ES2321797T3 - Bifidobacterias que previenen la diarrea causada por bacterias patogenicas. - Google Patents

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Abstract

Bifidobacterium capaz de prevenir la colonización de bacterias causantes de diarrea, que es Bifidobacterium longum CNCM I-2170 (BL29/F9).

Description

Bifidobacterias que previenen la diarrea causada por bacterias patogénicas.
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El presente invento se refiere a nuevos microorganismos del género bifidobacterium, que son útiles en la prevención de diarrea producida por bacterías patogénicas. En particular el presente invento se refiere al uso de dichos microorganismos para la preparación de un soporte ingerible y a una composición de lo contiene.
Se conoce desde hace tiempo organismos que producen ácido láctico como un componente metabólico principal. Estas bacterias pueden hallarse en leche o en factorías que procesan leche, respectivamente, plantas vivas o en descomposición así como también en el intestino del hombre y animales. Estos microorganismos, resumidos bajo el término "bacterias de ácido láctico", representan un grupo no homogéneo y comprenden, por ejemplo, el género Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus, etc.
Las bacterias de ácido láctico se han utilizado como agentes de fermentación para la conservación de alimentos tomando beneficio de un bajo pH y la acción de productos de fermentación generados durante su actividad fermentativa para inhibir el crecimiento de bacterias de descomposición. En adición se han utilizado bacterias de ácido láctico para la preparación de una variedad de diferentes alimentos tal como queso, yogur y otros productos lácteos fermentados de la leche.
Muy recientemente las bacterias de ácido láctico han atraído mucha atención por cuanto que se ha encontrado que algunas cepas que exhiben valiosas propiedades para el hombre y animales con la ingestión. En particular, cepas específicas del género Lactobacillus o Bifidobacterium se ha encontrado que son aptas para colonizar la mucosa intestinal. Su mantenimiento temporal o sostenido en el intestino se ha asumido que tiene numerosos efectos positivos sobre la salud de los seres a los que se incorporan.
A este respecto, la EP 0 768 375 describe cepas específicas del género Bifidobacterium, que son aptas para implantarse en la flora intestinal y pueden adherirse a células intestinales. Estas Bifidobacterias se informa que asisten en la inmunomodulación, siendo aptas para excluir competitivamente la adhesión de bacterias patogénicas a células intestinales, asistiendo de este modo al mantenimiento de la salud de los individuos.
Adicionalmente, Bernet et al. ("Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions". Appl Environ Microbiol. 1993; 59(12):4121-8) describe bacterias de ácido láctico (B.longum strain CNCM I-1228) que tienen la capacidad para implantarse en la flora intestinal vía adherencia in-vitro a células Caco-2 y la capacidad para la exclusión competitiva de bacterias patogénicas de células intestinales.
Asimismo Fujiwara et al. ("Purification and characterization of a novel protein produced by Bifidobacterium longum SBT2928 that inhibits the binding of enterotoxigenic Escherichia coli Pb176 (CFA/II) to gangliotetraosylceramide." J Appl Microbiol. 1999; 86: 615-21) han investigado Bifidobacterias. Los autores aislaron una proteína secretada por B. longum que está implicada en la inhibición de unión de E. coli patogénico al tracto gastrointestinal.
Durante los últimos pocos años se ha enfocado la investigación sobre el uso potencial de bacterías de ácido láctico como agentes probióticos. Los probióticos se consideran preparados microbianos viables que promueven la salud del individuo preservando la microflora natural en el intestino. Un preparado microbiano puede aceptarse comunmente como un probiótico en caso que de sus microbios efectuales y su modo de acción sean conocidos. Los probióticos se considera que se adhieren a la mucosa intestinal, colonizan el tracto intestinal y asimismo previenen la adherencia de microorganismos dañinos en este. Un requisito previo crucial para su acción reside en que estos deben de llegar a la mucosa del intestino en una forma apropiada y viable y no ser destruidos en la parte superior del tracto gastrointestinal, especialmente por la influencia del bajo pH que prevalece en el estómago.
A este respecto, la WO 97/00078 describe una cepa específica, denominada Lactobacillus GG (ATCC 53103), como un probiótico de esta índole. El microorganismo se utiliza particularmente en un método para prevenir o tratar reacciones de hipersensibilidad inducidas por alimentos por cuanto se administra a un receptor junto con un material alimenticio que se ha sometido a un tratamiento de hidrólisis con pepsina y/o tripsina. La cepa de Lactobacillus elegida se describe como exhibiendo propiedades adhesivas y de colonización y mostrando un sistema de proteasa enzima, de modo que el material proteínico contenido en el alimento que ha de administrarse se hidroliza adicionalmente por medio de proteasas secretadas por la cepa Lactobacillus específica. El método expuesto en este documento deberá resultar eventualmente en la absorción de material proteínico por el intestino que ya no muestre una cantidad sustancial de material alergénico.
Adicionalmente, en la EP 0 577 903 se hace referencia al uso de bacterias de ácido láctico de esta índole que tienen la capacidad de sustituir el Heliobacter pylori, la causa reconocida del desarrollo de úlcera, en la preparación de un soporte destinado para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una úlcera asociada con la acción de Heliobacter pylori.
En vista de las propiedades valiosas que pueden proporcionar cepas particulares de bacterias de ácido láctico, existe un deseo en el arte de cepas de bacterias de ácido láctico adicionales que sean beneficiosas para el bienestar del hombre y/o animal.
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Por consiguiente, un problema del presente invento es proporcionar cepas de bacterias adicionales que exhiban nuevas propiedades beneficiosas para el hombre y/o animales, tal como animales domésticos.
El problema anterior se ha resuelto proporcionando nuevos microorganismos pertenecientes al género Bifidobacterium que tienen la capacidad de prevenir la colonización del intestino con bacterias patogénicas que causen diarrea y utilizándolos para la preparación de un material de soporte ingerible.
El Bifidobacterium es Bifidobacterium longum CNCM-2170.
Los microorganismos del presente invento han demostrado exhibir entre otras las propiedades siguientes: son gram positivos, catalasa negativa y producción negativa de CO_{2}, producen ácido láctico L(+) y pueden prevenir esencialmente la colonización de células intestinales mediante bacterias que producen diarrea, tal como E. coli patogénico, por ejemplo E. coli enteropatogénico (EPEC), o salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium.
Los nuevos microorganismos pueden utilizarse para la preparación de una variedad de materiales de soporte ingeribles, tal como, por ejemplo, leche, yogur, requesón, leches fermentadas, leche a base de productos fermentados, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, fórmulas para lactantes y alimentos para animales domésticos y pueden incluirse en el soporte en una cantidad de alrededor de 10^{5} cfu/g a alrededor de 10^{11} cfu/g. Para la finalidad del presente invento la abreviación cfu debe designar una "unidad formadora de colonias" que se define como número de células bacterianas según lo revela cuentas microbiológicas sobre placas de agar.
El presente invento proporciona también un alimento o una composición farmacéutica que contiene las Bifidobacterias antes citadas.
Para la preparación de una composición alimenticia de conformidad con el presente invento las Bifidobacteras del presente invento se incorporan a un soporte apropiado, en una cantidad de alrededor de 10^{5} cfu/g a alrededor de 10^{12} cfu/g, de preferencia de alrededor de 10^{6} cfu/g a alrededor de 10^{10} cfu/g, mas preferentemente de alrededor de
10^{7} cfu/g a alrededor de 10^{9} cfu/g.
En el caso de un preparado farmacéutico el producto puede prepararse en forma de comprimidos, suspensiones de bacterias líquidas, suplementos orales secados, suplementos orales húmedos, alimentación por sonda seca o una alimentación por sonda húmeda estando la cantidad de Bifidobacterium/Bifidobacterias que ha de incorporarse en la gama de hasta alrededor de 10^{12} cfu/g, de preferencia de alrededor de 10^{7} cfu/g a alrededor de 10^{11} cfu/g, mas preferentemente de alrededor de 10^{7} cfu/g a alrededor de 10^{10} cfu/g.
La actividad de los nuevos microorganismos en el intestino de los individuos es evidentemente dependiente de la dosis. O sea, contra mas nuevos microorganismos se incorporan por medio de la ingesta del material alimenticio antes indicado o la composición farmacéutica mayor es la actividad protectora y/o curativa de los microorganismos. Debido a que los nuevos microorganismos no son perjudiciales para el género humano y animales y se han aislado eventualmente de heces de lactantes puede incorporarse una alta cantidad de estos de modo que esencialmente se colonice una alta proporción del intestino del individuo por los nuevos microorganismos.
En las figuras,
La figura 1 muestra una gráfica, indicando la capacidad de las líneas de células CNCM I-2169, que no forman parte del presente invento, (denominadas B128/Cal) y Bifidobacterium longum CNCM I-2170 (denominado BL29/F9) para adherirse a las células intestinales humanas en cultivo.
La figura 2 muestra la sensibilidad patogénica de bacterias patogénicas frente a Bifidobacterium longum CNCM I-2170 (BL29/F9).
La figura 3 muestra la sensibilidad patogénica de bacterias patogénicas frente a Bifidobacterium longum CNCM I-2169 (B128/Cal), que no forma parte del presente invento.
La figura 4 muestra la actividad de líneas de células B128/Cal, que no forman parte del presente invento y BL29/F9 frente a S. typhimurium SL 1344 que infecta células Caco-2.
La figura 5 muestra el ratio de supervivencia de ratones infectados con Salmonella typhimurium SL 1344 y tratados con el Bidifidobacterium BL29/F9.
Durante los estudios extensivos que conducen al presente invento los inventores han investigado heces de lactantes y aislado de estas una variedad de diferentes cepas bacterianas. Estas cepas se examinaron a continuación respecto de su capacidad para prevenir la colonización y/o invasión de células epiteliales con bacterias que se sabe producen diarrea, tal como E. coli, Sigella, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa, Listeria, Streptococcus, Staphilococcus, Clostridium difficile, H. pyori y también Candida albicans.
Se examinaron diversos géneros de bacterias comprendiendo Bifidobacterium, Lactococcus y Streptococcus respecto de sus propiedades inhibidoras de diarrea. Las pruebas para la propiedad inhibidora se llevaron a cabo con microorganismos patogénicos, tal como E.coli, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa, H. pyori y Salmonella typhimurium como representativos de microorganismos patogénicos causantes de diarrea en individuos afectados.
Las diversas bacterias se desarrollaron en un medio apropiado, tal como MRS, Hugo-Jago o medio M17 a temperaturas comprendidas entre alrededor de 30 y 40ºC correspondiente a su temperatura de crecimiento óptima. Después de alcanzar el crecimiento estacionario las bacterias se recogieron para centrifugación y resuspendieron en solución fisiológica de NaCl. Entre las diferentes pruebas las células bacterinas se almacenaron congeladas (-20ºC).
Para determinar propiedades anti-bacterianas de eligieron los métodos siguientes.
De conformidad con un protocolo de Bifidobacterias cultivadas del presente invento se examinó su capacidad para disminuir la viabilidad de los diferentes microorganismos patogénicos. Para este fin se puso en contacto un cultivo de bacterias patogénicas con un sobrenadante concentrado de un cultivo de Bifidobacterium y se determinó el potencial de crecimiento de las bacterias patogénicas.
De conformidad con un segundo protocolo se determinó la capacidad de adhesión de las Bifidobacterias del presente invento a células T_{84}, un modelo de cultivo de células para el intestino. Para este fin se cultivaron las Bifidobacterias con células T_{84} y se determinó el ratio de adhesión.
De conformidad con otro protocolo se determinó el potencial de las Bifidobacterias del presente invento para prevenir la infección de células intestinales por Salmonella, utilizando la línea celular Caco-2 como un modelo para el intestino. A este respecto se adicionó el sobrenadante de un cultivo de células de las Bifidobacterias del presente invento junto con el microorganismo patogénico a las células intestinales y se determinó el ratio de adhesión, o invasión, respectivamente.
Así pues, pudo demostrarse que las Bifidobacterias cultivadas probaron ser extremadamente efectivas en la prevención de adhesión a, e invasión en, las células intestinales indicando que compuestos metabólicos secretados por los nuevos microorganismos son probablemente los responsables de la actividad anti-diarrea.
El presente invento se describirá ahora por medio de ejemplos sin que supongan limitación del mismo.
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Medio y soluciones MRS (Difco)
Hugo-Jago (triptona 30 g/l (Difco), extracto de levadura 10 g/l (Difco), lactosa 5 g/l (Difco), KH_{2}PO_{4} 6 g/l, extracto vacuno 2 g/l (Difco), agar 2 g/l (Difco))
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M17 (Difco)
Eugon Tomato Agar (jugo de tomate en lata 400 ml, Eugon agar BBL 45.5 g, Maltosa Difco 10 g, Hemin Sigma 5 mg, Agar Difco 5 g, agua destilada 600 ml) DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco)
CFA (según Ghosh et al. Journal of Clinical Microbiology, 1993 31 2163-6) Müller Hinton agar (Oxoid)
LB (Luria Bertami, Maniatis, A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor, 1992)
C^{14}-acetato (53,4 Ci/mMol, Amersham International PLC)
PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na_{2}HPO_{4} 1.15 g/l, KH_{2}PO_{4} 0,2 g/l))
Solución de tripsina-EDTA (Seromed)
Suero vacuno fetal FCS (Gibco)
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Se obtuvo E. coli DAEC C 1845 de Washington University, Seattle y se obtuvo E. coli JPN15 del Center for Vaccine Development of the University of Maryland, USA).
Se obtuvo la cepa de Salmonella typhimurium SL1344 del Departament of Microbiology, Stanford University, CA, USA. Esta cepa actúa como un patógeno sobre ratones y es resistente a la estreptomicina. Se adhiere a células de colon Caco-2 (Finlay y Falkow, 1990).
La Klebsiella se obtuvo de aislados clínicos de stock del laboratorio de microbiología de la Faculté de Pharmacie Paris XI, Châtenay-Malabry, France.
La Yersinia se obtuvo de INSERM Unit 411, Hôpital Necker, Paris, France.
La Pseudomonas aeruginosa se obtuvo de aislados clínicos de stock del laboratorio de microbiológico de la Faculté de Pharmacie Paris XI, Châtenay-Malabry, France.
El H. pylori se obtuvo del Institute of Microbiology, Lausanne University, Lausanne, Suiza.
Ejemplo 1
Aislamiento de Bifidobacterias
Se cosecharon heces frescas de pañales de 16 lactantes sanos de 15 a 27 días de edad. Se dispuso 1 g de heces frescas bajo condiciones anaeróbicas para transporte al laboratorio y se llevaron a cabo análisis microbiológicos dentro de 2 horas a partir de muestreo mediante diluciones en serie en solución Ringer y vertido en placas sobre medios selectivos. Se utilizó Eugon Tomato Agar (jugo de tomate enlatado 400 ml, Eugon agar BBL 45,5 g, Maltosa Difco 10 g, Hemin Sigma 5 mg, Agar Difco 5 g, agua destilada 600 ml) incubado anaeróbicamente a 37ºC durante 48 horas para aislar bifidobacterias. Las colonias se recogieron de forma aleatoria y se purificaron. Sobre los aislados se llevó a cabo caracterización fisiológica y genética.
Ejemplo 2
Cultivo de líneas celulares Células Caco-2
Para la inhibición se utilizaron ensayos de línea celular Caco-2 como un modelo de enterocitos maduros del intestino delgado. Esta línea celular presenta característica de células intestinales tal como, por ejemplo, polarización, expresión de enzimas intestinales, producción de polipéptidos estructurales particulares, etc. Las células se desarrollaron sobre diferentes soportes, o sea sobre bandejas de plástico (25 cm^{2}, Corning) para crecimiento y propagación, sobre placas de vidrio de 6 pocillos desengrasadas y esterizadas (22 x 22 mm, Corning) para las pruebas de adhesión e inhibición. Después del segundo día de cultivo se cambió el medio (DMEM) sobre una base diaria. Antes del uso el medio fue suplementado con 100 U/ml de penicilina/streptomicina, 1 \mug/ml de anfoterina, FCS inactivado al 20% a 56ºC durante 30 minutos y 1% de una solución conteniendo aminoácidos no esenciales (10 mM)(Eurobio, Paris, Francia). El cultivo se llevó a cabo a 37ºC en una atmósfera que comprende 90% de aire y 10% de CO_{2}. Las células se dividieron cada seis días. Las células se desprendieron de las paredes del pocillo mediante tratamiento en PBS con tripsina al 0,015% y 3M de EDTA a pH 7,2. Para neutralizar el efecto de la tripsina se adicionó a la suspensión de células obtenida un volumen igual de medio de cultivo conteniendo FCS, se centrifugó la mezcla (10 min a 1000 rpm) y la pella se disolvió de nuevo en medio de cultivo. Se contaron las células vivientes (no teñidas con azul tripano). Se transfirieron alrededor de 3,5 x 10^{5} de células vivientes a una nueva botella de cultivo y alrededor de 1,4 x 10^{5} células por pocillo y se cultivaron hasta obtener monocapa confluente.
Células T_{84}
Para los ensayos de adhesión se utilizó la línea celular T_{84} como un modelo de células de colon del intestino. Esta línea celular presenta características de células intestinales tal como, por ejemplo, polarización, expresión de enzimas intestinales, producción de polipéptidos estructurales particulares, etc.. Las células T_{84} se obtuvieron de la University of California, San Diego, CA. Las células se desarrollaron en DMEM (50%) y Ham's F12 (50%) suplementado con 2 mM de glutamina, 50 mM de HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales y 10% de suero vacuno fetal inactivado (30 min, 56ºC) (Boehringer, Mannheim, Alemania) a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%/aire atmosférico al 90%. Las células se sembraron a una concentración de 10^{6} células por cm^{2}. Las células se utilizaron para ensayos de adherencia a post-confluencia tardía, o sea, después de 10 días.
Todas las cepas excepto las Bifidobacterias se mantuvieron a -80ºC en su medio de cultivo conteniendo 15% de glicerol. Debido a que el número de transferencias al nuevo medio tiene una influencia sobre los factores de adhesión, la cepa Salmonella se transfirió solo dos veces dentro de un período de 24 horas, teniendo lugar la primera transferencia cuando se congeló la cepa. Todos los cultivos se realizaron aeróbicamente.
Las cepas bacterianas (Bifidobacterium longum CNCM I-2169 (Bl28/Cal), que no forman parte del presente invento, y Biifidobacterium longum CNCM I-2170 (BL29/F9) se almacenaron a -20ºC en medio MRS conteniendo glicerol al 15%. Las cepas se desarrollaron bajo condiciones anaeróbicas en MRS y se transfirieron dos veces a medio nuevo a intervalos de 24 horas antes de uso en los ensayos de inhibición. Para el ensayo se utilizó una concentración de 2 x 10^{9} cfu/ml. Se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 1 hora a 20.000 rpm y el sobrenadante obtenido se comprobó subsiguientemente respecto de la presencia de bacterias. Las cepas de Bifidobacterium se cultivaron anaeróbicamente en MRS durante 18 horas a 37ºC. Los cultivos se centrifugaron luego (20 minutos a 4ºC), se recogió el sobrenadante, liofilizó, devolvió a la solución y luego se concentró diez veces (10x). El pH del sobrenadante se ajustó finalmente a 4,5.
E. coli C 1845
El primer paso después de la descongelación se efectuó sobre un CFA - Müller Hinton agar, que es apropiado para efectuar expresión de factores de adhesión por el bacterium. Antes de cada experimento se incubaron las células bacterianas a 37ºC efectuándose una transferencia a un nuevo medio dos veces después de 24 horas cada una.
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Klebsiella
Se desarrollaron bacterias durante la noche en 18 horas a 37ºC en caldo Luria.
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Yersinia
Se desarrollaron bacterias durante la noche en 18 horas a 37ºC en caldo Luria.
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Pseudomonas aeruginosa
Se desarrollaron bacterias durante la noche en 18 horas a 37ºC en caldo Luria.
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H. pylori
Se desarrollaron bacterias sobre placas Brain-Heart Infusion (BHI)-agar conteniendo extracto de levadura al 0,25% (Difco Laboratories, Detroit, MI), suero de caballo al 10% y complemento selectivo Campylobacter al 0,4% (suplemento Skirrow, SR 69; Oxoid Ltd, Basingstoke, Inglaterra).
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Ejemplo 4
Adhesión de B128/Cal y BL29/F9 a células T_{84} y Caco-2
Las monocapas de Caco-2 y T_{84}, preparadas sobre cubreobjetos de vidrio se dispusieron en placas de cultivo de tejido Corning de seis pocillos (Corning Glass Works, Corning, NY, se lavaron dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Se adicionaron Bifidobacterias (1 ml, 4x10^{8} bacterias/ml en sobrenadante de cultivo consumido, sobrenadante tratado o caldo MRS recién preparado) a 1 ml de medio de cultivo de línea celular. Esta suspensión (2 ml) se adicionó a cada pocillo de la placa de cultivo de tejido y la placa se incubó a 37ºC en CO_{2} al 10%/aire al 90%. Después de 1 hora de incubación se lavaron las monocapas cinco veces con PBS estéril, se fijaron con metanol, mancharon con tinción de Gram y se examinaron microscópicamente. Cada ensayo de adherencia se condujo por duplicado sobre tres pasadas sucesivas de células intestinales. Para cada monocapa sobre un cubreobjetos de vidrio se evaluó el número de bacterias adherentes en 20 áreas microscópicas aleatorias. La adhesión se evaluó por dos técnicos diferentes para eliminar error.
Los resultados se muestran en la figura 1 de la cual resulta obvio que ambas de Bl28/Cal y BL29/F9 son aptas para adherirse a células intestinales comparable a la línea celular conocida GG (WO/00078) o Lal (EP 0 577 903).
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Ejemplo 5
Actividad anti-patogénica de las Bifidobacterias
Se utilizó como candidatos para bacterias patogénicas E. coli, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa y H. pyori.
Basado sobre un cultivo de bacterias (Bl28/Cal o BL29/F9) mantenido en medio MRS durante 18 horas, se produjo un cultivo creciente de modo exponencial (3 horas a 37ºC). Se extrajeron 2 ml de esta solución y se centrifugaron durante 5 minutos a 5500 g, +4ºC. Después de la recogida del sobrenadante se lavó la pella celular en PBS estéril. Después de centrifugación se recogió la pella y se adicionaron 2 ml de PBS estéril. Se contaron las bacterias y se adaptó la suspensión de modo que se produjeron entre 1 y 5 x 10^{6} bacterias/ml.
La determinación del efecto antimicrobiano ejercido por las Bifidobacterias del presente invento se llevó a cabo de conformidad con el método Lehrer descrito en Lehrer et al., J. Inmunol. Métodos 137 (1991), 167-173, cuyo documento se incorpora aquí como referencia. Sus resultados se muestran en la figura 2 y 3.
A partir de los resultados anteriores puede verse que las Bifidobacterias del presente invento pueden inhibir de modo efectivo el crecimiento de varias bacterias patogénicas.
Ejemplo 6
Ensayo de inhibición para salmonella
La salmonella son bacterias que invaden células epiteliales y se multiplican en estas. Para determinar la actividad inhibidora de las Bifidobacterias del presente invento frente a Salmonella typhimurium se utilizó la cepa SL 1344 y el procedimiento siguiente.
Se cultivaron células patogénicas en medio LB. Después del segundo paso al nuevo medio se marcaron las cepas bacterianas con radioisotopos utilizando C^{14}-acetato a 10 \muCi/ml en medio LB. La incubación de las cepas en este medio se llevó a cabo durante 18 horas a 37ºC.
La suspensión bacteriana se sometió subsiguientemente a centrifugación (1041 rpm, 15 minutos) de modo que se elimine el C^{14}-acetato restante del sobrenadante. La pella se suspendió y se lavó en PBS y las células se suspendieron a una concentración de alrededor de 10^{8} células/ml en manosa estéril al 1%. Se conoce la manosa como inhibidora de adhesión no específica. Luego se ajustó la solución bacteriana a 2 x 10^{8} células/ml.
El patógeno (1 ml; 2 x 10^{8} células) y una parte alícuota de un sobrenadante (1 ml) de un cultivo de Bifidobacterium se pre-incubaron durante 2 horas a 37ºC. La suspensión se centrifugó subsiguientemente, se separó el sobrenadante resultante y la pella se suspendió de nuevo en 0,5 ml de PBS. Esta solución patógena (0,5 ml) se puso luego en contacto con células intestinales humanas en cultivo.
El cultivo se lavó con PBS estéril dos veces y se adicionó 0,5 ml de medio de adhesión (DMEM). Las células se incubaron luego durante 1 hora a 37ºC bajo CO_{2} al 10%.
Después de incubación se cuenta el número de bacterias en el medio de incubación y sobre/en las células intestinales. Con el fin de determinar la cantidad de células sobre, o que han invadido, las células intestinales se eligieron los métodos siguientes.
Para determinar el número de bacterias adherentes se decantó el medio y se lavaron las células una vez con medio de cultivo y una vez con PBS estéril. A continuación se adicionó 1 ml de H_{2}O estéril por compartimiento, para lisar las células y formar una solución celular que se incubó durante 1-2 horas a 37ºC, después de lo cual se llevaron a cabo diluciones sucesivas. Con el fin de contar el número de bacterias adherentes e invasivas se centrifugó la solución celular para separar desechos celulares y se midió la radioactividad.
De conformidad con otro protocolo se puso cada una de 10 partes alícuotas sobre medio TSA. Los medios se incubaron luego durante 18-24 horas a 37ºC.
Para determinar la cantidad de bacterias invadidas se lavaron las células Caco-2 con PBS de modo que se eliminasen todas las células no adheridas. A continuación se adicionó un medio conteniendo gentamicina (20 \mug/ml) y se prosiguió la incubación durante 1 hora a 37ºC. La gentamicina es un antibiótico que no penetra en las células intestinales de modo que se exterminan todos los microorganismos extracelulares, mientras que sobreviven las bacterias que ya han invadido las células intestinales. Luego se incubaron las células durante otra hora a 37ºC y se lavaron dos veces con PBS. Las células se lisaron con la adición de e incubación en agua destilada estéril durante 1-2 horas a 37ºC. Después de extraer los desechos celulares se determinó la radioactividad. De conformidad con otro protocolo se llevaron a cabo diluciones sucesivas, que se pusieron sobre medio TSA. Incubación: 18-24 horas a 37ºC.
Puede verse que las células cultivas y el sobrenadante del cultivo fueron extremadamente efectivos en prevenir la adhesión de e invasión en células intestinales por Salmonella.
Ejemplo 7
Infección de ratones por la cepa S.typhimurium C5
Ratones hembra, adultos, de 7-8 semanas de edad, axénicos (C3H/He/oujco convencional, Iffa Credo, Francia), criados bajo condiciones estériles, se infectaron oralmente con una concentración fijada de S. typhimurium (0,2 ml, 10^{8} cfu/ratón). Algunos ratones se convirtieron en monoxénicos mediante la implantación de una gama de cepas de Bifidobacterias. Con algunos ratones, se contaron las Bifidobacterias en segmentos del intestino después de su extracción y desmenuzado de los órganos en PBS. Con otros ratones la protección contra la infección se determinó de modo que estos se mantuvieron continuamente en un ambiente estéril y se compararon los días de supervivencia con el grupo de control.
Los resultados se muestran en la figura 5. Como puede derivarse de esta en el grupo control casi todos los ratones murieron después de un periodo de tiempo de unos 10 días. Por contra todos los ratones tratados con BL29/F9 estuvieron vivos después de 10 días, falleciendo solo el 20% por el efecto perjudicial ejercido por Salmonella después de un periodo de 30 días.
Estos resultados muestran las propiedades superiores extremas de las Bifidobacterias del presente invento.

Claims (7)

1. Bifidobacterium capaz de prevenir la colonización de bacterias causantes de diarrea, que es Bifidobacterium longum CNCM I-2170 (BL29/F9).
2. Uso de un Bifidobacterium capaz de prevenir la colonización del intestino por bacterias causantes de diarrea y que es Bifidobacterium longum CNCM I-2170 (BL29/F9), para la preparación de un material de soporte ingerible.
3. Uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el Bifidobacterium está contenido en el material de soporte en una cantidad de alrededor de 10^{5} cfu/g a alrededor de 10^{12} cfu/g de material de soporte.
4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en donde el material de soporte es una composición alimenticia elegida entre leche yogur, requeson, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, helados, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, fórmulas para lactantes, alimentos o tabletas para animales domésticos, suspensiones bacterianas líquidas, suplemento oral secado, suplemento oral húmedo, alimentación por sonda en seco, alimentación por sonda en húmedo o alimento para animales domésticos.
5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el material de soporte se utiliza para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con diarrea.
6. Alimento o composición farmacéutica que contiene dicho Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 1.
7. La composición, de conformidad con la reivindicación 6, que se elige entre leche, yogur, requesón, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, helados, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, fórmulas para lactantes, alimentos o tabletas para animales domésticos, suspensiones bacterianas líquidas, suplemento oral secado, suplemento oral húmedo, alimentación por sonda en seco, alimentación por sonda en húmedo.
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