KR100523256B1 - 결장 암 세포 및 유해 미생물 증식 억제 활성과 장내정착력이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 - Google Patents

결장 암 세포 및 유해 미생물 증식 억제 활성과 장내정착력이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 Download PDF

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Abstract

본 발명은 장내 세포에 대한 정착성이 우수하며, 장내 암세포 증식 및 유해한 병원성 미생물의 생육을 억제하는 유산균 프로바이오틱스에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 미생물인 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40은 장내 세포에 부착력이 우수하며, 장내 암세포 및 유해한 성질을 나타내는 여러 종의 병원성 미생물의 생육을 효과적으로 억제하고 내산성, 내담즙산 및 기타 유용한 기능을 가지고 있으므로, 기존 항생제의 대체용으로 인체 또는 가축에게 투여하거나, 의약품, 정장제, 건강보조식품 등으로 사용하여 장내미생물 균총의 안정화를 이루며 설사등 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방하고 암 예방효과를 얻을 수 있다.

Description

결장 암 세포 및 유해 미생물 증식 억제 활성과 장내 정착력이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 애시도필러스 P r o b i o- 40{Novel acid tolerant probiotic lactobacillus acidophilus Probio-40 with probiotic activities}
본 발명은 결장 암 세포 및 유해 미생물 증식 억제 활성과 장내 정착력이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유아의 분변으로부터 분리된 신규 미생물로서 내산성, 내담즙산성, 항생제 저항성을 지니면서 동시에 결장 암 세포 증식 및 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제할 수 있고, 장내 세포에 대한 우수한 부착력으로 인해 장내 정착성이 우수한 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40(Lactobacillus acidophillus Probio-40), 상기 미생물을 함유한 생균활성제 조성물, 이를 이용한 결장암 세포의 증식 억제 또는 암을 예방하거나 유해 미생물의 장내 증식 억제 및 이들에 의한 설사의 예방 및/또는 치료법에 관한 것이다.
인체의 장내에는 다양한 미생물들이 존재하면서 장내의 미생물 균총을 이루고 있다. 이러한 미생물 중에는 숙주 동물에 유용한 것으로 알려져 온 유산균 등의 유익한 미생물들이 있는가 하면 반대로 숙주에 직접적 또는 잠재적인 유해성을 가지는 대장균, 살모넬라, 포도상구균 등의 미생물들이 또한 포함된다. 인체의 경우 스트레스의 증가, 유해세균의 감염 등 외부 환경의 변화에 의해서 장내 미생물의 균총이 파괴될 경우 유해 미생물들의 급격한 성장으로 이어져 숙주동물의 건강상태를 악화시키거나 설사에서부터 심할 경우 죽음으로까지 진행될 수 있다. 이러한 일이 발생하였을 경우 치료의 목적으로 항생제를 투여하게 되나 이러한 항생제는 체외로 완전히 배설되지 않고 숙주내에 잔존하게 되며 지속적인 투여시 유해미생물들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료를 할 수 없게 되는 상황이 발생하게 된다. 또한 현재는 항생제 오남용으로 인한 부작용이 문제시되고 있다. 이에 대한 대안으로 현재 유산균 프로바이오틱스에 대한 관심이 증대되고 있다. 프로바이오틱스는 인체 또는 기타 동물의 장내에 서식하는 유익한 미생물을 분리하여 제제화한 것으로 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 주로 유산균들이 많이 이용되고 있다. 이러한 유산균 프로바이오틱스는 항생제 오남용으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 일으키지 않고 장내 유해 세균의 이상발효를 억제하여 안정된 장내 균총을 유지하며 유해 미생물의 감염으로 인한 질병을 사전에 억제할 수 있다. 그리고 오늘날의 유산균제제 건강보조식품은 앞에서 기술했던 유해 미생물 억제효과 이외에도 항암효과, 우수한 장내 정착능, 혈중 콜레스테롤 감소작용, 면역활성 증강작용 등의 기능을 필요로 한다. 유산균의 항암효과는 발암물질의 생성을 유도하는 암세포의 억제, 발암물질 및 발암성 물질이 되는 화학물질의 저해 등을 들 수 있다. 이런한 유산균을 지속적으로 섭취할 경우 결장 내의 유용 유산균 수를 증가시켜 세포 수준에서 항암 효과를 내는 물질을 생성함으로써 암세포의 증식을 억제한다. 이러한 유산균제제 프로바이오틱스 효과는 소화기관에서의 정착능에 의해서 결정되는 것으로 여겨지고 있다 즉 아무리 항암작용이나 면역활성 증강작용 등의 효과가 뛰어난 프로바이오틱스라 할지라도 장내점액표면(intestinal mucosal surface)에 잘 정착되고 분화되어 형성하여야만 유산균제제로서 뛰어난 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 기존의 발표된 유산균제제 보다 유해 미생물들을 더욱 효과적으로 억제할 수 있고 내산성, 내담즙산성을 지니며 추가적으로 장내 암세포의 증식을 억제하고 장내 세포에 정착력이 우수한 신규 유산균제제의 탐색을 시도한 결과, 유아의 분변으로부터 혐기적으로 분리한 한 균주가 기존의 식음 유산균제제 보다 유해 미생물에 대한 억제활성과 내산성, 내담즙산성 능력이 뛰어날 뿐 아니라, 결장 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 장내 세포에 대한 부착력이 우수한 것을 확인하였으며, 상기 균주로 장내 세포 부착력, 결장 암 세포 및 유해 미생물에 대한 생육 억제 능력 실험과 내산성, 내담즙산성 실험 및 미생물 동정 실험을 한 결과, 이 균주가 결장 암 세포 및 유해 미생물을 효과적으로 억제, 내산성, 내담즙산성이 우수하며 장내 정착력이 뛰어난 균주로 락토바실러스 애시도필러스의 균주라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 기존 항생제의 대체용으로 인체나 가축에게 투여하거나 의약품용으로 사용되는 정장제 또는 유산균제제 및 건강보조식품 등으로 이용하여 결장 암 세포 및 장내 유해한 미생물을 억제할 수 있으며 장내 세포에 정착력이 우수한 내산성, 내담즙산성 프로바이오틱 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유효량의 상기 프로바이오틱 락토바실러스 미생물 및 허용가능한 담체를 포함하고 프로바이오틱 활성을 갖는 약학적, 식품학적 또는 영양학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 미생물 또는 그를 함유한 조성물을 이용하여 결장 암세포의 성장을 억제하거나 결장암을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 미생물 또는 그를 함유한 조성물을 이용하여 장내 유해 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 이들 미생물에 의한 장내 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다. 본 발명의 다른 목적들 및 잇점들은 하기 실시예에 의해 보다 명백해질 것이다.
본 발명의 상기 목적은 장내 유해 미생물 및 암세포의 성장을 억제할 수 있는 내 산성, 내 담즙산성 신규 미생물 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40, 식품, 의약품 등 상기 생균활성제를 함유한 조성물, 상기 미생물을 이용하여 장내 유해 미생물 및 암세포 성장을 억제할 수 있는 방법을 제공함으로써 달성되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 결장 암 세포 증식 및 유해 미생물을 억제하며 장내 세포에 정착성이 우수하며 내산성, 내담즙산성을 가지는 신규 미생물 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40을 제공한다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱(probiotic)"은 '사람을 포함한 동물의 위장관내에서 숙주의 장내 미생물 균형을 개선하여 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물'의 의미로 이해된다. 프로바이오틱 미생물은 프로바이오틱 활성을 갖는 살아 있는 또는 죽은 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
본 발명 미생물은 장 세포에 흡착할 수 있을 뿐만 아니라, 다음과 같은 프로바이오틱 특성을 보유한다.
- 사람의 다른 장내 유해미생물 및 암세포의 생장 억제능
- 호기적, 혐기적 조건 및 다양한 pH에서의 생장능; 이러한 성질은 위장관 내에서의 변화되는 다양한 생리적 및 병리적 조건에 잘 적응할 수 있는 능력을 부여한다.
- 위산 및 담즙산 내성
- 동결건조에서의 생균활성 보유능
또한, 본 발명 신규 미생물은 공지의 다른 예방 또는 치료방법과 같이 항생제 내성이나 생물 독성 등의 부작용이 없는 것이 특징이다.
따라서, 본 발명은 결장 암 세포 증식 및 유해 미생물을 억제하며 장내 세포에 정착성이 우수한 내산성, 내담즙산성 신규 미생물 락토바실러스 애시도필러스를 제공한다. 상기 균주는 결장 암 세포 및 유해미생물의 증식을 억제하고 장내 정착능력이 우수한 미생물을 탐색한 결과 결장 암 세포 및 유해미생물의 억제와 장내 정착 능력이 우수하면서 내산성, 내담즙산성을 지니는 락토바실러스 애시도필러스로 분리, 동정된 세균이다.
구체적으로, 유해 미생물 억제 활성을 가지는 내산성, 내담즙산성 미생물을 탐색하는 과정은 하기와 같이 수행할 수 있다. 즉, 혐기백(상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)을 이용하여 유아의 분변 1g을 채취한 후 pH 2로 조정한 혐기희석액으로 1:10 의 비율로 희석하고, 진탕기를 이용하여 120분간 진탕하였다. 진탕액 1ml을 옥스갈 (디프코사 제품, 상품명) 0.2%를 첨가한 BL 고체배지 (일본 영연화학사 제품)에 도말하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 일정시간이 지난 후 나타나는 콜로니를 현미경으로 관찰한 후 간균형 미생물 213개를 선발하여 GAM semi-agar 배지 (일본 일수제약사 제품)에 옮겨 배양한 뒤, 영하 80℃에 보존하였다.
분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등의 문헌 (Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990)과 항생제 평가시 사용되는 미생물 12종을 대상으로 하였다. 이러한 미생물 12 종은 다음과 같다.: 대장균 (E. coli) ATCC 25922, 대장균 (E. coli 0157:H7) ATCC 43888, 대장균 (E. coli) KCCM 11234, Enterbacter aerogenes ATCC 13048, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella flexneri KCTC 2008, Enterococcus lactis KCTC 1913, Salmonella typhimurium, Staphylococus aureus KCTC 1621, Enterobacter cloacea KCTC 2361, Pediococcus acidiactici KCCM 11746, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802. 이러한 유해 미생물은 MRS 액체배지에서 18시간 혐기적으로 배양한 후 배양액 0.1ml을 취하여 MRS 고체배지에 도말 하였다. 그런 후 MRS 액체배지에서 18시간 혐기적으로 배양된 각각의 분리 미생물 배양액 30ul를 지름 8 mm의 페이퍼디스크에 접종한 후 유해미생물이 도말된 고체배지에 올려놓은 후 배양하였다. 일정 시간의 배양 후 나타나는 억제환을 측정하여 대조군과 비교한 후 유해미생물의 억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-40으로 명명하였다.
결장 암 세포 증식 억제 실험은 다음과 같이 수행하였다. 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40), 기존의 유산균주인 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151, 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 3545 와 락토바실러스 델브류키 불가리커스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) KTCT 3188 를 MRS 액체배지 (Difco 사)에 3계대배양 하여 생균수가 5x107 되도록 한다. HT-29 세포주는 72시간 동안 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 FBS (Fetal bovine serum) 10%가 함유된 DMEM (Dulbeccos minimal essential medium)에 배양하면서 세포증식을 관찰하였다. 배양 후 96공 (96-well) 세포배양 plate에 HT-29 세포주가 단일층이 형성되도록 배양한다 (HT-29 세포주를 96공에 배양하며 이틀에 한번 배양액을 교체해 준다). 세포주가 단일층이 형성되면 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40), 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151 과 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 의 배양액에서 균체를 제거한 후, 배양여액만 HT-29 세포주의 단일층이 형성되어 있는 96공 (96-well) 세포배양 plate에 100 ㎛씩 접종한 다음 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 3일 배양한다. 3일 후 HT-29 세포주와 유산균이 있는 96공 (96-well) 세포배양 plate에 MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) 시약을 25㎛ 정도 접종한 후, 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 4시간 배양한다 (MTT 분석은 접종 후 노란빛을 띄지만, 살아있는 세포속에 들어가면 미토콘드리아의 탈수소 효소에 의해 보라색을 띄운다). 4시간 후 효소면역반응분석기 (ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 흡광도 490nm에서 측정하여 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40)의 HT-29 세포주에 대한 세포독성을 관찰한다. 본 시험으로 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40)이 장내 암세포인 HT-29 세포주에 대한 세포독성 관찰로 장내 암세포 증식 억제를 판정하였다.
Probio-40의 항생제에 대한 감수성 실험은 Microbiology procedures handbook vol.1(Henry D. Isenberg, ASM)과 한국특허공고 91-4366호의 방법에 의거하여 9종의 항생제에 대해 수행하였으며, 사용된 항생제 종류는 겐타마이신 (Gentamycine, 동아바이오텍사), 클로람페니콜 (Chloramphenicol, Sigma사), 에리스로마이신 (Erythromycin, Sigma사), 설파메도자졸 (Sulfamethoxazile, Sigma사), 네오마이신 (Neomycine, Sigma사), 가나마이신 (Kanamycine, Sigma사), 페니실린(Penicilline G, Antibioticos사), 스펙티노마이신 (Spectinomycine, 대성미생물사), 테트라사이클린 (Tetracycline, 대성미생물사) 등으로 이들을 적절한 용매에 용해하여 사용하였다. 준비한 항생제 용액을 농도별로 30ul를 페이퍼디스크에 접종하여 4℃에서 1시간 방치 후에 24시간 혐기적으로 배양한 후 나타나는 억제환의 직경을 측정하였다.
장내 세포에 정착력 실험은 다음과 같이 수행하였다. 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40), 기존의 유산균주인 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151, 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 3545 와 락토바실러스 델브류키 불가리 커스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) KTCT 3188 를 MRS 액체배지 (Difco 사)에 3계대배양 하여 생균수가 5x107 되도록 한다. Caco2 세포주는 72시간 동안 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 FBS (Fetal bovine serum) 20%가 함유된 DMEM (Dulbeccos minimal essential medium) 에 배양하면서 세포증식을 관찰하였다. 배양한 후 96공 (96-well) 세포배양 plate에 Caco2 세포주가 단일층이 형성되도록 배양한다 (Caco2 세포주를 96공에 배양하며 이틀에 한번 배양액을 교체해준다). 세포주가 단일층이 형성되면 100㎕의 DMEM 배지로 바꿔준다. 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40), 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151 과 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 3545 의 배양액 1㎖에 1㎕의 SYTO BC stain 용액을 첨가한다. 염색된 배양액 50㎕를 96공 (96-well) 세포배양 plate에 단일층이 형성된 Caco2 세포에 첨가하고 72시간 동안 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 배양시킨후 250㎕의 완충용액으로 세 번 세척한 후, fluoroskanⅡ으로 형광을 측정하여 장내 세포에 부착력을 판정한다.
Probio-40 균주를 동정하기 위하여, 상기에서 선별된 균주들을 배양한 후, 형태; 생리·생화학적 특성; 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석 실험 등을 수행하였다.
Probio-40의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-40은 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 균주로서 99.8 %의 16S rDNA 상동성으로 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus)의 표준균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 따라서 이상의 결과에 기초하여 Probio-40을 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus)의 균주로 동정하고, 사단법인 한국 종균협회(Korean Federation of Culture Colleftions; 서울시 서대문구 홍제동 361-221번지 유림빌딩 2층)의 부설 균주기탁 및 보존기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하 "KCCM한국종균협회(KCCM)에 2002년 2월 19일 수탁번호 제 KCCM-10352호로 기탁되어있다.
Probio-40의 형태 및 생리·생화학적 특성을 조사한 결과, Probio-40은 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 간균이다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30∼37℃이 바람직하다. 가스와 인돌을 생성하지 않으며 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않는다. 본 발명의 미생물은 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 -80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결 건조하는 것이 바람직하다.
본 발명 균주는 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 갖고 필드 안정성이 뛰어나거나 또는 보다 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내도록 개선 또는 개량될 수 있음은 당업자에게 충분히 이해될 것이다.
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 균주를 가지고 결장암세포 성장 억제 실험결과 시험세포에 있어서 Probio-40은 결장 암세포에 대한 항암활성이 있는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명 미생물은 위장관 내 유해 미생물들의 생장 억제능이 있으며, 항생제에 대한 감수성 실험결과 다양한 항생제에 대해 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 본 발명 미생물은 이미 지적한 바와 같이 사람의 장관으로부터 분리된 것으로 정상적인 장내 미생물균총을 형성하기 때문에 특히 사람의 투여에 더욱 잇점이 있다.
따라서, 본 발명 신규 미생물은 기존 항생제의 대체용으로 인체나 가축에 대해 장내 유해한 미생물을 억제하며 안정된 장내 균총의 유지를 통해 동물체의 건강상태를 양호하게 하고 장내 암세포 증식 억제, 면역력 증가 등의 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 한 유익한 측면에 있어서, 본 발명은 상기 신규의 미생물을 함유하는 의약품, 유산균제제, 건강보조식품 등을 제공한다. 본 발명 미생물은 허용가능한 담체와 함께 독립적으로, 또는 식품의 첨가제로 사용되거나 사람이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명 미생물은 다른 프로바이오틱 미생물을 함유하지 않은 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 부여함) 및 이미 몇가지의 프로바이오틱 미생물을 함유한 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 증강시키거나 보완함)에 첨가되어 사용될 수 있다.
본 발명 약학적, 영양학적 또는 식품학적 조성물은 분리된 프로바이오틱 세균으로 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 또는 이와 함께 2종 이상의 다른 유익한 균주를 적당한 담체와 함께 포함할 수 있다.
예컨대, 본 발명 조성물에 본 발명 균주와 함께 사용가능한 다른 미생물들은 사람이 섭취하기에 적합하고 섭취시 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이 바람직하다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 Saccharomyces, Candida, Pichia 및 Torulopsis를 포함하는 효모(yeasts), Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium등과 같은 곰팡이, 및 Lactobacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Leuconostoc, Bacteroides, Staphylococcus, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Propionibacterium, Enterococcus, Pediococcus, 그리고 Micrococcus 속 세균들이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, 및 Staphylococcus xylosus 등을 들 수 있다. 바람직하게는 프로바이오틱 활성을 가지면서 설사병을 유발하는 로타바이러스 억제능을 나타내는 락토바실러스 레우테리 Probio-16(KCCM 10214), 락토바실러스 살리바리우스 Probio-37 (KCCM10328), 또는 이들의 혼합균을 본 발명 조성물에 추가로 포함할 수 있다. 본 발명 조성물에 함유될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 균주는 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
통상적인 항생제 대신에, 본 발명 신규한 미생물 미생물 및 조성물은 생균활성제로 통물에 투여되거나 또는 식품, 의약품, 동물약품, 또는 유산균제제와 함께 동물에 투여될 수 있다. 본 발명 신규 미생물을 이용하여 유해 미생물을 억제하는 방법에 있어서, 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40이 유해 미생물을 억제하기 위한 최적온도조건으로는 30-37℃ 가 바람직하다. 이러한 생균활성제는 기존 항생제의 대체용으로 인체에 대해 장내 유해한 미생물을 억제하며 안정된 장내 균총의 유지를 통해 동물체의 건강상태를 양호하게 할 수 있다. 본 발명 신규 미생물은 또한 위장관 미생물균총을 유지하기 위해 항생제 투여 후에도 투여될 수 있다.
그리하여, 본 발명은 또한 본 발명 신규 미생물 또는 이를 유효량 함유한 조성물을 사용하여 장내 유해 미생물 감염의 발생을 저지하거나 감염에 의한 위장염 및 설사 등을 치료하는 벙법을 제공한다. 본 발명은 또한 장내 유해 병원성 미생물의 발생을 저지하거나 감염에 의한 위장염 및 설사 등을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 발명의 권리범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 내산, 내담즙산 성질을 가지는 세균의 분리
유아(1세 미만)에서 60세 사이의 건강한 남녀로부터 분변을 받아 혐기백 (상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)을 이용하여 혐기적으로 채취하였다. 채취한 분변 1g은 pH 2로 조정한 혐기희석액 (0.78% K2HPO4, 염혼합액 37.5ml, L-cystein 0.5g, 25% L-ascorbic acid 2ml, 8% Na2CO3 50ml, 0.1% resazurin 1ml을 증류수 860ml에 녹이고, agar 0.5g을 첨가) 을 이용하여 1:10 의 비율로 희석하고, 진탕기를 이용하여 120분간 진탕하였다. 진탕액 1ml을 옥스갈 (디프코사 제품, 상품명) 0.2%를 첨가한 BL 고체배지 (일본 영연화학사 제품)[Lab-lemco powder 2.4g, Proteose peptone No.3 10g, Trypticase 5g, Phytone peptone 3g, yeast extract 5g, liver extract 150ml, glucose 10g, soluble starch 0.5g, sol.A 10ml, sol.B 5ml, 10% FS antifoam F-20 5ml, Tween 80 1g, L-cystein 0.5g, horse serum 50ml을 증류수 1 L에 녹이고, agar 15g을 첨가; sol.A의 조성, 10% KH2PO4과 10% K2 HPO4 을 혼합한 것이며; sol.B의 조성, 황산마그네슘 10g, 황산철 0.5g, 소금 0.5g, 황산망간 0.337g을 증류수 250ml에 녹임) 에 도말하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 일정시간이 지난 후 나타나는 콜로니를 현미경으로 관찰한 후 간균형 미생물 213개를 선발하여 GAM semi-agar 배지 (일본 일수제약사 제품) [peptone 10g, Soya peptone 3g, Proteose peptone No.3 10g, Peptonized whale serum 13.5g, yeast extract 5g, Beef extract 2.2g, liver extract 1.2g, KH2PO4 2.5g, NaCl 3g, L-cystein 0.3g, Na thioglycolate 0.3g, glucose 2g를 증류수 1 L에 녹이고, agar 1.5g을 첨가] 에 옮겨 배양한 뒤, 영하 -80℃에서 보존하였다.
실시예 2 : 분리된 미생물의 결장 암 세포 증식 억제 실험
결장 암 유발세포 중 하나인 HT-29 세포주를 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 T-75 용기에 FBS (Fetal bovine serum) 10%가 함유된 DMEM (Dulbeccos minimal essential medium) 으로 배양하면서 증식을 관찰하였다. 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40)와 함께 비교균주로는 기존의 유산균주인 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151, 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 3545 와 락토바실러스 델브류키 불가리커스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) KTCT 3188를 사용하였다. MRS 액체배지에 3계대배양 하여 생균수가 5x107 되도록 한 후 원심분리기를 이용하여 균체를 제거하여 냉장보관 한다. T-75 용기에서 배양한 HT-29 세포주를 96공 (96-well) 세포배양 plate에서 단일층이 형성되도록 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 배양한다 (HT-29 세포주를 96well에 배양하며 이틀에 한번 배양액을 교체해 준다). 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40) 과 비교균주인 3개 유산균주의 배양여과액 100㎛씩 96공 (96-well) 세포배양 plate에서 단일층이 형성된 HT-29 세포주에 접종하여 3일 동안 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 배양한다. 3일 후 HT-29 세포주와 유산균이 있는 96공 (96-well) 세포배양 plate에 MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) 시약을 25㎛ 정도 접종한 후, 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 4시간 배양한다. 4시간 후 효소면역반응측정법(ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 흡광도 490nm에서 측정하여 Probio-40 (Lacbobacillus acidophillus Probio-40)의 HT-29 세포주에 대한 세포 독성을 관찰한다.
Probio-40의 장내 암세포 증식 억제는 다음 표 1과 같다.
[표 1]
Probio-40의 결장 암 세포 증식 억제 활성
실시예 3 : 분리된 미생물의 유해 미생물 생장 억제 실험
분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등 (Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990) 의 방법을 이용하여 항생제 평가시 사용되는 다음의 미생물 12종을 대상으로 하였다 : 대장균 (E. coli) ATTC 25922, 대장균 (E. coli 0157:H7) ATCC 43888, 대장균 (E. coli) KCCM 11234, Enterobacter aerogenes ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella flexneri KCTC 2008, Enterococcus lactis KCTC 1913, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Enterobacter cloacae KCTC 2361, Pediococcus acidiactici KCCM 11746, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802. 이러한 유해 미생물은 MRS 액체배지 (Difco 사)에서 18시간 혐기적으로 배양한 후 배양액 0.1ml을 취하여 MRS 고체배지에 도말 하였다. 그런 후 MRS 액체배지에서 18시간 혐기적으로 배양된 각각의 분리 미생물 배양액 30ul를 지름 8 mm의 페이퍼디스크에 접종한 후 유해미생물이 도말된 고체배지에 올려놓은 후 배양하였다. 일정 시간 동안 배양한 후 나타나는 억제환을 측정하여 대조군과 비교한 후 유해미생물의 억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-40으로 명명하였다. Probio-40의 유해 미생물에 대한 억제 활성은 다음 표2와 같다.
표 2에서 보는 바와 같이 Probio-40 은 사용된 유해미생물 12종에 대해서 대부분 유사한 억제 활성을 지니는 매우 유용한 미생물인 것으로 확인되었다.
[표 2]
Probio-40 의 유해미생물 억제 활성
실시예 4 : Probio-40 장내 세포 정착력 실험
장내 세포에 정착력 실험은 장내 세포로는 Caco2 세포주를 사용하였으며, 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lactobacillus acidophillus Probio-40)과 비교균주로 기존의 유산균주인 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151, 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 3545 와 락토바실러스 델브류키 불가리커스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) KTCT 3188 를 사용하였다. 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40와 비교균주 3개를 MRS 액체배지 (Difco사)에 3계대배양 하여 생균수가 5x107 되도록 한다. Caco2 세포주는 72시간 동안 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 FBS (Fetal bovine serum) 20%가 함유된 DMEM (Dulbeccos minimal essential medium) 에 배양하면서 세포증식을 관찰하였다. 배양한 후 96공 (96-well) 세포배양 plate에 Caco2 세포주가 단일층이 형성되도록 배양한다 (Caco2 세포주를 96공에 배양하며 이틀에 한번 배양액을 교체해 준다). 세포주가 단일층이 형성되면 100㎕의 DMEM 배지로 바꿔준다. 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 (Lacbacillus acidophillus Probio-40), 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus) KCTC 3151, 락토바실러스 델브류키 불가리커스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) KTCT 3188 과 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCTC 3545 의 배양액 1㎖에 1㎕의 SYTO BC stain 용액을 첨가하고 5분간 실온에 둔다. 염색된 배양액 50㎕를 96공 (96-well) 세포배양 plate에 단일층이 형성된 Caco2 세포에 첨가하고 72시간 동안 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 배양시킨후 250㎕의 완충용액으로 세 번 세척한 후, fluoroskan Ⅱ으로 형광을 측정하여 장내 세포 Caco2 에 정착력을 관찰한다. 본 실험결과에서 가장 정착력이 우수한 균주를 100%라고 가정하여 보고하였다. Probio-40의 장내 세포 정착력은 다음 표 3과 같다.
[표 3]
Probio-40 의 장내 세포 정착력
실시예 5 : Probio-40항생제에 대한 감수성 실험
Probio-40항생제에 대한 감수성 실험은 Microbiology procedures handbook vol.1(Henry D. Isenberg, ASM)과 한국특허공고 91-4366호의 방법에 의거하여 9종의 항생제에 대해 수행하였으며, 사용된 항생제 종류는 겐타마이신 (Gentamycine, 동아바이오텍사), 클로람페니콜 (Chloramphenicol, Sigma사), 에리스로마이신 (Erythromycin, Sigma사), 설파메도자졸 (Sulfamethoxazile, Sigma사), 네오마이신 (Neomycine, Sigma사), 가나마이신 (Kanamycine, Sigma사), 페니실린( Penicilline G, Antibioticos사), 스펙티노마이신 (Spectinomycine, 대성미생물사), 테트라사이클린 (Tetracycline, 대성미생물사) 등으로 이들을 적절한 용매에 용해하여 사용하였다. 준비한 항생제 용액을 농도별로 30ul를 페이퍼디스크에 접종하여 4C, 1시간 방치후에 24시간 혐기적으로 배양한 후 나타나는 억제환의 직경을 측정하였다. 나타난 결과는 표 4과 같다.
[표 4]
Probio-40의 항생제 감수성 결과
실시예 5 : 분리한 미생물 Probio-40의 동정
실시예 1에서 분리된 Probio-40 균주를 MRS 배지 (Difco사 제품)에서 37℃ 조건으로 배양하였다. Probio-40 균주를 동정하기 위하여, Probio-40의 형태 및 생리학적 특성은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 904, 1997)의 방법과 API 32A 및 CHL 키트 (바이오메리오사 제품)를 사용하여 결정하였다. 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석은 운 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다.
Probio-40의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다.
16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-40은 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 균주로서 99.8%의 16S rDNA 상동성으로 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophillus)의 표준균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 속의 새로운 미생물인 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40은 장내 정착성이 우수하며, 결장 암 세포 증식 및 병원성 세균을 억제하는 유산균 프로바이오틱스로 장내 세포에 정착력이 우수하며 인체내 및 장내에서 유해한 성질을 나타내는 장내 암세포 및 여러 종류의 병원성 미생물을 효과적으로 억제하고 내산성, 내담즙산 기능을 가지고 있어 기존 항생제의 대체용으로 인체에 투여시 장내미생물 균총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있으며 건강상태를 양호하게 하고 장내 암 세포 증식 억제 및 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있다.
<110> PROBIONIC Inc. <120> Novel acid tolerant probiotic Lactobacillus acidophillus Probio-40 with probiotic activities <130> probio-40 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1519 <212> DNA <213> Lactobacillus acidophillus Probio-40 <220> <221> gene <222> (1)..(1519) <223> 16 rDNA <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gagctgaacc aacagattca 60 cttcggtgat gacgttggga acgcgagcgg cggatgggtg agtaacacgt ggggaacctg 120 ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata ccggataaga aagcagatcg 180 catgatcagc ttataaaagg cggcgtaagc tgtcgctatg ggatggcccc gcggtgcatt 240 agctagttgg tagggtaacg gcctaccaag gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg 300 atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 360 cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga 420 tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg 480 taatcaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540 aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggaagaata agtctgatgt 600 gaaagccctc ggcttaaccg aggaactgca tcggaaactg tttttcttga gtgcagaaga 660 ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720 cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag 780 gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg ggaggtttcc 840 gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt 900 tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960 agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catctagtgc aatccgtaga gatacggagt 1020 tcccttcggg gacactaaga caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080 ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccagcat taagttgggc 1140 actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1200 gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca gtacaacgag gagcaagcct 1260 gcgaaggcaa gcgaatctct taaagctgtt ctcagttcgg actgcagtct gcaactcgac 1320 tgcacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg 1380 ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtctgca atgcccaaag ccggtggcct 1440 aaccttcggg aaggagccgt ctaaggcagg gcagatgact ggggtgaagt cgtaacaagg 1500 tagccgtagg agaacctgc 1519

Claims (7)

  1. 결장 암 세포 증식 및 유해 미생물의 생장을 억제하는 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40(KCCM-10352).
  2. 제1항의 프로바이오틱 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 유효량 및 허용 가능한 담체를 포함하고 프로바이오틱 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 식품학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물이 사람 또는 가축에 대해 프로바이오틱 활성을 갖는 다른 미생물을 추가로 포함하는 조성물로,
    추가되는 다른 미생물은 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토루롭시스(Torulopsis)의 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 라이조푸스(Rhizopus), 무코(Mucor), 페니실리움(Penicillium)의 곰팡이와, 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 류코노스톡(Leuconostoc), 박테로이드(Bacteroides), 스타필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 푸소박테리움(Fusobacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 마이크로코커스(Micrococcus)속 세균 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 2항 또는 제3항에 있어서, 상기 조성물이 구강섭취시 사람 또는 가축의 설사 예방 또는 치료에 유용한 조성물.
  5. 제1항의 프로바이오틱 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40을 포함하는 식품.
  6. 제1항의 프로바이오틱 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40, 또는 제2항의 조성물, 또는 제3항의 조성물을 이용하여,
    인간을 제외한 동물의 결장 암 세포 증식을 억제하거나 결장암을 예방하는 방법.
  7. 제1항의 프로바이오틱 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40, 또는 제2항의 조성물, 또는 제3항의 조성물을 이용하여,
    인간을 제외한 동물의 장내 유해 병원성미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.
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