CN1186440C - 预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双歧杆菌属的新的微生物，它能够防止病原性细菌引起的腹泻。特别是，本发明涉及所说的微生物在可吸收的载体的制备方面的应用以及含有这种微生物的组合物。

Description

预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌

本发明涉及双歧杆菌属的新的微生物，它能够预防病原性细菌引起的腹泻。特别是，本发明涉及所说的微生物在可吸收的载体的制备方面的使用和含有这种微生物的组合物。

很久以来，产生乳酸作为主要代谢组合物的微生物就为人们所知。在牛奶或牛奶处理工厂中，活着或腐烂的植物中也可在人和动物的肠子中发现这些细菌。这些微生物概述为“乳酸细菌”，其代表了一组相当不同类的细菌包括乳球菌(Lactococcus)、乳菌(Lactobacillus)，链球菌(Streptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、片球菌(Pediococcus)等。

乳酸细菌作为低pH值条件下保存食物的发酵剂使用，发酵产物的作用抑制有害细菌的生长。另外，乳酸细菌也用于制备不同的乳制品例如奶酪、酸奶酪和其他发酵的乳制品。

近期，乳酸细菌的一些菌株显示出对人和动物的吸收颇有价值的性质，引起了人们的密切关注。特别是，特殊的乳酸菌或双歧杆菌的菌株被发现能够在肠内膜繁殖。它们暂时性或长期的保持在肠胃中被认为对于人类的健康具有巨大的正面的作用。

在这方面，EP 0 768 375公开了双歧杆菌的特异性菌株，这种菌株能够灌输进入肠内并且粘附在肠细胞上。报道说这些双歧杆细菌有助于免疫功能，能够竞争性排除病原性细菌对肠内细胞的粘附，有助于维持生物个体的健康。

在最近几年科研集中在乳酸细菌作为益生菌试剂的潜在应用。益生菌被认为是能通过保持肠内自然微生物区系促进生物个体健康的可生长的微生物制品。微生物制品通常被认为是益生菌也就是这种有效的微生物并且人们已经知道了它们作用的模式。益生菌贴附在肠粘膜上，在肠道内生长并且防止有害微生物在其上粘附。对于它们在肠内发挥作用的至关重要的先决条件是它们必须以一种适当的能存活的方式粘附到内脏的粘膜上而且在胃肠上部不被消灭，特别是不受胃内低pH区域的影响。

在这方面，作为这样的一种益生菌，WO 97/00078公开了一种特异性菌株，称为乳酸菌GG(ATCC53103)。在防止或治疗食物诱发的过敏反应的方法中特定使用这种微生物，也就是将其和已经经过用胃蛋白酶和/或胰酶一起进行水解处理的食品材料一起给药于受体。所选择的乳酸菌菌株显示了粘附和建群性能及蛋白酶体系，以至于含在将被给药的食物中的蛋白质通过被这种特殊的乳酸菌分泌的蛋白酶进一步水解。这份文件所讨论的方法最终导致蛋白质被内脏消化，没有显示出存在任何引起过敏的物质。

更进一步，在EP 0 577 903参考资料中采用了这种乳酸菌，它具有取代幽门螺杆菌的能力，幽门螺杆菌公认是引起溃疡的原因，上述制备可以治疗和预防幽门螺杆菌引起的溃疡。

乳酸菌特定的菌株可以提供有价值的特性，技术人员期望发现另外的细菌菌株能够有益于人类和/或动物的健康。

因此，本发明的问题是提供另外的乳酸菌菌株，它能表现出对人和/或动物例如宠物有益的新性质。

通过提供新的属于双歧杆菌属的新的微生物得到了解决，这些新的微生物具有防止病原性细菌移植肠胃引起腹泻的能力且用它们制备可吸收的载体物质。

这种双歧杆菌是从由长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CNCM I-2169和CNCM I-2170组成的组中选择。

本发明的微生物显示有如下特性：它们是革兰氏阳性，过氧化氢酶试验阴性和CO₂生产阴性，它们生产L(+)乳酸和可以基本上防止引起腹泻的细菌诸如致病的大肠杆菌、例如致肠病的E大肠杆菌(EPEC)、或沙门氏例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)在肠胃细胞上建群。

新的微生物可以用于制备一种可吸收的载体物质，例如奶、酸奶酪、凝乳、奶基发酵产品、发酵谷类产品、奶粉(milk based powders)、婴儿食品或宠物食品，也可以大约10⁵cfu/g到10¹¹cfu/g的量包含在载体中。本发明采用的缩写cfu的意思是“菌落形成单位”，定义为琼脂板上的微生物计数器所表示的细菌细胞的数目。

本发明也提供一种食品或药物组合物，含有至少一种双歧杆菌菌株，和/或含有一种其中生长有微生物的上清液，或其活性部分。在此方面，细菌上清液也显示具有抗病的活性。

为了制备本发明的食物组合物，至少一种双裂菌菌株被加到在合适的载体中，其含量为大约10⁵cfu/g到10¹²cfu/g，优选含量为大约10⁶cfu/g到10¹⁰cfu/g，更优选含量为大约10⁷cfu/g到10⁹cfu/g。

药品可以以片剂、液体细菌悬浮液、干的口服补充剂、湿的口服补充剂(oralsupplements)、干的管饲或湿的管饲等等的形式制备，所用的双歧杆菌的含量高达10¹²cfu/g，优选大约10⁷cfu/g到10¹¹cfu/g，更优选10⁷cfu/g到10¹⁰cfu/g。

微生物在生物体肠内的活性当然取决于剂量。也就是分别通过上述食品或药物组合物摄入的微生物越多，保护和/或治疗的作用越高。由于所用的微生物对于人类或动物无害，实际上是从自然环境中分离出来的，也就是从婴儿的粪中分离出来的，加入的量高，生物体肠内新微生物建群的比例也就高。

根据另一个实施方案，本发明的双歧杆菌培养基的上清液或活性部分，可以用于制备可吸收的载体。这些上清液可以这样使用或在不毁灭被这些微生物分泌的代谢化合物的条件下干燥例如冷冻干燥加入液体介质，也可以包容在载体中。为了最大程度的减少上清液中未知化合物的数量，双歧杆菌优选在指定的培养基中培养，培养基的组合物是已知的并且对于宿主没有负的影响。而且熟练的操作人员根据一般的常识将从上清液分离未知的产物，例如采用色谱方法。

在这些图中

图1表示细胞系CNCM I-2169(称为Bl28/Ca1)和长双歧杆菌CNCM I-2170(称为BL29/F9)粘附在培养基中人类肠细胞的能力。

图2表示病原细菌对于长双歧杆菌CNCM I-2170(称为BL29/F9)的病原敏感性。

图3表示病原细菌对于长双歧杆菌CNCM I-2169(称为Bl28/Ca1)的病原敏感性。

图4表示细胞系Bl28/cAL和BL29/F9对于鼠沙门氏菌SL1344感染Caco-2细胞的活性。

图5表示鼠沙门氏菌SL1344感染的小鼠和用双歧杆菌BL29/F9处理的小鼠的存活率。

在进行本发明的广泛研究中，发明人调查了婴儿粪便并分离了不同的细菌菌株。随后检验了这些菌株防止引起腹泻的细菌在上皮细胞的建群和/或侵入，引起腹泻的细菌诸如大肠杆菌(E.coli)、志贺氏菌(Sigella)，克雷伯氏杆菌(Klèbsiella)，耶尔森氏菌(Yersinia)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、赖文氏菌(Listeria)、链球菌(Streptococcus)，Staphilococcus，难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)，幽门螺杆菌(H.pyori)以及白色假丝酵母(Candidaalbicans)。

依据对腹泻的抑制性，包含双歧杆菌属、乳球菌属和链球菌属在内的几种细菌被筛选。采用病原微生物例如大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌和鼠沙门氏菌作为感染生物个体引起腹泻的病原微生物进行抑制性能试验。

各种细菌在适当的培养基中生长，例如在它们适宜的MRS、Hugo-Jago或M17培养基中，最佳的生长温度30到40℃生长。在这些细菌稳定生长后采用离心分离和在生理盐水溶液中重新悬浮收集这些细菌。在这些不同试验之间这些细菌细胞被冷冻储存(-20C)。

选择下列方法评估抗菌的性能。

按照一个方案检验了本发明培养的双歧杆菌减少不同病原性微生物存活能力的性能。为此，病原细菌培养物和浓缩双歧杆菌培养物的上清液相接触并检验病原细菌的生长势。

按照第二个方案检验了本发明双歧杆菌在肠的细胞模型培养物T₈₄细胞上的粘附能力。为此，双歧杆菌和T₈₄细胞一起培养并检验粘附率。

按照另一个方案检测了本发明的双歧杆菌防止肠细胞沙门氏菌感染的能力，采用了细胞系Caco-2作为肠的模型。在这方面，本发明的双歧杆菌细胞培养物上清液和病原微生物一起加入肠细胞并分别检验粘附或侵入率。

培养的双歧杆菌和上清液证明具有极大的防止粘附和侵入肠细胞的作用，表明新微生物分泌的代谢化合物具有抗腹泻能力。

本发明将举例说明。并不局限于这些例子。

培养基和溶液

MRS(Difco)

Hugo-Jago(胰蛋白胨30g/l(Difco)，酵母提取物10g/l(Difco)，乳糖5g/l(Difco)，KH₂PO₄ 6g/l，

牛肉汁2g/l(Difco)，琼脂2g/l(Difco)

M17(Difco)

密集的西红柿琼脂(罐装西红柿汁400ml，密集的琼脂(Eugon agar)BBL45.5g，麦芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，琼脂(Difco)5g，蒸馏水600ml)

DMEM(Dulbecco`s modified eagle medium)

CFA(根据Ghosh等等，Journal of Clinical Microbiology，1993  31 2163-6)

Muller Hinton琼脂(Oxoid)

LB(Luria Bertami，Maniatis，实验室手册，冷泉港，1992)

C¹⁴-醋酸盐(53，4Ci/mMol，Amersham International PLC)

PBS(NaCl 8g/l，KCl 0.2g/l，nAhpo4 1.15g/l，kh2po4 0.2g/l)

胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)

FCS胎牛血清(Gibco)

从西雅图华盛顿大学获得大肠杆菌DAEC C 1845，从美国马里兰大学疫苗发展中心获得E大肠杆菌JPN15。

从美国加利福尼亚斯坦福大学微生物系获得鼠沙门氏菌株SL1344。这种菌株作为病员细菌作用在小鼠上，这种细菌抗链球菌。它粘附在Cac)-2结肠细胞(Finlay和Falkow，1990)。

从法国Faculte de Pharmacie Paris XI Chatenay-Malabry，微生物实验室获得的库存临床分离物获得克雷伯氏杆菌。

从INSERM Unit411，Hpital Necker，Paris，France，获得耶尔森氏杆菌。

从Faculte de Pharmacie Paris XI，Chatenay-Malabry，France的微生物实验室的库存临床分离物获得铜绿假单胞菌。

从Institute of Microbiology，Lausanne University，Lausanne Switzerland获得幽门螺杆菌。

实施例1

双歧杆菌的分离

从15到27天大的健康婴儿的尿布收集新鲜的粪便。1克新鲜粪便在无氧的条件下送到实验室，并且在从取样开始的两小时内用Ringer溶液系列稀释，并涂在选择性培养基上进行微生物分析。密集的西红柿琼脂(罐装西红柿汁400ml，密集的琼脂BBL45.5g，麦芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，琼脂(Difco)5g，蒸馏水600ml)37℃下培养48小时用于分离双歧杆菌。随机采集菌落并提纯。对于分离株进行生理学和遗传学表征。

实施例2

培养细胞系

Caco-2细胞：

细胞系Caco-2作为小肠的成熟的肠细胞模型，用于抑制作用的检验。这种细胞具有肠细胞特征例如极化、肠酶表达、特定结构多肽的制备等等。这些细胞在不同的载体上生长，也就是在塑料盘(25cm² Corning)用于生长和繁殖，在脱脂和灭菌6well玻璃皿(22×22mm，cornning)用于粘附和抑制试验。在培养第二天后按照日常规则改变培养基(DMEM)。在使用之前，用100U/ml的青霉素/链霉素，1μm氨苄青霉素，56℃30分钟灭活的20％FC和含有非必需氨基酸溶液1％(10Mm)(Eurobio，Paris，France)补充培养基。在90％的空气和10％的CO₂组成的大气中37℃下培养。这些细胞每六天分离一次。这些细胞在PBS中pH7.2条件下用0.015％胰酶和3mM EDTA进行处理。为了中和胰酶的作用，等体积的含有FCS的培养基加入获得的细胞悬浮液，将这些混合物离心分离(1000转10分钟)然后在培养基介质中溶解分离产物。计算活细胞数量(不用苔盼蓝染色)。大约3.5×10⁵活细胞转移到新的培养瓶，每个孔大约1.4×10⁵细胞并培养直到获得细胞融合单层。

T₈₄细胞 ：

为了分析粘附性，细胞系T₈₄作为肠的结肠细胞样品。这些细胞系具有肠细胞的特征例如极性、肠酶表达、特别结构多肽的生产等等。从University ofCalifornia，San Diego，CA.获得T₈₄细胞。在90％的空气和10％的CO₂组成的大气中37℃条件下细胞在DMEM(50％)和Ham`s F12(50％)中生长，用2mM谷氨酸盐，50mM HEPES，1％非必需氨基酸和10％的灭活(30分钟，56℃)胎牛血清(Boehringer，Mannheim，Germany)补充。细胞以10⁶/cm²的浓度接种。细胞最迟在汇合后也就是在10天以后进行粘附性能检验。

除了双歧杆菌外所有的菌株-80℃维持在含有15％甘油的培养基中。因为转移到新培养基的数目对于粘附因子有影响，在24小时内只转移2次沙门氏菌株，第一次在菌株处于冰冻状态时转移。所有培养物进行有氧的培养。

双歧杆菌：

双歧杆菌菌株(长双歧杆菌CNCM I-2169(Bl28/Ca1)和长双歧杆菌CNCMI-2170(BL29/F9)在-20℃贮存在含有15％甘油的MRS培养基中。在抑制性能检测之前这些菌株在无氧条件下在MRS中生长并以24小时的间隔转移到新培养基中两次。用于检测的浓度是2×10⁹cfu/ml。通过以20,000rpm的转速离心分离1小时获得上清液，然后检测存在的细菌。双裂菌菌株在MRS37℃无氧培养18小时。然后离心分离(4℃，20分钟)这些培养基，收集上清液，冻干，转变成溶液然后离心分离10次(10×)。上清液的pH值最后调节到4.5。

E大肠杆菌C1845：

在解冻后第一次传代在CFA-Muller Hinton琼脂上进行，这种琼脂适合于完成细菌粘附因子表达。在每一次试验前，在每24个小时转移到新的培养基细菌细胞在37℃培养。

克雷伯氏杆菌：

在37℃条件下细菌在Luria肉汤中过夜培养18小时。

耶尔森氏杆菌：

在37℃条件下细菌在Luria肉汤中过夜培养18小时。

铜绿假单胞菌：

在37℃条件下细菌在Luria肉汤中过夜培养18小时。

幽门螺杆菌

细菌在含有0.25％的酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，MI)，10％的马血清和0.4％的Campylobacter选择性补充剂(Skirrow supplement，SR69；Oxoid Ltd，Basingstoke，England).的脑-心-浸液(BHI)-琼脂板中培养。

实施例4

Bl288Ca1和BL29/F9对T₈₄和Caco-2细胞的粘附

在玻璃盖玻片上制备的Cac)-2和T84单层用磷酸盐缓冲剂(PBS)洗涤两次，所说的玻璃盖玻片放在6孔Corning组织培养皿中(Corning Glass Works，Corning，NY)。将双歧杆菌(1ml，4×10⁸细菌/ml spent培养基上清液，处理上清液或新鲜的MRS肉汤)加入1ml的这种细胞培养基中。这种上清液(2ml)加入每个组织培养基皿的孔中并将其在37℃ 10％CO2/90％的空气中培养。在培养1小时后，这种单层用灭菌PBS洗涤5次，用甲醇固化，用革兰氏染色剂染色，用显微镜进行检测。每一次粘附检测连续进行三次肠细胞的重复试验。对于每一个玻璃盖上的单层在20个任意的显微区域评估粘附细菌的数目。为了排除人为因素，由两个不同的技术人员评估粘附。

试验结果如图1所示，很明显Bl28/Ca1和BL29/F9都有粘附在肠细胞的能力并可以和已知的细胞系GG(WO97/00078)或La1(EP 0 577 903)相比。

实施例5

双歧杆菌的抗病活性

选用了病原性细菌大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌。

细菌(Bl28/Ca1或BL29/F9)的培养基在MRS培养基总保持18小时，产生指数增长的培养物(37℃3小时)。取出2ml溶液在4℃5500g离心分离5分钟。在收集上清液后，沉淀用灭菌PBS洗涤。在离心分离后，收集沉淀加入2ml无菌PBS。计数细菌并按照浓度在1到5×10⁶之间细菌/ml制成悬浮液。

按照Lehrer等J.Imunol.Methods 137(1991)，167-173描述的Lehrer法对本发明的双歧杆菌的抗菌的作用进行了检验，这项方法的文件请见参考文献。检验结果如图2和图3所示。

从上述试验结果可以看出本发明的双歧杆菌可以有效的抑制各种病原细菌的生长。

实施例6

抑制沙门氏菌的检验

沙门氏菌是一种侵入表皮细胞并在那里大量繁殖的细菌。为了测定本发明双歧杆菌的抑制鼠沙门氏菌的能力，采用了菌株SL1344和如下的方法。

在LB-培养基中培养病原细胞。在第二次传代到新的培养基之后，采用10μCi/ml放射性同位素C¹⁴-醋酸盐在LB-培养基中标记细菌菌株。在该培养基中在37℃培养18小时。

随后离心分离(1041rpm，15分钟)细菌悬浮液，从上清液中去除残余的C¹⁴-醋酸盐。将沉淀在PBS中悬浮并洗涤，这些细胞以大约10⁸细胞/ml的浓度在1％的灭菌甘露糖溶液中悬浮。甘露糖抑制非特异性粘附。然后将细菌溶液调整到2×10⁸细胞/毫升。

在37℃将病原菌(1ml；2×10⁸细胞)和一部分(1ml)双歧杆菌培养基的上清液预培养2小时。然后离心分离悬浮液，去除得到的上清液，将沉淀在0.5ml的PBS中再一次悬浮。随后将病原菌溶液(0.5ml)和人类肠细胞在培养物中接触。培养物用灭菌PBS洗涤两次并加入0.5ml粘附培养基(DMEM)。然后在37℃在10％CO2条件下培养这些细胞1小时。

在培养后，计算培养基中和在肠细胞上/内的细菌数目。为了测定粘附在细胞上的量或侵入肠细胞的量，采用了如下方法。

为了测量粘附细菌的数目，轻轻倒出培养基，用培养基介质洗涤一次，用灭菌PBS洗涤一次。随后，每个间隔加入1ml灭菌水，溶胞细胞并形成细胞溶液，在37℃培养1-2小时，然后连续稀释。为了计数粘附和侵入的细菌数目，离心分离细胞溶液去除细胞碎片然后测量放射性。

按照另一个方案，将10等分试样加在TSA培养基上。然后在37℃培养18-24小时。

为了测量侵入细菌的量，Caco-2细胞用PBS洗涤以去除所有的没有粘附的细胞。随后，加入含有庆大霉素(20μg/ml)的培养基并在37℃连续培养1小时。庆大霉素是一种抗生素但不进入肠细胞，于是所有的细胞外的微生物都被杀死，而已经侵入肠细胞的细菌将存活。这些细胞然后在37℃再培养一个小时并用PBS洗涤两次。在37℃通过加入灭菌蒸馏水和培养，来溶胞这些细胞。在去除了细胞碎片后，测量放射性。按照另一个方案采用TSA培养基连续稀释。在37℃培养18-24小时。

可以看出培养的细胞和培养物上清液对于防止沙门氏菌的粘附和侵入肠细胞具有极其有效的作用。

实施例7

鼠沙门氏菌C5菌株感染小鼠

成年、7-8周大的无菌雌性小鼠(C3H/He/oujco conventional，Iffa Credo，France)，在无菌条件下饲养，用固定浓度的鼠沙门氏菌(0.2ml，108cfu/每只小鼠)通过口服感染。一些小鼠植入双歧杆菌从而成为单主寄生物。将这些小鼠的肠子片段用PBS洗涤并切碎，计算双歧杆菌的数目。另一些小鼠保持在无菌环境中，和对照组的小鼠的存活天数进行比较。

结果如图5所示，正如所推测的，对照组几乎所有的小鼠在大约10天左右死掉。与此对比，用BL29/F9处理的所有的小鼠都活过10天，只有20％的小鼠在30天以后被沙门氏菌致死。

这些试验结果表明本发明的双歧杆菌有极其有效的上述性能。

Claims (8)

1.能够预防引起腹泻的细菌在肠内建群的长双歧杆菌CNCM I-2169或长双歧杆菌CNCM I-2170的培养物上清液在制备可吸收的载体物质中的应用。

2.双歧杆菌在制备可吸收的载体物质中的应用，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌CNCM 1-2169或长双歧杆菌CNCM 1-2170。

3.权利要求2的应用，其中的双歧杆菌在载体物质中的含量为10⁵cfu/g到10¹²cfu/g载体物质。

4.权利要求1到3中任一权利要求的应用，其中所使用的载体物质是一种食物组合物，选自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、发酵奶、奶基发酵产品、冰激凌、谷类发酵产品、奶粉、婴儿食品、宠物食品或片剂、液体细菌悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂、干的管饲、湿的管饲或宠物食品。

5.权利要求1到3中任一权利要求的应用，其中的载体物质用于治疗和/或预防腹泻相关的失调。

6.能够防止引起腹泻的细菌建群的双歧杆菌，它是长双歧杆菌CNCM 1-2169或长双歧杆菌CNCM 1-2170。

7.含有至少一种权利要求6的双歧杆菌的食物或药物组合物。

8.权利要求7的组合物，选自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、发酵奶、奶基发酵产品、冰激凌、谷类发酵产品、奶粉、婴儿食品、宠物食品，片剂、液体细菌悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂、干的管饲、湿的管饲。

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