ES2329800T3 - Aceitunas de mesa que contienen microorganismos probioticos. - Google Patents
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Abstract
Aceitunas de mesa que contienen lactobacilos adheridos sobre el pericarpo, seleccionados de Lactobacillus rhamnosus y L. paracasei y/o bifidobacterias adheridas sobre el pericarpo, seleccionadas de Bifidobacterium bifidum y B. longum, caracterizadas porque los lactobacilos están seleccionados de: Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103; L. rhamnosus IMPC 11; L. rhamnosus IMPC 19; Lactobacillus paracasei LMG P 22043; Lactobacillus paracasei IMPC 4.1, y porque las bifidobacterias están seleccionadas de Bifidobacterium bifidum ATCC 15696 y Bifidobacterium longum ATCC15708.
Description
Aceitunas de mesa que contienen microorganismos
probióticos.
La presente invención se refiere a productos
alimentarios probióticos, es decir, a productos alimentarios que
contienen microorganismos que tienen un efecto beneficioso sobre la
salud, en particular sobre el tracto gastrointes-
tinal.
tinal.
Los productos alimentarios probióticos son en
general alimentos fermentados que contienen una cantidad de
microorganismos activos y viables, lo suficientemente grande como
para llegar al intestino y ejercer una acción equilibrante en la
microflora intestinal.
La ingesta de probióticos estimula el
crecimiento de microorganismos beneficiosos, reduce la cantidad de
patógenos y refuerza las defensas naturales del organismo. Se
reconoce que las bacterias prebióticas, en particular los
lactobacilos y las bifidobacterias, ayudan a mantener el equilibrio
de la flora intestinal (Salminen S, et al., Int Dairy J,
8:563-572, 1998; Saarela M. L. et al., Int J
Food Microbiol 2002, 78:99-117), e inhiben a los
patógenos (Drago L., M. R. et al., FEMS Microbiol Letters,
1997, 153:455-463 y Cross M. L., FEMS Immunol Med
Microbiol 2002, 34:245-253), disminuyendo así el
riesgo de enfermedades gastrointestinales. De hecho, cuando se
altera la microflora intestinal, la administración de bacterias
prebióticas no solo restablece el equilibrio normal, sino que
también mejora el balance microbiano y las propiedades de la flora
endógena. El papel de los probióticos en la prevención de las
alergias e intolerancias alimentarias está también bajo estudio
(Isolauri E., et al., Am J Clin Nutr 2001, 73 (suppl):
444s-450s; Jahreis G., et al., Food Res Int
2002, 35:133-138).
Las bacterias prebióticas se introducen en
productos alimentarios para nutrición humana, especialmente en
leche fermentada, por ejemplo en yogurt. Uno de los problemas
relacionado con la producción de alimentos probióticos es la
influencia de las tecnologías de producción sobre las propiedades de
las cepas, en particular la viabilidad celular, integridad y
estabilidad de la población (Mattila - Sundholm T., et al.,
Int Dairy, 2002 J. 12:173-182). Los cultivos
líquidos y congelados se han utilizado ampliamente en el pasado,
pero sus costes de producción, transporte y almacenamiento eran
elevados. Los cultivos liofilizados se utilizan de forma
generalizada en el momento actual, pero las células frecuentemente
son dañadas y no pueden almacenarse durante largo tiempo. De hecho,
las células liofilizadas sobreviven en anaerobiosis y la viabilidad
se restaura mediante rehidratación. Este tratamiento no solo no
asegura la supervivencia de todas las células, sino que además las
que sobreviven pueden también alterarse metabólicamente, y no
aguantan la acidez gástrica. Los cultivos celulares monodosis
concentrados también se utilizan de forma generalizada. En este
caso, la mayor dificultad es alcanzar altas concentraciones
celulares, es decir, alrededor de alrededor de 10^{10} (UCF)/g. De
este modo, la mayoría de los probióticos disponibles actualmente
son de origen animal, en particular productos lácteos, tales como
yogurt, queso, postres, helados. Sin embargo, el consumo de
productos lácteos puede estar limitado por alergias o intolerancias
a la leche y a sus derivados. También se conoce la dificultad de
introducir bifidobacterias - ampliamente utilizadas en probióticos
en productos de leche fermentada, debido a su sensibilidad a la
leche relacionada con la cepa - bacterias fermentadoras, pH,
temperatura y concentración de oxígeno (Gobbetti M., et al.,
J Dairy She 1998, 81:37-47).
Se han obtenido frutas prebióticas deshidratadas
en una escala experimental, mediante secado al vacío de las frutas
empapadas en microorganismos probióticos (Betoret N., et al.,
J Food Engin 2003, 56:273-277), mientras que
algunos productos basados en salvado y zumos de frutas que contienen
bacterias prebióticas están ya disponibles en el mercado (Johansson
et al., Int J Food Microbiol, 1998,
42:29-38).
También debe resaltarse que los productos
previamente mencionados deben consumirse rápidamente una vez
abiertos.
Con respecto a los vegetales, se sabe que se ha
aislado Lactobacillus paracasei de aceitunas (Van Den Berg
DJC, et al., "Isolation, screening and identification of
lacto acid bacteria from tradicional food fermentation processes
and culture collections", Food Biotechnology, vol 7, nº 3, 1993,
páginas 189-205). También se conoce, del Documento
WO00/60948, un procedimiento para fermentar productos vegetales,
aplicable a todas las variedades posibles de aceitunas, incluyendo
una etapa adicional de inocular la salmuera en la que se preparan
las aceitunas, con un cultivo del microorganismo Lactobacillus
plantarum, LP RJL1, que produce una bacterioquina denominada
plantaricina S y, del Documento WO 02/05695 A, un método para
fermentar productos vegetales, aplicable a pepinillos, zanahorias y
todas las variedades posibles de aceitunas, que incluye la
inoculación de la salmuera en la que se colocan los productos
vegetales, con una mezcla de cultivo que contiene dos
microorganismos: Lactobacillus plantarum, LP RJL2, y
Lactobacillus plantarum LP RJL3.
De esta forma, podría ser ventajoso proporcionar
productos alimentarios, en particular aceitunas, que permitan
administrar bacterias prebióticas sin producir alergias o
intolerancias y que puedan almacenarse durante largo tiempo después
de abrirlos.
La presente invención, está definida en las
reivindicaciones, y se refiere a productos alimentarios probióticos
basados en aceitunas de mesa que contienen bacterias
probióticas.
En una primera realización, el producto
alimentario consiste en aceitunas de mesa cuyo pericarpo está
recubierto con microorganismos de los géneros Lactobacillus
y Bifidobacterium, en particular lactobacilos y
bífidobacterias probióticos. Preferiblemente, los lactobacilos se
seleccionan de Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus
paracasei, mientras que las bífidobacterias se seleccionan de
Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium longum.
Todavía más preferiblemente, los microorganismos se seleccionan de:
Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103; L. rhamnosus
IMPC 11; L. rhamnosus IMPC 19; Lactobacillus paracasei
IMPC 2.1 (depositado con la Colección de Microorganismos Coordinada
Belga (Belgian Coordinated Collections of Microorganism),
BCCM/LMG-Collection, Gante, Bélgica, bajo el número
de acceso LMG P-22043); Lactobacillus
paracasei IMPC 4.1; Bifidobacterium bifidum ATCC15696 y
Bifidobacterium longum ATCC15708.
Las aceitunas de la invención pueden prepararse
manteniendo aceitunas de mesa en una suspensión del microorganismo
deseado, a temperatura ambiente (alrededor de 25ºC), obteniendo así
aceitunas en cuyo pericarpo se adhieren los microorganismos en
cantidades que varían desde 5 x 10^{5} hasta 5 x 10^{8}
UFC/gramo (evaluación después de 3 meses de almacenamiento, véase
tablas 1 y 2).
Las aceitunas de mesa de la invención pueden
consumirse como tales, o utilizadas para la preparación de productos
alimentarios probióticos, que son otras realizaciones más de la
invención.
Las aceitunas y productos probióticos de la
invención son medios efectivos para tratar o prevenir enfermedades
intestinales, o restaurar la flora intestinal después de tratamiento
con antibióticos.
Particularmente beneficiosas son las aceitunas
enriquecidas con L. paracasei IMPC 2.1, no solo debido a las
marcadas características prebióticas de este microorganismo, su
capacidad de crecer tanto en condiciones aerobias como anaerobias,
y de adherirse a la superficie, sino también debido a su resistencia
a los jugos gástricos y sales biliares. El L. paracasei IMPC
2.1 es un microorganismo nuevo y es una realización más de la
invención.
También es particularmente importante la
posibilidad de incorporar bifidobacterias, ya que se sabe que estos
microorganismos difícilmente crecen y sobreviven en productos
lácteos fermentados.
Las aceitunas de la presente invención y los
productos alimentarios que las contienen, son particularmente
útiles para la prevención y el tratamiento de enfermedades causadas
por contaminantes de los alimentos, en enfermedades
gastro-intestinales que afectan a los viajeros, como
coadyuvantes en tratamiento antibiótico y, más generalmente, en
situaciones en los que es necesario aumentar las defensas inmunes
del organismo.
Gracias a su conveniente administración,
almacenamiento en condiciones no refrigeradas (después de 90 días a
temperatura ambiente, el número de bacterias varía entre 1 x
10^{5} y 7,6 x 10^{7} UFC por gramo), así como a sus
características organolépticas, las aceitunas pueden consumirse
siempre que se requiera una administración rápida de bacterias
prebióticas, incluso por personas intolerantes a la lactosa. Una
ventaja más es que el consumo de solo una parte del contenido del
paquete (es decir, aceitunas, no salmuera), proporciona una dosis
de bacterias prebióticas que corresponde a la proporcionada por el
yogurt o los cultivos concentrados.
Finalmente, también debe resaltarse que, con
respecto a los alimentos probióticos de origen animal o vegetal, en
los que los microorganismos son resuspendidos en un medio líquido,
en el caso de las aceitunas, las células bacterianas están
inmovilizadas, lo que asegura un transporte efectivo y seguro en el
tracto gastro-intestinal. Además, la unión a un
producto que contiene una gran cantidad de grasas, permite a los
microorganismos resistir los jugos
gástricos.
gástricos.
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Ejemplo
1
Se ha evaluado la colonización del pericarpo de
las aceitunas de mesa y la supervivencia de las siguientes cepas:
Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103, L. rhamnosus
IMPC 11 e IMPC 19, Lactobacillus paracasei IMPC 2.1 e IMPC
4.1, Bifidobacterium bifidum ATCC15696 y Bifidobacterium
longum ATCC15708.
El Lactobacillus paracasei IMPC 2.1 se
depositó con la Colección de Microorganismos Coordinado Belga
(Belgian Coordinated Collections of Microorganism),
BCCM/LMG-Collection, Gante, Bélgica, con el número
de acceso LMG P-22043.
Los ensayos se llevaron a cabo con aceitunas
negras machacadas y enteras, a las que previamente se había
eliminado el amargor y habían sido procesadas como para hacerlas
comestibles. Los mismos ensayos también se llevaron a cabo con
aceitunas verdes y negras frescas o semi-preparadas,
y con aceitunas verdes, a las que previamente se había eliminado el
amargor y habían sido procesadas (producto terminado). Se evaluó la
viabilidad de las cepas utilizando jarras que contenían 80
aceitunas sumergidas en 280 ml de su propia salmuera, o en ClNa al
4% \pm fructosa al 0,2+1%, pH 6,5.
Procedimiento. A las aceitunas negras
sumergidas en su propia salmuera (producto final), se les añadió
una suspensión de bacterias que contenía desde 4 x 10^{9} hasta 9
x 10^{11} (UFC) de cada cepa. Después del inóculo, las aceitunas
se colocaron en jarras estériles cerradas con tapones de rosca. Como
testigos, se utilizaron aceitunas no inoculadas, también en jarras.
Las muestras se almacenaron durante 3 meses a temperatura ambiente
(alrededor de 25ºC), después se tomaron 4 aceitunas de cada muestra
a los tiempos t=1, 15, 30 y 90, y se sometieron a conteo
bacteriano. La salmuera se retiró completamente, y a las aceitunas
se les añadieron 20 ml de ClNa al 0,85% y Tween 80 al 0,025%, y se
agitaron vigorosamente durante 2 horas para despegar las bacterias
de la superficie. La suspensión resultante se sembró en un sustrato
de agar para el conteo de bacterias. Los resultados se presentan en
la siguiente tabla.
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Todos los experimentos se repitieron dos veces y
no se observaron variaciones relevantes.
El pericarpo permite un anclaje estrecho de las
bacterias y asegura su liberación lenta después de la ingesta, como
se demuestra mediante el drástico procedimiento de resuspensión. En
particular, se recuperaron alrededor de 10^{6} UFC/g de muestras
analizadas 30 días después de la adición de las bacterias, mediante
agitación vigorosa durante 2 horas en una solución fisiológica a la
que se había añadido Tween; después de 3 lavados seguidos (1 hora
cada uno en las mismas condiciones), todavía están adheridas a la
superficie alrededor de 10^{5}, 10^{4} y 10^{3} UFC/9 g.
Se observó una tenacidad similar en muestras
tomadas después de 7 a 90 días desde la adición de las bacte-
rias.
rias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El Lactobacillus paracasei IMPC 2.1 se
aisló de un sujeto humado adulto con una población bacteriana de
10^{7} UFC/g en heces.
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Se llevó a cabo PCR específica de especie con
cebadores Y2/PARA (Figura 1), como primera etapa de identificación.
Y2 es el cebador universal para eubacterias, mientras que PARA es el
cebador específico para L. paracasei. El IMPC 2.1 mostró una
banda de amplificación de 290 bp, típica de las especies L.
paracasei.
Se llevó a cabo ARDRA utilizando Sau 3AI como
enzima de restricción, como análisis de confirmación; también en
este caso se obtuvieron los perfiles de restricción esperados de
L. paracasei (Figura 2).
El L. paracasei IMPC 2.1 es capaz de
adherirse fuertemente al moco intestinal de cerdo, superficies
abióticas y pericarpo, y es altamente resistente a ácidos biliares,
como se demuestra mediante los siguientes experimentos.
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Se llevó a cabo un ensayo in vitro para
la adhesión al moco intestinal de cerdo, para evaluar la adhesión
in vivo, según el método de Schou, et al., (APMIS
1999, 107: 493-504), particularmente modificado como
sigue.
Se sembraron placas de 96 pocillos, cubiertas
con moco de cerdo (Tipo II, Sigma), con una suspensión de bacterias
titulada (100 \mul, solución de tampón PBS). Después de incubarlas
durante 2 horas a 37ºC con agitación, las placas se lavaron tres
veces con PBS y el moco fue removido mecánicamente de los pocillos,
y entonces, los lavados y el moco se sembraron en placas. La Figura
3 presenta una imagen SEM de L. paracasei IMPC 2.1
adhiriéndose al moco después de 3 lavados.
Las cepas de L. paracasei utilizadas en
el ensayo se listan más abajo, junto con los resultados del conteo
(porcentaje de la relación de UFC sobre el moco en la etapa final,
con el UFC en la suspensión bacteriana titulada)
- 1)
- IMPC 2.1 = 40%
- 2)
- IMPC CV1 = 37%
- 3)
- IMPC 4.1 = 10%
- 4)
- IMPC 1.3 = 40%
- 5)
- IMPC 1.5 = 33%
- 6)
- IMPC 1.4 = 35%
- 7)
- Chr. Hansen Lc1 = 39%
- 8)
- IMPC CLV1 = 38%
- 9)
- ATCC 10863 = 18%
La IMPC 2.1 es una de las cepas que se adhiere
mejor.
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La resistencia de las cepas L. paracasei
se evaluó utilizando medio MRS (De Man et al., J Appl
Bacterial, 1960, 23:130-135), que contenía
sales biliares bovinas Oxgall a diferentes concentraciones. Los
primeros ensayos se llevaron a cabo utilizando Oxgall al 0,2, 0,3,
0,4%: en estas condiciones las cepas mostraban un crecimiento
levemente reducido a concentraciones mayores. El crecimiento se
evaluó midiendo la densidad óptica (OD) a 600 nm.
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En la etapa siguiente, la concentración (el
ácido biliar) se incrementó hasta el 0,7%.
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Se utilizó medio MRS para evaluar la resistencia
de las cepas a las diferentes concentraciones de ClNa. También en
este caso el crecimiento se evaluó midiendo la densidad óptica (OD)
a 600 nm.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se observó una tasa de crecimiento elevada
también con ClNa al 2%, se llevaron a cabo ensayos a concentraciones
mayores.
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La resistencia de las cepas a jugo gástrico
simulado se evaluó utilizando diferentes cepas cultivadas en medio
MRS. Los cultivos se lavaron con solución salina estéril y se les
añadió un volumen igual de jugo gástrico simulado (ClNa, 125
mM^{-1}; ClK 7 mM^{-1}; CO_{3}NaH 45 mM^{-1} y pepsina, 3 g
l^{-1}); ajustando el pH a 2 con ClH. Las suspensiones se
incubaron después a temperatura ambiente bajo agitación (200 rev
min^{-1}), para simular la peristalsis. Se tomaron partes
alícuotas en el tiempo 0 y después de 90 y 150 minutos, y se
contaron sobre agar MRS.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de adhesión, necesaria para que las
cepas colonicen la mucosa intestinal, se evaluó también con un
ensayo para adhesión a superficies abióticas (Tuomola et al.,
Int J Food Microbiol, 2000, 41:45-51). Las cepas se
cultivaron en medio MRS, a 37ºC durante 48 horas bajo anaerobiosis.
Los cultivos se diluyeron después al 1:40 en MRS y partes alícuotas
de 200 \mul se sembraron en placas de poliestireno de 96 pocillos.
Después de incubarlas durante 24 horas a 37ºC, los pocillos se
aclararon suavemente con solución de tampón de fosfato Dulbecco
(DPBS, pH 7,3), se dejaron secar y se les añadió una solución de
violeta de cristal para teñir las células. El exceso de tinte se
eliminó con etanol-acetona (80:20 v/v), después se
midió la densidad óptica (DO) con un lector automático. Sobre la
base de los valores de OD, las células se dividieron en 4 clases de
adhesión: no adhesión (AC1, OD\leq0,5), adhesión débil (AC2,
0,5<OD\leq1,2), adhesión media (AC3, 1,2<OD\leq2,0) y
adhesión fuerte (AC4, OD>2,0)
(Tabla 3).
(Tabla 3).
Para evaluar el efecto del tratamiento
enzimático, físico y químico sobre la capacidad de adhesión de las
cepas, los cultivos bacterianos al comienzo de la fase estacionaria
(6 horas de crecimiento), se sometieron a dichos tratamientos a
diversas temperaturas y tiempos, y se evaluaron los cambios en la
adhesión. Las propiedades de adhesión se describen en la siguiente
tabla. Los resultados muestran que las propiedades de adhesión de
las cepas no se alteran generalmente mucho por los tratamientos
físicos, químicos o enzimáticos.
La Figura 4 muestra el anclaje y la distribución
de L. paracasei IMPC 2.1 sobre el pericarpo (véanse también
las tablas 1 y 2).
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Ejemplo
3
Experimento
1
Dos sujetos adultos sanos se alimentaron durante
7 días con porciones de 5 (sujeto 1) y 10 (sujeto 2) aceitunas,
cuidadosamente drenadas, que contenían en total 3 x 10^{10} y 6 x
10^{10} UFC de L. paracasei IMPC 2.1 respectivamente. La
composición de la flora intestinal de los sujetos se monitorizó al
comienzo (tiempo 0) y después de 7 días (t=7) de administración, y
después de 3 días desde el final de la administración. En cada
muestreo, a 1 g de heces de cada sujeto se le añadieron 9 ml de
medio Amies, la mezcla se homogeneizó y se sometió a diluciones
decimales, que se sembraron sobre un sustrato de 12 \mug/ml de
Rogosa \pm vancomicina, y se cultivaron bajo condiciones de
anaerobiosis durante 48 horas a 37ºC.
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Se observó un aumento de alrededor de dos ciclos
logarítmicos en la población láctica intestinal; se observó una
reducción esperada de alrededor de 2,5 ciclos en el sujeto 1 y de
alrededor de 1 ciclo en el sujeto 2 después de la suspensión de la
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
2
Dos sujetos adultos sanos (A y B) se alimentaron
con porciones de diez aceitunas que contenían alrededor de 10^{9}
CFU de L. paracasei IMPC 2.1. La microflora intestinal fue
monitorizada al comienzo del experimento (t=0), después de 10 de
consumo diario del producto (t=10), y 7 días desde el final de la
administración, según el procedimiento descrito en el experimento
1. Los resultados se describen en la siguiente tabla.
Las colonias aisladas en ambos experimentos se
sometieron a identificación molecular (véase Ejemplo 2), con lo que
se aseguró que el L. paracasei IMPC 2.1 estaba presente en
los dos sujetos y colonizaba el intestino.
Claims (4)
1. Aceitunas de mesa que contienen lactobacilos
adheridos sobre el pericarpo, seleccionados de Lactobacillus
rhamnosus y L. paracasei y/o bifidobacterias adheridas
sobre el pericarpo, seleccionadas de Bifidobacterium bifidum
y B. longum, caracterizadas porque los lactobacilos
están seleccionados de: Lactobacillus rhamnosus GG
ATCC53103; L. rhamnosus IMPC 11; L. rhamnosus IMPC
19; Lactobacillus paracasei LMG P 22043; Lactobacillus
paracasei IMPC 4.1, y porque las bifidobacterias están
seleccionadas de Bifidobacterium bifidum ATCC 15696 y
Bifidobacterium longum ATCC15708.
2. Aceitunas de mesa según la reivindicación 1,
caracterizadas porque los lactobacilos pertenecen a la cepa
Lactobacillus paracasei depositados con la Colección de
Microorganismos Coordinada Belga (Belgian Coordinated Collections
of Microorganism) bajo el número de acceso LMG P 22043.
3. La utilización de lactobacilos y
bifidobacterias para recubrir el pericarpo de aceitunas de mesa.
4. El Lactobacillus paracasei depositado
con la Colección de Microorganismos Coordinada Belga (Belgian
Coordinated Collections of Microorganism) bajo el número de acceso
LMG P 22043.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT002391A ITMI20032391A1 (it) | 2003-12-05 | 2003-12-05 | Olive da mensa contenenti microrganismi probiotici. |
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