KR100513168B1

KR100513168B1 - 돼지 유행성 설사증 (PED) 코로나바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 가지는 신규 내 산성 엔테로코커스 훼카리스Probio-056 및 이를 함유하는 생균활성제

Info

Publication number: KR100513168B1
Application number: KR10-2003-0059714A
Authority: KR
Inventors: 박용하; 이인선; 김홍익
Original assignee: 주식회사 프로바이오닉
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2005-09-07
Also published as: KR20050023475A

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사증(Porcine Epidemic Diarrhea; PED)의 코로나바이러스 및 유해한 병원성 미생물의 생육을 억제하는 생균활성제인 프로바이오틱스에 관한 것으로, 본 발명의 세균인 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056은 동물체의 체내 및 장내에서 유해한 성질을 나타내는 여러 종의 병원성 미생물 및 돼지유행성 설사증(PED) 코로나바이러스의 생육을 효과적으로 억제하고 내 산성, 내 담즙산성 기능을 가지고 있으므로, 기존 항생제의 대체용으로 인체 및 각종 가축에게 투여하거나 의약품, 사료첨가제, 동물약품 등으로 사용하여 장내미생물 균총의 안정화를 이루며 설사 등 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사증 (PED) 코로나바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 가지는 신규 내 산성 엔테로코커스 훼카리스 P r o b i o- 0 5 6 및 이를 함유하는 생균활성제{Acid tolerant probiotic Enterococcus faecalis Probio-056 that can suppresses the growth of pathogenic microorganisms and PED coronavirus}

본 발명은 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스와 유해 미생물의 생육억제활성을 가지는 신규 엔테로코커스 훼카리스 Probio-0556(Enterococcus faecalis Probio-056)와 이를 이용한 가축용 생균활성제 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 돼지의 위장으로부터 분리된 신규 미생물로서 내 산성, 내 담즙산성, 항생제 저항성을 지니면서 동시에 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스와 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 엔테로코커스 훼카리스Probio-056 (Enterococcus faecalis Probio-056)와 상기 미생물을 함유하는 가축용 생균활성제에 관한 것이다.

국내· 외 돼지 사육 현장에서 발생하는 중요한 유행성 설사증인 PED는 일종의 설사병으로써 국내에서는 1992년 겨울부터 지역적으로 발생하기 시작하였는데 발병형태는 매우 다양한 모습을 보여주고 있다. 또한 병원성의 차이도 커서 월평균 폐사율이 10∼70%로 피해 정도의 차가 크게 나타나는데 이는 양돈 밀집지역의 인공감염으로 인한 병원체의 증가 및 발생빈도수의 증가와 TGE와의 복합 감염시에 피해가 더 크다 자돈의 수양성 설사와 구토를 증상으로 3일령 이내의 어린자돈 감염시 폐사율이 높다. TGE와 비교 시 임상증상이 비슷하면서도 차이가 있는 부분은 처음 농장에 질병 발생 시 돈사간 질병 전파속도가 유행성 TGE 보다 늦어서 때때로 PED는 4-5주간 전파 감염되는 것을 농장에서 관찰하는 경우도 있다. 그리고 PED는 번식 모돈군에서 임상증상이 뚜렷하게 관찰되지는 않는다. 자돈을 폐사시키고 비육돈과 육성돈에서는 식욕을 감퇴시켜서 성장을 저해시키는 질병이다. 이러한 질병은 양돈장 및 자연환경에 서식하는 코로나바이러스에 의해서 일어나며, 대장균에 의한 2차 감염으로 그 폐해가 더욱더 증가하고 있는 실정이다. 돼지 유행성 설사증은 바이러스성 질병이므로 항생제를 투여하더라도 코로나바이러스에 대한 치료 효과를 볼 수 없으며 단지 2차 감염을 일으키는 미생물에 대한 치료 효과만 기대할 수 있다. 그러나 항생제의 남용을 기피하는 세계적인 추세와 육류 내의 잔류 항생제가 인체로 이전되는 문제가 발생하게 되어 항생제 대체물질에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 또한 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스의 감염예방을 위해 백신이 사용되고 있으나 백신 사용에 의한 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 제기되고 있다.

인체 및 동물체의 장내에는 다양한 미생물들이 존재하면서 장내의 미생물 균총을 이루고 있다. 이러한 미생물 중에는 숙주 동물에 유용한 것으로 알려져 온 유산균 등의 유익한 미생물들이 있는가 하면 반대로 숙주에 직접적 또는 잠재적인 유해성을 가지는 대장균, 살모넬라, 포도상구균 등의 미생물들이 또한 포함된다. 인체 및 동물체의 경우 스트레스의 증가, 유해세균의 감염, 외부 환경의 변화에 의해서 장내 미생물 균총이 파괴될 경우 유해 미생물들의 급격한 성장을 초래하여, 숙주동물의 건강상태를 악화시키게 된다. 이러한 변화는 설사에서부터 심지어는 폐사의 위험으로까지 진행될 수 있으며, 이때 치료의 목적으로 항생제를 투여하게 되고, 사용된 항생제는 체외로 완전히 배설이 되지 않고 숙주 내에 잔류하며, 지속적인 투여 시 유해미생물들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료를 할 수 없게 된다. 또한 현재는 가축의 경우 육류, 우유, 난 등의 항생제 잔존량에 대한 규제가 갈수록 엄격해지고 있으므로 계속적인 항생제의 사용 및 남용은 제고해야 할 문제로 이미 대두되어왔다. 이에 대한 대안으로 현재 생균활성제인 프로바이오틱스에 대한 관심이 증대되고 있다. 생균활성제인 프로바이오틱스는 인체나 동물의 장내에 서식하는 유익한 미생물을 분리하여 제제화한 것으로 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 유산균들이 주요 균주로 이용되고 있다. 이러한 유산균들은 전통적으로 식품의 발효와 가공과정에 다양하게 이용되었으며, 그들의 안정성은 오래 전부터 인지되어 미국의 FDA는 GRAS(Generally recognized as safe)목록에 이들 중의 일부를 포함시키고 있다. 따라서 유산균을 이용한 생균활성제 프로바이오틱스는 항생제 남용으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 일으키지 않고, 장내 유해 세균의 이상발효를 억제하여 안정된 장내 균총을 유지하며 유해 미생물의 감염으로 인한 질병을 감소시킬 수 있다. 또한 생균활성제의 지속적인 투여는 사료효율을 높여주고 건강 유지를 통해 증체량의 증대를 꾀할 수 있다. 생균활성제로서의 효과적인 사용을 위해서는 유해한 미생물에 대한 억제 활성뿐만 아니라 내 산성, 내 담즙산성을 지니는 것이 매우 중요하다. 동물체에 생균활성제를 투여할 후 경우 장에 도착할 때까지는 강산인 위액을 만나게 되고 그 다음 담즙산을 만나게 된다. 이들 위액과 담즙산은 일반적으로 세균을 죽이거나 활성을 떨어뜨리기 때문에 투여된 생균활성제가 무사히 장에 도달하여 그 기능을 발휘하기 위해서는 위액과 담즙산에 견딜 수 있는 성질을 가지고 있어야 한다.

지금까지 생균활성제 프로바이오틱스로 다양한 종류의 유산균이 발표되어 왔으며 내 산성, 내 담즙산성의 특성을 가지면서 유해 미생물들을 억제하는 엔테로코커스 훼카리스(Enterococcus faecalis)로 동정된 생균활성제 또한 보고된 바 있다.

본 발명자들은 기존의 생균활성제 보다 유해 미생물들을 더욱 효과적으로 억제할 수 있고 내 산성, 내 담즙산성을 지니며, 특히 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스의 생육을 탁월하게 억제하는 신규 생균활성제의 탐색을 시도하였다. 그 결과 돼지의 위장으로부터 유해 미생물에 대한 억제활성과 내 산성, 내 담즙산성 능력이 뛰어나며 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 균주를 혐기적으로 분리 동정하였으며, 이 균주가 엔테로코커스 훼카리스(Enterococcus faecalis)라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간이나 동물에는 해가 없고 기존 항생제의 대체용으로 가축에게 투여하거나, 내 산성, 내 담즙산성이 뛰어난 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기존 항생제의 대체용으로 가축에게 투여하거나, 의약품, 사료첨가제, 동물약품 등으로 사용하여 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스와 장내 유해한 미생물을 억제할 수 있는 생균활성제 함유 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 미생물을 이용하여 코로나바이러스를 억제하거나 상기 바이러스에 의한 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 미생물을 이용하여 장내 유해 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 이들 미생물에 의한 장내 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 잇점 들 및 목적들은 하기 실시예에 의해 보다 명확히 이해될 것이다. 이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명의 상기 목적은 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스와 유해 미생물을 억제할 수 있는 내 산성, 내 담즙산성 신규 미생물 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056 (Enterococcus faecalis Probio-056), 식품, 의약품, 동물약품, 사료첨가제 등 상기 생균활성제를 함유한 조성물, 상기 미생물을 이용하여 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스와 유해 미생물의 생육을 억제할 수 있는 방법을 제공함으로써 달성되었다.

본 발명 신규 미생물인 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056(Enterococcus faecalis Probio-056)은 돼지에서 유래한 장내세균으로, 호기 상태에서 생존할 수 있으며 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스 및 다른 해로운 장내 세균들의 생육을 억제할 수 있어, 결과적으로 가축의 설사병을 예방 및 치료 할 수 있는 것으로 나타났다.

본 발명은 코로나바이러스 감염과 관련된 설사병의 예방 또는 치료 개선 방법을 본 발명자들이 연구한 것으로, 현재 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스 설사병의 경우 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주의 예방약이 개발되어 있으나, 국내의 열악한 사육환경이나 양돈 농가의 인식부족으로 인하여 현장에서 손쉽게 사용할 수 없으므로 아직까지 박멸되지 못하고 있는 실정인데, 본 발명은 이러한 돼지 코로나바이러스 및 장내 유해 미생물들의 감염과 관련된 설사 및/또는 위장염을 치료할 수 있는 효과적이고 잠재력 있는 프로바이오틱스를 제공한다. 그러므로, 본 발명 프로바이오틱 미생물은 가축의 사료를 포함한 식품 및 가축의 장내 서식하는 돼지 코로나바이러스 및 유해균의 수를 감소시키는데 사용될 수 있다.

본 발명 미생물은 장 세포에 흡착할 수 있을 뿐만 아니라, 다음과 같은 프로바이오틱 특성을 보유한다.

- 돼지 코로나바이러스 및 다른 장내 유해미생물의 생장 억제능

- 호기적, 혐기적 조건 및 다양한 pH에서의 생장능; 이러한 성질은 위장관 내에서 변화되는 다양한 생리적 및 병리적 조건에 잘 적응할 수 있는 능력을 부여한다.

- 위산 및 담즙산 내성

- 동결건조에서의 생균활성 보유능

또한, 본 발명 신규 미생물은 공지의 다른 예방 또는 치료방법과 같이 항생제 내성이나 생물 독성 등의 부작용이 없는 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, '프로바이오틱(probiotic)' 은 ' 사람을 포함한 동물의 위장관내에서 숙주의 장내 미생물 균형을 개선하여 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물' 의 의미로 이해된다. 프로바이오틱 미생물은 프로바이오틱 활성을 갖는 살아 있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명에 있어서 "돼지의 코로나바이러스(coronavirus)" 는 돼지의 주요 바이러스성 전염병 원인체로, 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine epidemicdiarrhea virus; PEDV), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus; TGEV) 등을 말하는 것으로, 국내에서도 매년 발생하면서 양돈산업에 막대한 피해를 입히고 있다. 특히, 본 발명 미생물이 뛰어난 억제 활성을 보이는 돼지 유행성 설사증(PED) 코로나바이러스는 매우 빠른 전염성의 특징을 갖고, 구토와 심각한 설사를 유발하며, 모든 연령의 돼지가 PEDV에 민감하다.

구체적으로, 유해 미생물 생육억제 활성을 가지는 내 산성, 내 담즙산성 미생물을 탐색하는 과정은 다음과 같다. 즉, 혐기백 (상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)에 돼지의 위장 내용물 30g을 정확히 채취하여 넣고, pH 2로 조정한 혐기 희석액 270㎖를 넣어 1:10 의 비율로 희석한 다음, 진탕기를 이용하여 120분간 진탕하였다. 진탕액 1㎖를 옥스갈 (디프코사 제품, 상품명) 0.5%를 첨가한 BL 고체배지(일본 영연화학사 제품)에 도말하고, 37℃에서 48시간 혐기장치를 이용하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 형성된 집락(colony) 310개를 선발하여 GAM semi-agar 배지(일본 일수제약사 제품)에 옮겨 배양한 뒤, 영하 80℃에서 보존하면서 실험에 사용하였다.

분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등의 문헌 (Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990)과 항생제 평가시 사용되는 미생물 13종을 대상으로 하였다. 이러한 미생물 13 종은 다음과 같다.: 대장균 (E.coli) KCTC 2441, 대장균 (E. coli) KCTC 2571, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Salmonella enteritidis , Shigella flexneri KCTC 2008, Salmonella gallinarum , Enterobacter cloacea KCTC 2361, Enterococcus lactis KCTC 1913, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii KCTC 2006, Bacillus subtilis KCTC 1021. 위의 유해 미생물들을 NB(nutrient broth) 액체배지에서 배양한(37℃, 18시간) 후 배양액 0.1㎖를 취하여 NA(nutrient agar) 고체배지에 도말 하고 건조시킨 다음 지름 8mm의 페이퍼디스크를 배지 위에 올려 놓았다. 분리한 미생물들은 MRS 액체배지에서 혐기적으로 배양한(37℃, 18시간) 후, 위의 NA(nutrient agar) 배지에 올려놓은 지름 8mm의 페이퍼디스크에 배양액 30㎕를 접종하고 배양(37℃, 24시간)하였다. 일정 시간의 배양이 끝난 다음 형성된 생육 억제 환(clear zone)을 측정하여 대조구와 비교하고, 유해미생물의 생육억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-056로 명명하였다.

Probio-056 균주를 동정하기 위하여, 상기에서 선별된 균주들을 배양한 후, 형태; 생리·생화학적 특성; 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석 실험 등을 수행하였다.

Probio-056의 형태 및 생리·생화학적 특성을 조사한 결과, Probio-056은 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 구균이다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30∼37℃이 바람직하다. 가스와 인돌을 생성하지 않으며 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않는다.

Probio-056의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-056은 엔테로코커스 (Enterococcus) 속에 속하는 균주로서 99.5%의 16S rDNA 상동성으로 엔테로코커스 훼카리스(Enterococcus faecalis)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 따라서 이상의 결과에 기초하여 Probio-056을 엔테로코커스 훼카리스(Enterococcus faecalis)의 균주로 동정하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2003년 8월 20일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC-10510BP). 본 발명의 미생물은 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 영하 80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결 건조하는 것이 바람직하다. 본 발명 균주는 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 갖고 필드 안정성이 뛰어나거나 또는 보다 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내도록 개선 또는 개량될 수 있음은 당업자에게 충분히 이해될 것이다.

본 발명 Probio-056 균주를 가지고 돼지 유행성 설사증(PDE) 코로나바이러스의 생육 억제 실험결과 시험세포에 있어서 코로나 바이러스에 의한 세포변성효과가 관찰되지 않아 prBio-056은 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명 미생물은 위장관 내 유해 미생물들의 생장 억제능이 있으며, 항생제에 대한 감수성 실험결과 다양한 가축 항생제에 대해 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 본 발명 미생물은 이미 지적한 바와 같이 돼지의 장관으로부터 분리된 것으로 정상적인 장내 미생물균총을 형성하기 때문에 특히 가축 사육에 더욱 잇점이 있다.

본 발명의 한 유익한 측면에 있어서, 본 발명은 상기 신규의 미생물을 함유하는 식품, 의약품, 동물약품, 사료첨가제를 제공한다. 본 발명 미생물은 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로, 또는 식품의 첨가제로 사용되거나 사람이나 가축이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명 미생물은 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 부여함) 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 증강시키거나 보완함)에 첨가되어 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적, 수의학적 또는 영양학적 조성물은 분리된 프로바이오틱세균으로 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056 또는 이와 함께 2종 이상의 다른 유익한 균주와 적당한 담체를 함께 포함할 수 있다.

예컨대, 본 발명 조성물에 본 발명 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 바이러스나 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이로틱 활성을 갖는 것들이 바람직하다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 Saccharomyces, Candida, Pichia 및 Torulopsis를 포함하는 효모(yeasts), Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium 등과 같은 곰팡이 및 Lactobacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Leuconostoc, Bacteroides, Staphylococcus, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Propionibacterium, Enterococcus, Pediococcus, 그리고 Micrococcus 속 세균들이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheinformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, 및 Staphylococcus xylosus 등을 들 수 있다. 바람직하게는 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 돼지 설사병을 유발하는 로타바이러스(rotavirus) 억제능을 나타내는 락토바실러스 레우테리 Probio-16(KCCM 10214), 돼지 코로나바이러스 억제능을 나타내는 락토바실러스 프란타럼 Probio-38 (KCCM10329), 또는 이들의 혼합균을 본 발명 조성물에 추가로 포함할 수 있다. 본 발명 조성물에 함유될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056 균주는 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이나 건조분말 형태일수 있다.

통상적인 항생제 대신에, 본 발명 신규 미생물 및 조성물은 생균활성제로 동물에 투여되거나 식품, 의약품, 동물약품, 또는 사료첨가제와 함께 동물에 투여될 수 있다. 이러한 생균활성제는 기존 항생제의 대체용으로 인체 및 각종 가축에대해 장내 유해한 미생물을 억제하며 안정된 장내 균총의 유지를 통해 동물체의 건강상태를 양호하게 하고 가축의 증체량과, 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 등의 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명 조성물은 또한 장내 미생물균총을 유지하기 위해 항생제 투여 후에도 투여될 수 있다.

특히, 항바이러스 활성능을 갖는 본 발명 신규 미생물은 특히, 다른 치료법이 비효과적이거나 임상적으로 부작용이 있는 코로나 바이러스의 감염에 의해 유발된 대부분의 증상 완화나 치료에 매우 유용하다.

그리하여, 본 발명은 신규 미생물 또는 이를 유효량 함유한 조성물을 사용하여 코로나바이러스 감염의 발생을 저지하거나 감염에 의한 위장염 및 설사 등을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 장내 유해 병원성 미생물의 발생을 저지하거나 감염에 의한 위장염 및 설사 등을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056 (Enterococcus faecalis Probio-056)가 유해 미생물을 억제하기 위한 최적온도조건으로는 30℃∼37℃가 바람직하다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 발명의 권리범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 내 산성, 내 담즙산성 특성을 갖는 세균의 분리

돼지의 위장 내용물을 채취하여 혐기백(상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)을 이용하여 혐기적으로 운반하였다. 채취한 위 내용물 30g을 pH 2로 조정한 혐기희석액(0.78% K₂HPO₄, 염혼합액 37.5㎖, L-cystein 0.5g, 25% L-ascorbic acid 2㎖, 8% Na₂CO₃ 50㎖, 0.1% resazurin 1㎖를 증류수 860㎖에 녹이고, agar 0.5g을 첨가) 270㎖에 1:10 의 비율로 희석하고, 진탕기를 이용하여 120분간 진탕하였다. 진탕액 1 ㎖를 옥스갈(디프코사 제품, 상품명) 0.5%를 첨가한 BL 고체배지(일본 영연화학사 제품)[ Lab-lemco powder 2.4g, Proteose peptone No.3 10g, Trypticase 5g, Phytone peptone 3g, yeast extract 5g, liver extract 150ml, glucose 10g, soluble starch 0.5g, sol.A 10㎖, sol.B 5㎖, 10% FS antifoam F-20 5㎖, Tween 80 1g, L-cystein 0.5g, horse serum 50㎖를 증류수 1000㎖에 녹이고, agar 15g을 첨가; sol.A 의 조성, 10% KH₂PO₄과 10% K₂HPO₄을 혼합한 것이며; sol.B의 조성, 황산마그네슘 10g, 황산철 0.5g, 소금 0.5g, 황산망간 0.337g을 증류수 250㎖에 녹임)에 도말하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 일정시간이 지난 후 나타나는 콜로니를 300개 선발하여 GAM semi-agar 배지 (일본 일수제약사 제품) [peptone 10g, Soya peptone 3g, Proteose peptone No.3 10g, Peptonized whale serum 13.5g, yeast extract 5g, Beef extract 2.2g, liver extract 1.2g, KH2PO4 2.5g, NaCl 3g, L-cystein 0.3g, Na thioglycolate 0.3g, glucose 2g를 증류수 1000㎖에 녹이고, agar 1.5g을 첨가] 에 옳겨 37℃에서 배양한 뒤, 영하 -80℃에서 보존하였다.

실시예 2 : 분리된 미생물의 코로나바이러스 생장 억제 실험

본 발명 미생물의 코로나바이러스 생장억제 실험은 ST cell에 대한 PEDV(Porcine Epidemic Diarrhea virus)의 세포변성효과(cytopathic effects)를 본 발명 미생물이 얼마나 억제하느냐로 판별하였다. 본 시험에서 세포변성효과가 관찰되지 않을 경우(음성) Probio-056 배양액이 항바이러스 활성(antiviral activity)이 있는 것으로 판정하였다.

(1) 실험방법

가. Vero cell를 96-well microplate에 0.2㎖/well 씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 단층세포(monolayer)가 형성되도록 한다.

나. 유산균 액을 MEM(Eagle's minimum essential medium)으로 희석한다.

다. PED 바이러스가 10^5.5TCID₅₀/0.1㎖ 되도록 준비한다.

라. 나항과 다항에서 준비한 시료를 동량 섞은 후 4℃에서 30분간 반응시킨다.

마. 가항에서 준비한 Vero cell을 PBS로 washing한 다음 여기에 라항의 반응액과 증식배지를 넣어준다.

바. 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 5일간 배양하면서 세포변성효과(cytopathic effects:CPE)를 관찰하였다.

(2) 결과 판정

엔테로코커스 훼카리스 Probio-056의 코로나바이러스에 대한 억제활성은 다음 표1과 같다. 실험결과 세포변성효과가 관찰되지 않았으므로(음성) Probio-056은 코로나바이러스에 대한 antiviral activity가 있는 것으로 판정하였다.

[표1]

Probio-056의 PED 코로나바이러스에 대한 세포변성효과(CPE)

실시예 3 : 분리된 미생물의 유해 미생물 생장 억제 실험

분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등(Kuroiwa et al., 감염증학회지, 64, 257, 1990) 의 방법을 이용하여 항생제 평가시 사용되는 다음의 미생물 13종을 대상으로 하였다. : 대장균 (E. coli) KCTC 2441, 대장균 (E. coli) KCTC 2571, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Salmonella enteritidis , Shigella flexneri KCTC 2008, Salmonella gallinarum , Enterobacter cloacea KCTC 2361, Enterococcus lactis KCTC 1913, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii KCTC 2006, Bacillus subtilis KCTC 1021. 위의 유해 미생물들을 NB(nutrient broth) 액체배지에서 배양한(37℃, 18시간) 후 배양액 0.1㎖를 취하여 NA(nutrient agar) 고체배지에 도말 하고 건조시킨 다음 지름 8mm의 페이퍼디스크를 배지 위에 올려놓았다. 분리한 미생물들은 MRS 액체배지에서 혐기적으로 배양한(37℃, 18시간) 후, 위의 NA(nutrient agar) 배지에 올려놓은 지름 8mm의 페이퍼디스크에 배양액 30㎕를 접종하고 배양(37℃, 24시간)하였다. 일정 시간의 배양이 끝난 다음 형성된 생육 억제 환(clear zone)을 측정하여 대조구와 비교하고, 유해미생물의 생육억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-056로 명명하였다. Probio-056의 유해 미생물에 대한 억제 활성은 다음 표 2와 같다

표 2에서 보는 바와 같이 Probio-056은 사용된 유해미생물 13종에 대해서 대부분 유사한 억제 활성을 지니는 매우 유용한 미생물인 것으로 확인되었다.

[표 2]

Probio-056의 유해미생물 억제 활성

구체적으로, 본 발명의 균주 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056이 유해미생물의 생장을 억제하는 억제환의 지름은 다음과 같다. 대장균 (E. coli) KCTC 2441에 대해 19mm, 대장균(E. coli) KCTC 2571 에 대해 17mm, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208 에 대해 18mm, Staphylococcus aureus KCTC 1621 에 대해 15mm, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917 에 대해 13mm, Salmonella enteritidis에 대해 21mm, Shigella flexneri KCTC 2008에 대해 20mm, Salmonella gallinarum에 대해 22mm, Enterobacter cloacea KCTC 2361 에 대해 16mm, Enterococcus lactis KCTC 1913에 대해 12mm, Salmonella typhimurium에 대해 20mm, Citrobacter freundii KCTC 2006에 대해 20mm, Bacillus subtilis KCTC 1021 에 대해 13mm 이다. 이러한 유해 미생물 생장의 억제를 위한 최적 배양온도는 30℃∼37℃이었다.

실시예 4 : 분리한 미생물 Probio-056의 동정

실시예 1에서 분리된 Probio-056 균주를 MRS 배지 (Difco사 제품)에서 37℃ 조건으로 배양하였다. Probio-056 균주를 동정하기 위하여, Probio-056의 형태 및 생리학적 특성은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 904, 1997)의 방법과 API 32A 및 CHL 키트(바이오메리오사 제품)를 사용하여 결정하였다. 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다.

Probio-056은 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 구균이다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30℃∼37℃가 바람직하다. 가스와 인돌을 생성하지 않으며 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않는다. 0.5% 담즙산에 내성을 나타낸다. Probio-056의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-056은 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 균주로서 99.5%의 16S rDNA 상동성으로 엔테로코커스 훼카리스(Enterococcus faecalis)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 따라서 이상의 결과에 기초하여 Probio-056은 엔테로코커스 훼카리스(Enterococcus faecalis)의 균주로 동정하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2003년 8월 21일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC- 10510BP).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 속의 새로운 미생물인 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056(Enterococcus faecalis Probio-056)는 코로나바이러스 및 병원성 세균을 억제하는 생균활성제인 프로바이오틱스로 동물의 체내 및장내에서 유해한 성질을 나타내는 코로나바이러스 및 여러 종의 병원성 세균을 효과적으로 억제하고 내 산성, 내 담즙산성의 특성을 가지고 있어서 기존 항생제의 대체용으로 인체 및 각종 가축에게 투여하면 장내미생물 균총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있다. 또한 건강상태를 양호하게 하고 가축의 증체량과 육질의 개선, 산유량 및 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있다.

<110> Probionic Corp. <120> Acid tolerant probiotic Enterococcus faecalis Probio-056 that can suppresses the growth of pathogenic microorganisms and PED coronavirus <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1474 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis Probio-056 <220> <221> rRNA <222> (1)..(1474) <223> rDNA nucleotide sequence of Enterococcus faecalis Probio 056 <400> 1 tctatccacc ttaggcggct ggctccaaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa 60 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcgtgc 120 tgatccgcga ttactagcga ttccggcttc atgcaggcga gttgcagcct gcaatccgaa 180 ctgagagaag ctttaagaga tttgcatgac ctcgcggtct agcgactcgt tgtacttccc 240 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc 300 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcgct agagtgccca actaaatgat ggcaactaac 360 aataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420 accatgcacc acctgtcact ttgtccccga agggaaagct ctatctctag agtggtcaaa 480 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg 600 gagtgcttaa tgcgtttgct gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcactc 660 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgagc 720 ctcagcgtca gttacagacc agagagccgc cttcgccact ggtgttcctc catatatcta 780 cgcatttcac cgctacacat ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag tctcccagtt 840 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcmtgc 900 gctcgcttta cgcccaataa atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc 960 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt agataccgtc aggggacgtt cagttactaa 1020 cgtccttgtt cttctctaac aacagagttt tacgatccga aaaccttctt cactcacgcg 1080 gcgttgctcg gtcagacttt cgtccattgc cgaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg 1140 agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctatgcatc 1200 gtggccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc accgcgggtc catccatcag 1260 cgacacccga aagcgccttt cactcttatg ccatgcggca taaactgtta tgcggtatta 1320 gcacctgttt ccaagtgtta tccccctctg atgggtaggt tacccacgtg ttactcaccc 1380 gtccgccact cctctttcca attgagtgca agcactcggg aggaaagaag cgttcgactt 1440 gcatgtatta ggcacgccgc cagcgaaggt gcnc 1474

Claims

코로나바이러스 및 장내 유해 병원성 미생물의 생육을 억제하는 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056(수탁번호: KCTC-10510BP).
제1항의 프로바이오틱 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056 유효량 및 허용 가능한 담체를 포함하고 프로바이오틱 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 조성물이 락토바실러스 레우테리 Probio-16(KCCM10214), 락토바실러스 프란타럼 Probio-38(KCCM10329), 락토바실러스 살리바리우스 Probio-37(KCCM-10328) 또는 이들의 혼합 미생물을 추가로 포함하는 조성물.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 조성물이 구강 섭취 시 포유동물의 설사예방 또는 치료에 유용한 조성물.
상기 제 1항의 프로바이오틱 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056을 이용하여 가축의 코로나바이러스 감염을 억제하거나 상기 바이러스에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.
상기 제 1항의 프로바이오틱 엔테로코커스 훼카리스 Probio-056을 이용하여 가축의 장내 유해 병원성미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.