发酵液具有显著降解脂多糖的能力，进一步探究解淀粉芽孢杆菌S9菌株的不同代谢组分对脂多糖降解效果。将解淀粉芽孢杆菌S9接种于TSB培养基中，37℃、180rmp培养12h。制备解淀粉芽孢杆菌S9的发酵上清液、加热处理上清液、酶解上清液。
发酵上清液：吸取部分菌液于新鲜的TSB培养基中，使得OD600＝0.5～0.8，37℃、180rmp培养12h；于8000rpm，4℃离心10min得到发酵上清液，发酵液浓度为1.0×108CFU/mL，所得上清液视为解淀粉芽孢杆菌S9代谢产物。
加热处理上清液：吸取部分发酵上清液置于沸水浴中加热10min，使用100℃热水和高温蒸汽加热灭活不耐高温的代谢物，再经过8000rpm，4℃离心10min取上清部分即为加热处理上清液。
酶解上清液：取部分发酵上清液加入1.5％的木瓜蛋白酶，混匀后在49℃下反应2h。将反应后溶液沸水浴10min，灭活木瓜蛋白酶和不耐高温代谢物，再置于8000rpm，4℃离心10min取上清部分即为酶解上清液。
分别取相同用量的发酵上清液、加热处理上清液、酶解上清液置于TSB培养基内，准备TSB空白培养基，各加入1mL 90EU的脂多糖中，在30～37℃条件下分别反应5～20min；取反应后溶液分别稀释4倍、8倍以及16倍稀释液，然后各取0.1mL的稀释后的溶液，加到除热原微孔板内，每一浓度加3孔，再分别加入0.1mL鲎试剂，采用中速振摇10s混匀后，将微孔板放入已预热好的内毒素自动分析仪ELx808中进行检测，同时建立标准曲线，阴性对照平行2孔，检测的结果取三个平行处理的结果平均值。
实验结果如图6所示，当TSB培养基(未去除脂多糖)和90EU的脂多糖总共含脂多糖144EU/mL；在S9发酵上清液组中，经过处理脂多糖后，脂多糖含量由144EU/mL降至低于0.20EU/mL；与此同时S9加热上清液组、S9酶解上清液组的脂多糖也基本完全降解(即100％降解)。本实验选用的木瓜蛋白酶具有较广泛的特异性，能够广泛地消化蛋白质底物，由木瓜蛋白酶、加热处理后的上清液大部分的蛋白质底物基本被降解，根据实验结果推测S9菌株代谢产物介导的脂多糖降解过程可能是一种非酶促过程，并且具有较好的高温耐受性，使用S9菌株能够稳定快速的降解内毒素，能更好的用于高温以及其他严苛的使用环境下降解脂多糖。
综上，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S9菌株无溶血活性，具有很好的安全性，还具有极其显著的脂多糖降解能力；S9菌株能够在短时间内稳定快速地完全降解脂多糖，采用菌株的发酵上清液、代谢产物或酶系的稀释溶液处理90EU的脂多糖，能够在体外快速稳定地降解脂多糖，达到完全降解的效果，能够更好地应用于食品、药品、动物饲料、临床制药和医疗器械等环境中、以及革兰氏阴性菌感染患者体内。本发明提供的无溶血活性解淀粉芽孢杆菌S9菌株能够更高效、作用更加广泛的降解消除内毒素，为防控内毒素污染提供新的可治理的高效菌株和方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S9菌株，其特征在于，所述菌株已于2023年09月28日保藏于广东省菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63846。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液在降解脂多糖，或在各类加工药品、食品、临床制药、饲料产业中降解脂多糖中的应用。
3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液、和/或从其发酵培养液中分离出来的代谢物或酶系在制备脂多糖降解菌剂中的应用。
4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液、和/或从其发酵培养液中分离出来的代谢物或酶系在制备败血症或脓毒血症病治疗药物、或在制备食品添加剂中的应用。
5.一种脂多糖降解制剂，其特征在于，含权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液、和/或从其发酵培养液中分离出来的代谢物或酶系。
6.根据权利要求5所述制剂，其特征在于，所述发酵液为去除菌体的上清液。
7.根据权利要求6所述制剂，其特征在于，所述发酵液浓度为1.0×105～1.0×1010CFU/mL。
8.一种降解脂多糖的方法，其特征在于，采用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌S9菌株和/或其发酵液对脂多糖或含脂多糖的样本进行降解处理。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述发酵液为菌株发酵上清液或从发酵上清液分离出来的代谢产物或酶系。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述发酵液的制备方法为：取接种量为0.1％～0.5％的S9菌株置于发酵培养基中，在pH 4.0～9.0，30～37℃，150～200rpm条件下发酵8～24h，即得。
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