BR112012028918B1 - Fermentação sinergística de lactobacillus rhamnosus e lactobacillus paracasei subsp paracasei - Google Patents

Fermentação sinergística de lactobacillus rhamnosus e lactobacillus paracasei subsp paracasei Download PDF

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Abstract

fermentação sinergística de lactobacillus thamnosus e lactobacillus paracasei subsp paracasei. a presente invenção refere-se a um processo para preparação de um produto fermentado através de co-fermentação sinergística de lactobacillu rhamnosus e lactobacillus paracasei subsp. paracasei.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para FERMENTAÇÃO SINERGÍSTICA DE LACTOBACILLUS RHAMNOSUS E LACTOBACILLUS PARACASEI SUBSP PARACASEI.
[001] A presente invenção refere-se a um processo de fermentação envolvendo o crescimento sinergístico de pelo menos duas linhagens Lactobacillus.
[002] Processos de fermentação através de bactérias de ácido lático foram desenvolvidos por séculos. Em fermentação de ácido lático a conversão por bactérias láticas de açúcares fermentáveis em energia permitindo crescimento bacteriano resulta na produção de ácido lático. Fermentação por bactérias láticas é amplamente usada para processamento de alimento.
[003] Por um longo tempo benefícios de saúde têm sido designados para alguns produtos alimentícios fermentados tais como iogurte, variando de aperfeiçoada absorção de nutriente / disponibilidade devido à fermentação, a específicos efeitos designados para as próprias bactérias.
[004] Mais recentemente muitos estudos clínicos têm sido feitos para investigar os benefícios de saúde de algumas linhagens produzindo ácido lático. Estas linhagens são genericamente referidas como probióticos. De acordo com a definição adotada correntemente por FAO/WHO, probióticos são: Micro-organismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem um benefício de saúde sobre o hospedeiro. Maior parte dos micro-organismos usados como probióticos são bactérias de ácido lático, em particular linhagens de gêneros Lactobacillus e Bifidobacteria.
[005] Primeiramente, probióticos foram imaginados afetar beneficamente o hospedeiro principalmente através de aperfeiçoamento de seu equilíbrio microbiano intestinal, através de competição com patógenos e bactérias produzindo toxinas. Atualmente, específicos efeitos
2/13 de saúde estão sendo investigados e documentados incluindo alívio de doenças inflamatórias intestinais crônicas, prevenção e tratamento de diarreia induzida por patógeno, infecções urogenitais, e doenças atópicas. Estes efeitos foram atribuídos às próprias bactérias, e também aos metabólitos que elas produzem durante fermentação.
[006] Diferentes estudos estão começando a ligar diferentes linhagens de probióticos, mesmo pertencendo a uma mesma espécie, com diferentes benefícios de saúde. Por exemplo, uma vez que o intestino humano abriga 400-500 tipos de micro-organismos que podem popular diferentes áreas do trato digestivo, é pensado que este ambiente diverso pode se beneficiar de múltiplas linhagens probióticas.
[007] Por isso está emergindo pesquisa sobre os adicionais benefícios de saúde de composições contendo múltiplas espécies ou linhagens probióticas comparadas àquelas contendo uma única linhagem (TIMMERMAN et al., Int J Food Microbiol, 96, 219-33,2004; WILLIAMS et al., Aliment Pharmacol Ther, 2008). WO2005095656 e VERDENELLI et al. (Eur J Nutr, 48, 355-63,2009) descreve um processo para seleção de linhagens probióticas, incluindo uma etapa de testes de suas propriedades de adesão a células intestinais na presença de outras linhagens bacterianas; estes documentos mostram mais especificamente duas linhagens: Lactobacillus rhamnosus IMC 501 e Lactobacillus paracasei IMC 502 selecionado através deste processo, e propõe usar as mesmas em coadministração para o aperfeiçoamento ou restauração da microflora intestinal.
[008] Composições probióticas de linhagens múltiplas são classicamente obtidas através de crescimento separado de cada linhagem probiótica a ser usada na composição sob condições apropriadas para o crescimento da dita linhagem, e adicionando a mesma ao produto final após seu crescimento ser completo. Tal processo tem a desvantagem de ser consumidor de tempo, e a necessidade de uso de um
3/13 vaso de fermentação para cada linhagem probiótica resulta em altos custos de produção. Ainda, na maioria dos casos, as linhagens probióticas são separadas de seu meio de crescimento antes de serem adicionadas ao produto final. Por isso os metabólitos que elas liberam no meio durante sua fermentação, e que podem participar para o benefício de saúde, não estão mais presentes no produto final.
[009] Entretanto, cocultura de várias espécies ou linhagens bacterianas faz surgir problemas, devido à possível competição e/ou interações entre estas bactérias. Por exemplo, se linhagens com uma diferente taxa de crescimento são cocultivadas, normalmente a linhagem crescendo mais rápido sufocará a outra. Também, os metabólitos produzidos por cada linhagem podem ter efeitos estimuladores ou ao contrário efeitos inibidores sobre uma ou mais das outras linhagens da cocultura.
[0010] A existência de efeitos sinergísticos ou antagonísticos, durante uma fermentação, entre bactérias usadas em clássica produção de alimento é bem conhecida. Por exemplo, o clássico iogurte simbiose é uma cocultura de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus. O sinergismo entre esta duas bactérias resulta na aceleração da multiplicação de ambas, e a acidulação do leite. Exemplos do efeito antagonístico de combinações de diferentes bactérias podem ser encontrados na técnica anterior (E. coli and S. Thyphimurium: TIMMERMAN et al., Int J Food Microbiol, 96, 219-33, 2004, Aspergillus: BUENO-DANTE et al, Journal of food protection, 69, 2544, oct 2006), eles envolvem a produção de moléculas como bacteriocina, antibióticos e outros produtos metabólicos.
[0011] Atualmente, pouco é conhecido sobre as interações entre espécies ou linhagens do gênero Lactobacillus, e mesmo menos sobre probióticos Lactobacillus. Foi reportado (LEE, Processo Biochemistry, 40, 1559-64, 2005) que no campo de produção de ácido lático, cultura
4/13 mista de lactobacilli pode ser mais efetiva que cultura única mas para o melhor conhecimento da requerente nenhuma descrição de uma cocultura sinergística de bactérias das subespécies Lactobacillus casei / paracasei e Lactobacillus rhamnosus foi reportada. WO2005095656 e VERDENELLI et al. (Eur J Nutr, 48, 355-63, 2009) não descrevem a cocultura das duas linhagens Lactobacillus rhamnosus IMC 501 e Lactobacillus paracasei IMC 502.
[0012] Os inventores surpreendentemente verificaram que quando linhagens Lactobacillus das espécies paracasei e rhamnosus são cocultivadas em um meio de fermentação de laticínios, um crescimento sinergístico destas bactérias ocorre. Como um resultado, para um dado tempo de fermentação, o pH do meio fermentado é mais ácido, e/ou a biomassa bacteriana na cocultura é igual e genericamente maior que em monoculturas de cada linhagem individual.
[0013] A invenção por isso provê um processo para preparação de um produto laticínio fermentado contendo duas ou mais linhagens Lactobacillus, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 linhagens Lactobacillus, onde o dito processo compreende:
a) inoculação do dito meio de fermentação laticínio com as ditas linhagens Lactobacillus;
b) fermentação de meio inoculado através de incubação do mesmo em uma temperatura apropriada para crescimento de ditas linhagens, até ela atingir um desejado pH alvo ou até a população bacteriana atingir um desejado valor alvo;
c) interrupção de fermentação e recuperação de produto fermentado;
[0014] onde as linhagens Lactobacillus são selecionadas entre linhagens das espécies Lactobacillus paracasei subsp. paracasei e/ou linhagens das espécies Lactobacillus rhamnosus.
[0015] Um meio de fermentação de laticínio é aqui definido como
5/13 um meio líquido baseado em leite. Qualquer fonte de leite animal ou vegetal pode ser considerada. Leite de vaca é entretanto preferido. Ele pode ser, por exemplo, leite integral, parcial ou inteiramente desnatado, opcionalmente reconstituído a partir de leite em pó. Ele também pode consistir em uma fração de leite, por exemplo, soro de leite coalhado, ou misturas de duas ou mais frações de leite. Preferivelmente, o dito meio será usado sem ainda suplementação. Entretanto, ele opcionalmente pode ser suplementado com ingredientes tais como açúcares, amido, espessantes, etc., contanto que estes ingredientes não interfiram com o crescimento de uma ou mais das linhagens Lactobacillus cocultivadas, e contanto que eles sejam apropriados para consumo humano e animal. Em particular, no caso onde uma ou mais das linhagens Lactobacillus não podem fermentar lactose (por exemplo, no caso de Lactobacillus rhamnosus LGG), um açúcar que pode ser assimilado pela dita linhagem (por exemplo, glicose) pode ser adicionado ao meio de fermentação de laticínio, preferivelmente em uma concentração de até 10%, preferivelmente de 1% a 10%.
[0016] O dito meio usualmente é esterilizado antes de inoculação com as linhagens Lactobacillus. Esterilização é realizada através de processos clássicos conhecidos, tal como tratamento térmico. O pH do meio de cultura antes de inoculação com as bactérias é preferivelmente de 5,5 a 7, preferivelmente de cerca de 6,5.
[0017] Qualquer combinação das linhagens das espécies Lactobacillus paracasei subsp. paracasei e/ou linhagens das espécies Lactobacillus rhamnosus pode de usada para inoculação de meio.
[0018] Por exemplo, pode-se usar duas ou mais linhagens de uma espécie única, ou combinar uma, duas, ou mais linhagens de uma das espécies com uma, duas, ou mais linhagens das outras espécies. Genericamente, pelo menos uma das ditas linhagens tem propriedades probióticas ou potencialmente probióticas. Preferivelmente, pelo me
6/13 nos duas, e ainda mais preferivelmente todas as linhagens usadas para inoculação de meio têm propriedades probióticas ou potencialmente probióticas.
[0019] Propriedades probióticas foram reportadas para linhagens encontradas em ambas espécies Lactobacillus paracasei subsp. paracasei e Lactobacillus rhamnosus.
[0020] Exemplos de linhagens Lactobacillus paracasei subsp. paracasei com propriedades probióticas reportadas incluem:
[0021] - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518, mostrado por exemplo, em EP0794707;
[0022] - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689, mostrado em WO2009122042;
[0023] - Lactobacillus casei shirota (que realmente pertence às espécies Lactobacillus paracasei subsp. paracasei);
[0024] Exemplos de linhagens de Lactobacillus rhamnosus com reportadas propriedades probióticas incluem:
[0025] - Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, mostrado em
WO2009130423 [0026] - Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), mostrado em US 4839281;
[0027] - Lactobacillus rhamnosus HN001, mostrado por exemplo, em WO9910476.
[0028] Combinações de linhagens preferidas são aquelas que incluem pelo menos um e preferivelmente pelo menos dois de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei I-3689, e Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690. Por exemplo, elas podem incluir Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCMI-1518 com Lactobacillus paracasei Subsp. paracasei CNCM I-3689; Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518 com Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690; Lactobacillus paracasei
7/13 subsp. paracasei CNCM I-3689 com Lactobacillus rhamnosus CNCM I3690.
[0029] Uma combinação de linhagens particularmente preferida inclui as três linhagens Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689 e Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690.
[0030] Estas combinações ainda podem incluir outras linhagens probióticas ou não probióticas de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei e/ou Lactobacillus rhamnosus.
[0031] Genericamente, as linhagens Lactobacillus são inoculadas no meio de fermentação de laticínio em uma quantidade global de pelo menos 106 CFU/mL, preferivelmente de 5x106 a 1x108 CFU/mL, mais preferivelmente de 1x107 a 5x107 CFU/mL, e ainda mais preferivelmente de cerca de 2x107 CFU/mL.
[0032] A proporção de cada linhagem na população global de Lactobacillus inoculada será escolhida em função da proporção que se deseja obter no produto fermentado final. Tipicamente, cada linhagem individual deve representar pelo menos a população global inoculada. Ela por isso pode representar até 99% no caso de duas linhagens de cocultura, até 98% no caso de três linhagens em cocultura, e assim por diante. Preferivelmente, cada linhagem individual representará pelo menos 5%, mais preferivelmente pelo menos 10% da população global.
[0033] As linhagens individuais podem ser inoculadas separadamente, ou misturadas juntas antes de inoculação.
[0034] Após inoculação do meio laticínio, fermentação é conduzida sob as condições usuais apropriadas para crescimento das linhagens bacterianas inoculadas.
[0035] Ambas, Lactobacillus paracasei subsp. paracase e Lactobacillus rhamnosus são bactérias mesofílicas. Por isso, a temperatura
8/13 de fermentação será genericamente de 30°C a 42°C, p referivelmente de 34°C a 38°C, mais preferivelmente de cerca de 37 °C.
[0036] A fermentação é interrompida quando o meio de fermentação atinge o desejado pH alvo ou quando a população global de Lactobacillus atinge o desejado valor alvo.
[0037] Genericamente, o pH alvo será de 3,7 a 4,2, preferivelmente de 3,75 a 3,9, mais preferivelmente de cerca de 3,8.
[0038] O valor alvo para a população global de Lactobacillus é genericamente de pelo menos 5 vezes, preferivelmente de pelo menos 10 vezes, ainda mais preferivelmente de pelo menos 100 vezes, e usualmente até 1000 vezes a população inoculada. Genericamente, a fermentação é interrompida quando a população bacteriana é de pelo menos 108 CFU/mL, preferivelmente de pelo menos 109 CFU/mL.
[0039] O tempo de fermentação para atingir o pH alvo ou a população alvo de Lactobacillus depende das condições de fermentação (incluindo em particular o tamanho da população inoculada, a composição do meio de fermentação de laticínio, e/ou a temperatura de fermentação). Quando usando uma combinação de linhagens de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei e/ou Lactobacillus rhamnosus, o tempo de fermentação é mais curto. Ele pode ser, por exemplo, pelo menos 1% menor, preferivelmente pelo menos 5% menor, preferivelmente pelo menos 10% menor, por exemplo, de 1% a 80% ou de 5% a 50%, ou de 10 a 40% menor que o tempo de fermentação necessário para atingir o mesmo pH alvo ou a mesma população alvo de Lactobacillus com uma linhagem de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ou Lactobacillus rhamnosus cultivada individualmente sob as mesmas condições de fermentação. Um tempo de fermentação menor de 1% a 10% é considerado como uma sinergia leve. Um tempo de fermentação menor que pelo menos 10% é considerado como uma alta sinergia. Genericamente, as condições de fermentação serão escolhidas de
9/13 modo que o tempo de fermentação seja de 10 a 120 horas, preferivelmente 25 a 75 horas, e preferivelmente de modo que o tempo de fermentação não exceda 50 horas.
[0040] A invenção também abrange um produto laticínio fermentado obtenível através do processo da invenção. Este produto usualmente contém, em adição a Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ou Lactobacillus rhamnosus, linhagens usadas para a fermentação, o meio laticínio fermentado. Por isso, ele contém todos os metabólitos produzidos pelas linhagens durante a fermentação, incluindo os metabólitos resultantes das interações entre as linhagens cocultivadas (por exemplo, os metabólitos liberados por uma das linhagens que foi ainda metabolizado por uma outra linhagem).
[0041] Este produto laticínio fermentado pode ser usado como tal, em particular como um produto alimentício, ou um suplemento nutricional.
[0042] Ele também pode ser adicionado a um produto alimentício tal como um iogurte, ou a uma composição nutricional, farmacêutica, ou cosmética. A composição alimentícia, assim como as composições nutricionais, farmacêuticas, ou cosméticas compreendendo o dito produto laticínio fermentado também são parte da invenção.
[0043] A presente invenção é ainda ilustrada pela descrição adicional que se segue, a qual refere-se a exemplos não limitantes da implementação do processo da invenção.
Exemplo 1
Crescimento sinergístico de duas ou três linhagens de Lactobacillus Materiais e Métodos:
1) Linhagens [0044] As seguintes linhagens foram estudadas:
[0045] Linhagens Lactobacillus rhamnosus:
[0046] Rhamno A
10/13 [0047] Rhamno B [0048] HN001 [0049] CNCM I-3690 [0050] Linhagens Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei:
[0051] Paracasei A [0052] Paracasei B [0053] CNCM I-1518 [0054] CNCM I-3689 [0055] HN001, CNCM I-3690, CNCM I-1518 e CNCM I-3689 são linhagens probióticas conhecidas, enquanto rhamno A, rhamno B, paracasei A e paracasei B são linhagens comuns escolhidas randomicamente.
2) Criotubos [0056] As linhagens foram conservadas em criotubos (2 mL) que foram previamente constituídos de acordo com o protocolo abaixo.
[0057] Cultura de linhagem foi realizada com caldo Man Rosa Sharpe (MRS) e incubada 16 horas a 37°C; DMSO esterilizado (5,3%) foi adicionado para aperfeiçoar a estabilidade de linhagem durante a fase de estocagem. O criotubo foi congelado com vapor de nitrogênio durante 30 mn. A pureza de linhagem foi verificada com API gallery SOCH + azul de metileno. Os criotubos foram estocados a -80°C.
3) Subcultura com meio de crescimento:
[0058] Cada linhagem foi cultivada individualmente. Os criotubos foram descongelados sob condições estéreis e 1 mL (1%) de cultura foi adicionado a 100 mL de caldo estéril usado como meio de crescimento, e incubados a 37°C até a cultura atingir a fase estacionária (pH ao redor de 4,00). A subcultura foi centrifugada em 5000 rpm durante 15 mn a 4°C. Sobrenadante foi substituído por sal t riptona estéril.
4) Fermentação em meio laticínio [0059] O meio laticínio contém leite em pó desnatado (120 g) e
11/13 água destilada (930 g). Após 1 hora de reidratação, a mistura foi esterilizada através de autoclavagem por 15 mn a 115°C.
[0060] As bactérias das subculturas foram inoculadas em uma população bacteriana global de 2x107 células / mL em 200 mL de meio laticínio. Quando 2 linhagens foram usadas, cada linhagem representou 1Z> da população bacteriana global; quando 3 linhagens foram usadas, cada linhagem representou 1/3 da população bacteriana. A fermentação foi conduzida a 37°C, e monitorada através de medição de diminuição de pH no meio de cultura. Fermentação foi conduzida a 37°C, e monitorada através de medição de diminuição de pH no meio de cultura. Fermentação foi interrompida quando um pH alvo de 3,80 foi atingido.
[0061] A análise de contagem de células é realizada através de diluições seriais do meio fermentado com solução de sal de triptona, e revestimento sobre placas de Petri com MRS ágar. Placas de Petri são incubadas a 37°C durante 72 horas em condições anae róbicas. Resultados:
[0062] Os resultados são mostrados em Tabelas I e II e Figuras 1 a 3.
[0063] A Tabela I mostra a contagem bacteriana total quando o pH alvo de 3,80 é atingido.
[0064] A Tabela II mostra a diminuição em tempo de fermentação necessária para atingir o pH alvo de 3,80 (média de 2 experimentos independentes). A diminuição é calculada através da diferença entre o tempo necessário para atingir pH = 3,80 para a linhagem que mostra a taxa de fermentação mais rápida quando cultivada sozinha, e o tempo para atingir pH = 3,80 para a combinação de linhagens. Foi considerado que um efeito sinergístico está presente quando a redução de tempo de fermentação com combinação é de pelo menos 1%, preferivelmente com pelo menos o mesmo nível mínimo de população.
12/13
Tabela I
No de combinações Combinações de linhagens Contagem Total CFU/g
1 CNCM l-1518+CNCM I-3689 3x10e9
2 CNCM 1-1518+ Paracasei B 3x10e9
3 CNCM 1-1518+ Rhamno A 2,8x10e9
4 CNCM I-1518+HN001 3x10e9
5 CNCM I-3689+CNCM I-3690 3,1x10e9
6 CNCM 1-1518+ Paracasei A 4x10e9
7 CNCM l-1518+CNCM I-3690 3,1x10e9
8 CNCM l-1518+CNCM I-3689+ Rhamno B 4x10e9
9 CNCM l-1518+CNCM I-3689+ Rhamno A 2,5x10e9
10 CNCM l-1518+CNCM I-3689+HN001 1,4x10e9
11 CNCM l-1518+CNCM i-3690 + CNCM i-3689 3x10e9
12 CNCM 1-1518+ Paracasei B +CNCM I-3690 2,75x10e9
13 CNCM 1-1518 + Paracasei A +CNCM I-3690 3,2x10e9
0065] A Tabela I, mostra resultados de contagem total. A contagem alvo (a mesma como para a fermentação de cada linhagem individual = pelo menos 1x10e9 CFU/g) é obtida para cada combinação testada na Tabela 2.
Tabela II
No de combinações Combinações de linhagens Diminuição em tempo de fermentação (média de 2 experimentos independentes) Diminuição em tempo de fermentação (%)
1 CNCM l-1518+CNCM I-3689 -1 hr -1 %
2 CNCM 1-1518+ Paracasei B -1 hr -1 %
3 CNCM 1-1518+ Rhamno A -4 hrs -10 %
4 CNCM I-1518+HN001 -6 hrs -13 %
5 CNCM I-3689+CNCM I-3690 -6 hrs -12 %
6 CNCM 1-1518+ Paracasei A -7 hrs -15 %
7 CNCM l-1518+CNCM I-3690 -10 hrs -19 %
8 CNCM l-1518+CNCM I-3689+ Rhamno B -4 hrs -12 %
9 CNCM l-1518+CNCM I-3689+ Rhamno A -6 hrs -15 %
10 CNCM l-1518+CNCM I-3689+HN001 -7 hrs -16 %
11 CNCM l-1518+CNCM I-3690 + CNCM I3689 -12 hrs -29 %
12 CNCM 1-1518+ Paracasei B + CNCM I3690 -14 hrs -28 %
13 CNCM 1-1518 + Paracasei A + CNCM I- 3690 -20 hrs -40 %
0066] A tabela II demonstra claramente que todas as combinações de L. rhamnosus e/ou L. casei rendem um inesperado aumento sinergístico em crescimento, refletido em uma diminuição em tempo de
13/13 fermentação de pelo menos 1 hora. Este efeito sinergístico é mesmo mais forte quando três linhagens são cofermentadas.
[0067] A Figura 1 mostra as curvas de fermentação sob as mesmas condições de cultura, das 2 culturas individuais CNCM I-3689 e CNCM I-3690 e das 2 linhagens em cocultura (combinação 5). A cofermentação resulta em uma diminuição de 6 horas no tempo de fermentação.
[0068] A Figura 2 mostra as curvas de fermentação sob as mesmas condições de cultura, das 2 linhagens individuais CNCM I-1518 e CNCM I-3690 e das 2 linhagens em cocultura (combinação 7). A cofermentação resulta em uma diminuição de 10 horas no tempo de fermentação.
[0069] A Figura 3 mostra as curvas de fermentação sob as mesmas condições de cultura, das 3 linhagens individuais CNCM I-1518, CNCM I-3689 e CNCM I-3690 e das 3 linhagens em cocultura (combinação 11). A cofermentação resulta em uma diminuição de 12 horas no tempo de fermentação.
[0070] Estes resultados confirmam aqueles apresentados na Tabela II, mostrando um efeito sinergístico da cofermentação de linhagens sobre a taxa de crescimento, e que a combinação das três linhagens diferentes é a mais eficaz na diminuição do tempo de fermentação.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para preparação de um produto laticínio fermentado contendo duas ou mais linhagens Lactobacillus, onde o dito processo compreende:
    a) inoculação de um meio de fermentação laticínio com as ditas linhagens Lactobacillis;
    b) fermentação de meio inoculado através de incubação do mesmo em uma temperatura apropriada para crescimento das ditas linhagens, até atingir um desejado pH alvo ou até a população global de Lactobacillus atingir um desejado valor alvo;
    c) interrupção de fermentação e recuperação de produto fermentado;
    caracterizado pelo fato de que as linhagens Lactobacillus são selecionadas entre as linhagens Lactobacillus paracasei subsp. paracasei e/ou linhagens das espécies Lactobacillus rhamnosus, e compreendem uma combinação de linhagens selecionadas entre:
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518 e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689;
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518 e Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690;
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689 e Lactobacillus rhamnosus I-3690.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as linhagens Lactobacillus são inoculadas no meio de fermentação de laticínio em uma quantidade global de pelo menos 106 CFU/mL.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que cada linhagem individual representa pelo menos 1% da população global de Lactobacillus inoculados.
  4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações
    Petição 870190124868, de 28/11/2019, pág. 5/10
    2/3
    1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fermentação é conduzida em uma temperatura de 30°C a 42°C.
  5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a fermentação é interrompida quando um pH alvo de 3,7 a 4,2 é atingido.
  6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a fermentação é interrompida quando a população global de Lactobacillus é de pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 100 vezes, a população inoculada.
  7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a fermentação é interrompida quando a população global de Lactobacillus é de pelo menos 108 CFU/mL.
  8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a população global de Lactobacillus no produto fermentado recuperado é de 106 a 109 CFU/mL.
  9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as linhagens inoculadas compreendem Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689 e Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690.
  10. 10. Composição, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, compreendendo as seguintes linhagens de Lactobacillus:
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518 e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689; ou
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518 e Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690; ou
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-3689 e Lactobacillus rhamnosus I-3690; ou
    Petição 870190124868, de 28/11/2019, pág. 6/10
    3/3
    - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518, Lactobacillus parasei subsp. paracasei CNCM I-3689, e Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, a dita composição sendo um produto laticínio fermentado.
  11. 11. Composição alimentícia, caracterizada pelo fato de que contém uma composição como definida na reivindicação 10.
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