KR100827318B1 - 내산 내담즙성이 강하고 항암 활성이 있는 젖산균 및 이를함유한 발효유 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙성이 강하고 항암 활성이 있는 젖산균 및 이를 함유하는 발효유에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 내산성, 내담즙성이 강하고 항암 활성이 있는 젖산균 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 및, 상기 균주를 함유하는 항암활성이 있는 기능성 발효유에 관한 것이다.
본 발명의 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균은 내산성, 내담즙성이 강하고 우수한 항암 효과를 나타낸다. 또한, Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균을 함유한 발효유는 암세포주에 대하여 세포독성을 나타내므로, 암 예방 및 치료에 대한 보조 식품으로써 우수한 기능성 발효유를 제공할 수 있다.
젖산균, 내담즙성, 발효유

Description

내산 내담즙성이 강하고 항암 활성이 있는 젖산균 및 이를 함유한 발효유 {Lactic acid bacteria having acid and bile tolerance and fermented milk containing thereof}
도 1은 CHO-K1 Cell line에 대한 선별 균주의 세포독성 결과를 나타낸다.
도 2는 SNU-C4 Cell line에 대한 선별 균주의 세포독성 결과를 나타낸다.
도 3은 선별 균주의 Quinone reductase activity 분석결과를 나타낸다.
도 4는 처리군 별 10주 동물실험 과정 중의 분변 β-glucosidase 분석결과를 나타낸다.
도 5는 처리군 별 10주 동물실험과정 중 분변의 β-glucuronidase 분석결과를 나타낸다.
도 6은 선별된 젖산균을 첨가한 기존제품의 CHO-k1 세포독성 실험결과를 나타낸다.
도 7은 선별된 젖산균을 첨가한 기존제품의 SNU-C4 세포독성 실험결과를 나타낸다.
본 발명은 내산성, 내담즙성이 강하고 항암 활성이 있는 젖산균 및 이를 함유하는 발효유에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 내산성, 내담즙성이 강하고 항암 활성이 있는 젖산균 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 및, 상기 균주를 함유하는 항암활성이 있는 기능성 발효유에 관한 것이다.
인체의 장내에는 다양한 미생물들이 존재하면서 장내의 미생물 균총을 이루고 있다. 이러한 미생물 중에는 숙주 동물에 유용한 것으로 알려져 온 유산균 등의 유익한 미생물들이 있는가 하면 반대로 숙주에 직접적 또는 잠재적인 유해성을 가지는 대장균, 살모넬라, 포도상 구균 등의 미생물들이 또한 포함된다. 인체의 경우 스트레스의 증가, 유해세균의 감염 등 외부 환경의 변화에 의해서 장내 미생물의 균총이 파괴될 경우 유해 미생물들의 급격한 성장으로 이어져 숙주동물의 건강상태를 악화시키거나 설사에서부터 심할 경우 죽음으로까지 진행될 수 있다. 이러한 일이 발생하였을 경우 치료의 목적으로 항생제를 투여하게 되나 이러한 항생제는 체외로 완전히 배설되지 않고 숙주 내에 잔존하게 되며 지속적인 투여시 유해미생물들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료를 할 수 없게 되는 상황이 발생하게 된다. 또한, 현재는 항생제 오남용으로 인한 부작용이 문제시되고 있다.
이에 대한 대안으로 현재 유산균 프로바이오틱스에 대한 관심이 증대되고 있다. 프로바이오틱스는 인체 또는 기타 동물의 장내에 서식하는 유익한 미생물을 분리하여 제제화한 것으로 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 주로 유산균들이 많이 이용되고 있다. 이러한 유산균 프로바이오틱스는 항생제 오남용으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 일으키지 않고 장내 유해 세균의 이상발효를 억제하여 안정된 장내 균총을 유지하며 유해 미생물의 감염으로 인한 질병을 사전에 억제할 수 있다. 그리고 오늘날의 유산균제제 건강보조식품은 앞에서 기술했던 유해 미생물 억제효과 이외에도 항암효과, 우수한 장내 정착능, 혈중 콜레스테롤 감소작용, 면역활성 증강작용 등의 기능을 필요로 한다. 유산균의 항암효과는 발암물질의 생성을 유도하는 암세포의 억제, 발암물질 및 발암성 물질이 되는 화학물질의 저해 등을 들 수 있다. 이러한 유산균을 지속적으로 섭취할 경우 결장 내의 유용 유산균 수를 증가시켜 세포 수준에서 항암 효과를 내는 물질을 생성함으로써 암세포의 증식을 억제한다. 이러한 유산균제제 프로바이오틱스 효과는 소화기관에서의 정착능에 의해서 결정되는 것으로 여겨지고 있다. 즉 아무리 항암작용이나 면역활성 증강작용 등의 효과가 뛰어난 프로바이오틱스라 할지라도 장내점액표면(intestinal mucosal surface)에 잘 정착되고 분화되어 형성하여야만 유산균제제로서 뛰어난 효과를 나타낼 수 있다.
젖산균의 항균, 콜레스테롤 감소, 항암, 면역증진 등과 같은 여러 가지 프로바이오틱 기능활성이 밝혀지면서 현재 많은 발효유 제품에 기능활성 젖산균이 첨가 되어 발효유 제품이 생산되고 있는 실정이다. 대표적인 프로바이오틱 기능활성 균으로서는 Lactobacillus GG 균으로서 현재 수입되어 발효유에 첨가되고 있다. 이러한 외국에서 분리하여 수입하는 균주보다 한국 전통 식품에서 분리한 젖산균이 우리 몸에 적합하다고 볼 수 있기 때문에 한국형 젖산균 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 항암활성이 있는 발효유 제품을 개발하기 위하여 내산성, 내담즙성이 강하고 항암활성이 있는 젖산균 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 젖산균 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 함유하는 발효유를 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 내산성, 내담즙성이 강하고 항암활성이 있는 젖산균 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 젖산균 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 함유하는 발효유를 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 항암활성이 있는 발효유 제품을 개발하기 위하여 한국식품연구원 균주은행 소장 160여 개의 젖산 균주와 김치에서 분리한 2,000여 개의 미생물을 이용하여 프로바이오틱 기능활성 및 항암활성 젖산균을 탐색하고, 탐색 균주를 함유하는 항암활성이 있는 기능성 발효유를 제조하고자 하였다. 또한, 외국에서 분리하여 수입하는 균주보다 한국 전통 식품에서 분리한 젖산균이 우리 몸에 적합하다고 볼 수 있기 때문에 한국형 젖산균을 개발하고자 하였다.
본 발명을 위하여 내산성, 내담즙성이 우수한 균주를 선별하여 젖산균의 in vitro 항암활성을 조사하였다. 암세포 치사 활성 효과와 발암물질 억제능을 확인한 결과, 한국인 대장암 세포주인 SNU-C4 세포에 대하여 KFRI 342 균주가 1㎎/㎖로 처리시 30%로 가장 높은 세포 독성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 간에 있는 발암물질의 해독에 관여하면서 항암지표효소인 퀴논 환원효소(Quinone reductase, QR) 효소활성 변화를 측정하여 KFRI 342 균주의 환원효소의 활성이 무처리군 보다 약 2배 정도 높은 활성을 보임을 알 수 있었다.
본 발명에서 최종 선별균주 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2005년 6월 30일, 기탁번호 KCTC 10827BP로 특허 균주기탁을 하였다.
또한, 본 발명의 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 쥐에게 급여하였을 때, 발암과 관련된 유해효소의 활성이 낮은 것으로 나타나며, Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 함유하는 발효유는 대장암 세포주인 SNU C4에 대하여 세포 독성을 나타낸다.
본 발명의 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균은 내산성, 내담즙성이 강하고 우수한 항암 효과를 나타낸다. 또한, Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균을 함유한 발효유는 암세포주에 대하여 세포독성을 나타내므로, 암 예방 및 치료에 보조 식품으로써 좋은 효과를 기대할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 젖산균 선별
한국식품연구원에서 분양받은 젖산균 160여 균주와 국내 여러 종류의 적숙기 김치에서 분리한 2,000여 균주를 이용하여 MRS 생육 배지에서의 성장 및 환원 탈지유에서의 산생성능을 각각 MRS 액체배지에서의 생육 유무와 환원 탈지유 응고 여부를 젖산균을 2% 접종하여 알아보았다. 내산성의 측정은 MRS 액체배지가 pH 6.5임을 감안하여 HCl로 pH를 각각 2, 3으로 조정하여 멸균한 후, 균을 접종하여 생육 유무를 측정하였다. 내담즙성은 담즙(bile salt)을 각각 0.1, 0.3, 0.5%를 첨가한 MRS 액체배지에 균을 접종하여 생육 유무를 측정하였다. 내산성, 내담즙성이 우수한 균주와 선별 결과는 표1에 나타내었다.
표 1. 내산성 및 내담즙성이 우수한 균주의 선별결과
균주번호 MRS broth MRS agar skim milk protase activity 다당체 생성능 내담즙성 (bile salt %) 내산성 (pH) 항균활성
0.1 0.3 0.5 3 2 L S E
KFRI129 +* + + - - w w w + w - - -
KFRI342 ** + + + - - + + w + + - - -
KFRI701 + + + - - w w w w x - - -
KFRI707 + + + - - + + w + w - - -
KFRI709 + + + - - + + - + w - - -
KFRI809 + + + - - + + - w w - - -
KFRI866 + + + - - + + w w w - - -
KFRI189 + + - + - + w w + + - - -
KFRI818 + + + - - + w w + w - - -
KFRI821 + + + - - + w w + w - - -
72712 + + + - - + + + + + - - -
74511 + + + - - + + + + + - - -
74815 + + + - - + + - + + - - -
74917 + + + - - + + - + + - - -
75215 + + + - - + + + + - - - -
88201 + + + - - + + + + - - - -
88820 + + + - - + + - + + - - -
89402 + + + - - + + - + + - - -
89406 + + + - - + + - + + - - -
89409 + + + - - + + - + + - - -
89415 + + + - - + + - + + - - -
89911 + + + - - + + - + + - - -
* +: 생장, W: 약하게 생장, -: 생장 안 함
** 진하게 표시한 균주는 최종선별 균주임
L: listeria, S: salmollea, E: E.coli
[실시예 2] 젖산균의 in vitro 항암활성을 조사
상기 실시예 1에서 선별한 젖산균의 in vitro 항암활성을 조사하기 위하여 암세포 치사 활성 효과는 MTT assay로, 발암물질 억제능은 QR (Quinone reductase) assay를 통해 확인하였다.
병리학적 소견상 정상세포주인 CHO-K1 세포와 사람에서 분리한 대장암 세포주인 SNU-C4 세포에 균주은행 분리 젖산균 KFRI 342, KFRI 809, KFRI 707과 김치 분리 젖산균 72712를 처리하여 단기 세포 독성을 평가하는 MTT assay를 수행한 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다. 젖산균 시료처리는 MRS agar에서의 균 배양 후 채취한 균액을 phosphate buffer saline (0.1M pH 7.4)으로 2회 세척하였고, 세포주 농도를 5x104 로 세포 수를 조정하여 분주하고 4일 배양 후 MTT assay를 수행하였다. 실험결과 CHO-K1세포에 대해서는 KFRI 707이 가장 높은 세포독성을 나타내었으며 SNU-C4 세포에 대해서는 KFRI 342 균주가 1㎎/㎖로 처리시 30%로 가장 높은 세포 독성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 1 및 도 2).
많은 암 예방 또는 항암 물질이 제 2 상계 효소계를 활성화 시킨다는 사실에 근거하여 젖산균 시료 처리시 제 2 상계 효소인 Quinone reductase (QR) 효소활성 변화를 측정하였다. QR 활성의 측정은 각각의 시료를 처리하여 배양한 간세포로부터 cytosol 분획을 얻어 측정하는 방법으로 실시하였다. Intact cell에서의 QR활성은 쥐의 간암 세포주인 Hepa1c1c7 세포를 3×104㎖로 분주한 후 24시간 배양하였다. MTT assay에 사용한 시료를 1㎎/㎖로 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 이 시료를 찬 PBS 완충용액으로 2회 세척하고, PBS 완충용액 1㎖를 첨가하여 세포를 긁어 E-tube에 수집한 후, 초음파분해(sonication) 하였고, 원심 분리하여 상등액을 취해 -70℃에 보관하면서 단백질을 정량(Lowry method)하고 분석에 이용하였다. 이후 QR 활성 측정을 위하여 25℃를 유지하면서 250mM Tris HCl(pH 7.4), BSA(70㎎/30㎖), 0.1%(V/V) Tween20, 500μM FAD, 2mM NADH, DW 용액에 세포추출액 0.2㎖를 첨가한 후, 400μM DCPIP (즉시 제조 사용) 0.3㎖을 Cuvette에 넣고 1초 간격으로 2분간 600nM에서 흡광도를 측정하였다 (37℃ 유지). QR 활성을 측정한 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, KFRI 342 균주의 QR 활성은 201unit으로 무처리군 97unit보다 2배 정도 높은 활성을 보임을 알 수 있다.
최종 선별균주 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2005년 6월 30일, 기탁번호 KCTC 10827BP로 특허 균주기탁을 하였다.
[실시예 3] 동물실험
최종 선별균주 KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 실험용 쥐에게 급여하였을 때 발암물질 (DMH)에 의한 대장에의 대장전암병변인 대장의 이상선와소(Aberrant crypt foci, ACF) 및 대장 이상선와(aberrant crypt, AC)의 생성이 억제되는지 조사하였다. 실험한 쥐 대장의 AC 및 ACF의 생성은 유의적인 결과를 얻지 못하였다. 그렇지만, 10주간 동물실험 후의 분변 분석을 하였을 때 발암과 관련된 유해효소인 β-glucosidase 및 β-glucuronidase 분석을 한 결과에 의하면 젖산균 처리군이 무 처리군에 비해 비교적 유해효소 활성이 낮은 것으로 분석되었다(도 4 및 도 5).
[실시예 4] 발효유의 항암효과
선별균주를 발효유 제품에 첨가하였을 때 세포독성 기능을 나타내는지 알아보기 위하여 제조회사가 다른 발효유 두 제품에 선별된 균을 1㎖당 1×108, 1×109 을 각각 첨가하여 MTT assay를 통해 세포독성 실험을 하였다. 실험결과 정상세포주인 CHO-K1은 모든 군에서 세포 독성을 30% 미만으로 측정되었으며 대장암 세포주인 SNU C4에서는 기존 두 제품에 1×109/㎖을 첨가한 시료에서 30% 이상의 세포 독성을 나타내었다(도 6, 도 7).
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균은 내산성, 내담즙성이 강하고 우수한 항암 효과를 나타낸다. 또한, Lactobacillus acidophilus KFRI 342 젖산균을 함유한 발효유는 암세포주에 대하여 세포독성을 나타내므로, 암 예방 및 치료에 대한 보조 식품으로써 우수한 기능성 발효유를 제공할 수 있다.

Claims (2)

  1. 내산성, 내담즙성이 강하고 항암활성이 있으며, 간에 있는 발암물질의 해독에 관여하는 항암지표효소인 퀴논 환원효소(Quinone reductase, QR)의 활성이 우수하고, 발암과 관련된 유해효소인 β-glucosidase 및 β-glucuronidase의 유해효소 활성이 낮으며, 한국식품연구원 균주은행에 소장된 젖산균주로부터 분리한 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주.
  2. 특허청구범위 제1항의 내산성, 내담즙성이 강하고 항암활성이 있으며, 간에 있는 발암물질의 해독에 관여하는 항암지표효소인 퀴논 환원효소(Quinone reductase, QR)의 활성이 우수하고, 발암과 관련된 유해효소인 β-glucosidase 및 β-glucuronidase의 유해효소 활성이 낮으며, 한국식품연구원 균주은행에 소장된 젖산균주로부터 분리한 Lactobacillus acidophilus KFRI 342 (KCTC 10827BP) 균주를 함유하는 발효유.
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