KR100804193B1

KR100804193B1 - 락타아제를 생산하는 신균주 락토바실러스 아시도필러스ｌａ－１２

Info

Publication number: KR100804193B1
Application number: KR1020060065118A
Authority: KR
Inventors: 김희식; 윤병대; 황윤식; 박찬선; 이영기; 오희목
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2008-02-18
Also published as: KR20080006231A

Abstract

본 발명은 락타아제를 생산하는 신균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-12에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유당불내증 해결을 위해 이용이 가능하며, 우수한 생존력, 효소 안정성과 위액 및 담즙액에 대한 내성이 우수하여 한국인의 장내 정착율이 뛰어나 발효유 제조와 기타 유가공식품 및 기능성 건강식품에도 다양하게 이용될 수 있는 신균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-12에 관한 것이다.

락타아제, 락토바실러스 아시도필러스 LA-12

Description

락타아제를 생산하는 신균주 락토바실러스 아시도필러스 ＬＡ－１２{A novel strain of lactobacillus acidophilus LA-12 produced lactase}

도 1은 X-gal을 첨가한 MRS 배지에서 락타아제를 생산하는 균주의 선별한 사진이다.

도 2는 분리한 균주들의 락타아제 활성을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명 균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-12와 락토바실러스 아시도필러스 NCFM(CP000033.1)의 상동성 분석을 나타낸 것이다.

도 4는 각 배지 조성에 따른 β-갈락토시다아제 효소 활성을 나타낸 것이다.

도 5는 락토바실러스 아시도필러스 LA-12의 생존력과 락타아제 안정성을 측정한 것이다.

도 6은 락토바실러스 아시도필러스 LA-12의 온도에 따른 락타아제 활성을 나타낸 것이다.

도 7은 pH에 따른 락토바실러스 아시도필러스 LA-12가 생산하는 락타아제 활성을 나타낸 것이다.

도 8은 0.5 g 락토오스 액체 크로마토그래피 분석과 락토바실러스 아시도필러스 LA-12가 생산하는 락타아제의 락토오스 분해능을 알아보기 위한 액체 크로마 토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다.

유산균은 인간이나 동물의 장관에 상존하여 건강유지에 큰 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 장내에 정착한 유산균은 병원성 세균이 소화관 상피에 부착하는 것을 방해하여 질병발생을 막아주며, 유산균에 의해 생성된 박테이로신(bacteriocin)과 같은 대사산물은 설사를 일으키는 병원성 미생물과 장내 유해균을 죽이거나 증식을 억제하는 등의 건강 증진 효과를 보여준다. 또한, 건강을 추구하는 현대에 있어서 성인과 관련된 질병의 예방 및 치료 측면에서 볼 때, 병원성 세균의 억제능, 콜레스테롤 저하능, 면역 증강능, 항돌연변이원성, 항종양활성 및 항암 효과가 있어 건강유지에 큰 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

유산균이 사람의 장내에서 생존하며 여러 가지 기능을 발휘하기 위해서 구강과 위의 효소, 위액의 낮은 pH, 소장내의 담즙 및 점액 등에 대해 저항성이 있어야 하고 위를 통과할 때 위액에 의해 많은 수가 사멸되거나 활성이 저해된 균주가 살아남아 장내에 생존하며 효과적인 기능을 발휘하기 위해서, 담즙산액에 대한 내성은 유산균이 필수적으로 가져야 할 특성이다. 또한, 식물성 식품을 주로 섭취하는 한국인에게는 위와 장내 환경도 동물성 식품을 주로 섭취하는 서양인과는 근본적으로 차이가 있어 김치와 같은 식물로부터 분리한 유산균의 한국인에게 잘 적용될 수 있다.

포유류의 젖 성분에 많이 존재하는 유당, 락타아제는 갈락토오스(galactose)와 글루코오스(glucose)가 β (1→4) 글리코사이드(glycoside) 결합으로 형성된 이당류이며, 이를 가수분해하는 효소는 인간에서는 락타아제로, 세균에서는 β-갈락토시다아제(galactosidase)로 알려져 있다. 락타아제의 활성이 결핍된 사람의 경우 우유를 섭취하였을 때 우유 성분 중 유당이 섭취되지 않고 소강의 내강에 축적되어 삼투압 상승을 유발한다. 이로 인하여 수분 과잉이 되며, 맹장 내의 미생물에 의하여 발효됨으로서 탄산가스를 발생시키고 대장 내 pH 저하 및 장을 자극하여 불쾌감을 줄 뿐만 아니라 일시적인 설사나 대장의 만성염증을 유발하여 만성 설사를 일으킨다. 이를 유당불내증 (lactase intolerance)이라고 하고 경우에 따라 만성적인 염증은 잠재적으로 결장암의 유발과 관련 있다는 보고가 된 바 있다[Chung, C.-W. 1999. Potential correlation between lactose intolerance and cancer occurrence. J. Korean Ass. Cancer Prevention. 4: 52-60]. 이러한 증세는 전 세계 인구의 약 2/3에서 발생되고 있으며, 우리나라의 경우는 약 84∼86%에 이른다고 보고되어 있다. 유당불내증을 해결하기 위해서는 락타아제가 함유 되면서 우유의 단맛을 증가시키지 않은 우유를 개발하여, 소장에 결핍된 유당분해효소를 공급함으로서 유당불내증의 원인인 유당을 소화시키면서 소비자들의 기호에 맞도록 할 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 한국인이 일상적으로 섭취하는 김치로부터 새로운 락토바실러스 아시도필러스 균을 분리하여 사람이 섭취한 후에도 장내 정착이 되도록 생존력과 효소 안정성이 우수하고 위액 및 담즙액에 대한 내성이 뛰어난 균주를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 한국인에게 적응성이 우수하며, 뛰어난 생존력과 안정한 효소 활성, 위액 및 담즙액에 대한 내성이 우수한 락토바실러스 아시도필러스 LA-12 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 아시도필러스 LA-12 균주로부터 락타아제를 대량 생산하기 위한 최적의 배지 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 뛰어난 생존력과 안정한 효소 활성, 위액 및 담즙액에 대한 내성이 우수한 락토바실러스 아시도필러스 LA-12 균주[KCTC 10961BP]를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 아시도필러스 LA-12 균주로부터 락타아 제를 대량 생산하기 위한 최적의 배지 조성물을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 유당불내증 해결을 위해 이용이 가능하며, 우수한 생존력, 효소 안정성과 위액 및 담즙액에 대한 내성이 우수하여 한국인의 장내 정착율이 뛰어나 발효유 제조와 기타 유가공식품 및 기능성 건강식품에도 다양하게 이용될 수 있는 신균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-12에 관한 것이다.

먼저, 내산성이 우수하다고 알려진 락토바실러스균을 분리하기 위해 김치로부터 락타아제 활성이 우수한 균주를 선별하였다. 이 균주는 MRS 고체 배지에서 콜로니 형태는 표면이 거칠고 유백색이었으며, 간균형(rod type)으로 0.5 ~ 1.5㎛의 세포크기를 나타내고, 포자와 운동성은 없으며, 여러 종류의 당류 발효능을 가지는 전형적인 유산균의 형태학적 및 생리학적 특성을 나타내고, 16S rDNA의 염기서열분석을 수행한 결과, 락토바실러스 아시도필러스와 높은 상동성을 가지는 것을 확인하여 본 발명 균주를 락토바실러스 아시도필러스 LA-12라 명명하였고, 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 6월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 10961BP를 부여받았다.

또한, 본 발명자들은 상기 균주로부터 락타아제 생산을 증가시키기 위한 최적의 생산배지를 조사한 결과, 기존의 MRS(Difco^TM Lactobacilli MRS Broth) 배지 조성에 L-시스테인ㆍHCl 0.01 ~ 1.0 g/L, KH₂PO₄ 1 ~ 10 g/L, (NH₄)₂HC₆H₅O₇ 0.5 ~ 7 g/L, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.001 ~ 0.5 g/L 및 미량원소(trace elements) 0.01 ~ 0.1 g/L를 첨가한 조성의 배지에서 락타아제가 가장 많이 생산되는 것을 확인하였다.

상기 첨가된 조성성분 중 L-시스테인ㆍHCl가 0.01 g/L 미만으로 사용되면 유산균의 낮은 성장속도가 문제가 있고, 1.0 g/L 초과 시에는 낮은 농도의 효소 생산이 문제가 있다. KH₂PO₄가 1 g/L 미만으로 사용되면 낮은 균체량이 문제가 되고, 10 g/L 초과 시에는 낮은 농도의 효소 생산이 문제가 있다. (NH₄)₂HC₆H₅O₇이 0.5 g/L 미만으로 사용되면 낮은 균체량이 문제가 되고, 7 g/L 초과시에는 낮은 농도의 효소 생산이 문제가 있다. FeSO₄ㆍ7H₂O가 0.001 g/L 미만으로 사용되면 낮은 균체량이 문제가 되고, 7 g/L 초과시에는 낮은 농도의 효소 생산이 문제가 있다. 또한, 미량원소(trace elements)가 0.01 g/L 미만으로 사용되면 낮은 균체량이 문제가 되고, 0.1 g/L 초과 시에는 낮은 농도의 효소 생산이 문제가 있다.

일반적으로 MRS 배지 조성은 펩톤(peptone) 1 ~ 20 g/L, 육 추출물(beef extract) 1 ~ 20 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 1 ~ 10 g/L, K₂HPO₄ 1 ~ 10 g/L, 암모늄 시트르산(ammonium citric acid) 1 ~ 10 g/L, 글루코오스(glucose) 10 ~ 30 g/L, 트윈 80 0.1 ~ 5 g/L, 소듐 아세트산(sodium acetic acid) 1 ~ 10 g/L, 식염수 1 ~ 10 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 ~ 25 g/L 및 MnSO₄ㆍ2H₂O 40 ~ 70 g/L로 이루어져 있다. 또한, 상기 미량원소라 함은 생물체의 생존에 필요한 미량의 화학성분을 의미하며, 일반적으로 Mn, Co, Zn, Mo, Cu 등을 의미한다.

본 발명에 따른 신균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-12[KCTC 10961BP]의 생존력과 락타아제 안정성을 조사한 결과, 높은 생균수와 우수한 락타아제 활성 및 안정성을 가지고 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 신균주는 위액 및 담즙액에 대한 내성이 매우 높아 장내 생존력이 뛰어나고, 락타아제를 생산하므로 유당불내증 저감 기능을 가지고 있고 시판되고 있는 유산균과 비교하여 효소 활성과 위액 및 담즙액에 대한 내성 또한 우수하여 기능성 유제품에 대한 이용 가능성이 매우 높다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 락타아제 생산 유산균 분리와 동정

내산성이 우수하다고 알려진 락토바실러스균을 분리하기 위해, 김치액을 생리 식염수에 적당한 배율로 희석한 다음 MRS(Difco^TM Lactobacilli MRS Broth) 고체평판배지(Difco Co.)에 도말하고 37 ℃에서 3일간 배양하였다. 2 % X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 푸른색을 띄는 100여 개의 균주를 분리하여 도 1에 락타아제 활성을 측정하였다. 이들 중 다른 균주들에 비해 효소 활성이 1,000 Miller Units/ml 이상의 활성을 나타내는 균주를 선별하였다[도 2].

분리 균주의 동정은 동일 배지를 사용하여 배양한 후 genomic DNA ioslation kit(Quiagen, Hilden, Germany)를 이용해 chromosomal DNA를 분리하였다. 16S rDNA내의 가변부위를 PCR로 증폭하기 위하여 16S rDNA에서 일반적으로 사용하는 두 universal primers(9F, 536R)를 사용하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성하고, 95 ℃에서 1분, 60 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분씩 30번 반복하여 DNA를 증폭시키고 마지막으로 72 ℃에서 10분간 연장하여 PCR반응을 종결시켰다. 전기영동 결과에서 약 500 bp의 증폭된 DNA를 분리한 뒤 이를 PCR 클로닝 벡터인 pGEM T-easy vector(Quiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환을 하였다. 16S rDNA내의 가변 부위의 서열은 BLAST Search Program(NCBI)을 사용하여 비교 분석하였다. 16S rDNA의 염기서열분석을 수행한 결과, 본 발명의 신균주는 "The BLAST search"를 통해 락토바실러스 아시도필러스와 높은 상동성을 가지는 것을 도 3과 다음 표 2를 근거로 하여 확인함으로써 본 발명 균주를 락토바실러스 아시도필러스 LA-12라 명명하고 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 6월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 10961BP를 부여받았다.

16S rDNA 염기서열분석 결과

Strain	Identify (%)^*	Closet strain	Accession number
LA-12	1059/1077 (98%)	Lactobacillus acidophilus	CP000033.1

*유사성은 "The BLAST search"를 통해 획득.

실시예 2: 락타아제 생산 배지 조사

본 발명의 신균주를 이용한 제품화를 위해 락타아제 활성을 높이기 위한 방법으로 락타아제 생산을 증가시킬 수 있는 최적 생산배지를 조사하였다.

MRS 배지와 2배 농축된 MRS 배지(2X MRS), MRS 배지에 17.2 g/L 덱스트로스(dextrose)가 첨가된 배지(MRS+Dex) 그리고 modified MRS(MoM)를 사용하여 37 ℃에서 24시간, 48시간동안 배양한 후 최적 생산배지 조사를 수행하였다. Modified MRS 배지는 MRS 배지 조성(peptone 10 g/L, beef extract 10 g/L, yeast extract 5 g/L, K₂HPO₄ 2 g/L, ammonium citric acid 2 g/L, glucose 20 g/L, tween 80 1 g/L, sodium acetic acid 5 g/L, salt solution 5 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 11.5 g/L, MnSO₄ㆍ2H₂O 52.4 g/L)을 기본으로 하여 L-cysteinㆍHCl 0.5 g/L, KH₂PO₄ 6 g/L, (NH₄)₂HC₆H₅O₇ 2 g/L, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.034 g/L, 미량원소(trace elements) 0.05 g/L가 첨가된 배지(pH 6.2 ~ 6.6)를 제작하여 사용하였다. 락타아제 활성은 배양액 1 ml을 원심분리한 후 0.85% 생리식염수로 2회 세척한 후 Z 버퍼(Na₂HPO₄ㆍ7H₂O 60 mM, NaH₂PO₄ 40 mM, KCl 10 mM, MgSO₄ㆍ7H₂O 1 mM, β-mercaptoethanol pH 7.0 50 mM) 1 ml에 현탁하였다. ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, SIGMA, USA) 4.0 mg/mL이 첨가된 기질을 사용하여 30 ℃에서 5분간 반응한 후 1 M 소디움 카보네이트로 반응을 종결시켰다. 상등액에 대하여 흡광도 420 nm와 550 nm에서 측정하여 락타아제 활성을 측정하였으며, 효소 활성은 배양액 1 mL당 Miller unit으로 나타내었다[Cutting, S. M. and P. B. Vander Horn. 1990. Genetic Analysis, p. 27-74. In C. R. Harwood and S. M. Cutting (ed.), Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley, Chichester.]. 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 본 발명의 신균주의 경우 modified MRS 배지를 사용하여 24시간 배양하였을 때 락타아제 활성이 다른 3가지 배지 조건과 비교하여 14.7 ~ 73.2 %정도 증가되는 것을 확인하였다. MRS 배지에서 24시간 배양하였을 경우 효소활성이 2074 Mllier Units/ml으로 48시간 배양한 경우와 비교하여 약 22%정도 효소 활성이 높게 나타나는 것을 관찰 할 수 있었으며 MRS+Dex 배지에서의 효소 활성은 MRS 배지 조건과 비교하여 약간 감소하는 경향을 나타내었다. 2배 농축된 MRS 배지에서 24시간 배양한 결과는 MRS 배지의 효소 활성보다 12% 정도 효소 활성이 높게 관찰되었다. 본 발명 균주가 생산하는 락타아제는 modified MRS 배지를 사용하여 37 ℃에서 24시간 배양하였을 경우 락타아제가 가장 많이 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과들로부터 본 발명 균주의 락타아제 생산을 증가시킬 수 있는 최적 생산배지는 modified MRS 배지를 사용하여 37 ℃에서 24시간 배양하는 것이 가장 효율적이라고 할 수 있다.

실시예 3: 생존력(viability)과 효소 안정성

발명 균주의 상업적 이용 가능성을 타진하기 위하여 신균주의 생존력과 락타아제의 안정성에 대한 실험을 수행하였다.

MRS 액체배지에서 37 ℃에서 18시간 동안 전 배양을 한 후 본 배양 배지에 1%(v/v) 접종하여 37 ℃에서 18시간 배양한 후 배양액 1 ml을 원심 분리하여 생리식염수를 사용하여 2회 세척한 후 생존력과 락타아제 안정성을 조사하였다. 생존력의 경우 1) 저온(4 ℃), 2) 상온(30 ℃), 3) MRS 배지(M), 4) 0.85% 생리식염수(S) 4가지 조건을 서로 조합하여 20일간 측정하였으며 생존력은 log CFU/ml로 나타내었다. 그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 4S(4℃, 생리식염수)조건을 사용하여 보존할 경우 20일 경과 후에도 높은 생균수(5.42 × 10⁶ CFU/ml)를 나타내었고, 락타아제 활성은 4 ℃에서 보관할 경우 1,100 Miller Units/ml 이상 유지되었다. 생존력과 락타아제 안정성을 실험한 결과, 본 발명 균주는 우수한 생존력과 높은 락타아제 활성 및 안정성을 가짐으로써 상업적인 이용가치가 높다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 락타아제 활성 분석 조건 검토

락타아제는 세포 내 효소(endoenzyme)로서 일반적으로 매우 소량 존재하며 기존의 발효조건에서는 세포 밖으로 분비되지 않으며 배양 조건과 측정방법에 따라 효소 활성에 차이를 나타낸다고 알려져 있다[Kilara. A, and Shahani, K. M. 1976. Lactase activity of cultured and acidified diary products. J. Dairy Sci. 59: 2031-2035.]. 본 발명 균주가 생산하는 락타아제 활성을 분석하기 위하여 ONPG 기질의 농도에 따른 효소 활성의 차이와 락타아제의 localization을 확인하였다. 본 발명 균주를 포스페이트 버퍼(pH 7.0), 아세테이트 버퍼(pH 4.0), Z 버퍼(pH 7.0)를 사용하여 각각 희석한 후 초음파 분해(sonication)로 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 원심분리한 후 상등액과 균체를 분리하여 ONPG를 4.0 mg/l와 4배 농축된 16 mg/l 농도로 사용하여 락타아제 활성을 측정하였다. 버퍼의 경우 포스페이트 버퍼를 사용하여 측정한 효소 활성은 다른 두 버퍼를 사용하여 측정한 결과와 비교하여 약 16 ~ 50% 정도 β-락타아제 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다[표 3]. 기질로 사용된 ONPG 농도에 따른 효소 활성의 경우, 표 3에서 나타난 바와 같이 크게 차이가 없는 것으로 확인되었다. 락타아제는 세포 내에서 소량으로 존재하는 효소로서 정확한 측정이 어렵고 또한 세포 파쇄 방법에 따라 많은 활성의 차이를 나타낸다. 본 발명에서는 세포 파쇄 방법에 따라 효소 활성의 차이를 확인하기 위하여 톨루엔(Cutting et al. 1990)과 초음파 분해를 이용하여 파쇄 방법에 따른 락타아제 활성의 차이를 비교하였다. 표 3에서 나타난 바와 같이 포스페이트 버퍼에 균체를 현탁하여 초음파 분해로 세포를 파쇄한 경우 298.9 Miller Units/ml 정도의 효소 활성을 확인할 수 있었으며 초음파 분해로 세포를 파쇄한 경우 톨루엔법에 비해 약 12% 정도 효소 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 본 발명 균주가 생산하는 락타아제의 활성을 분석하기 위한 조건을 검토한 결과, 포스페이트 버퍼(pH 7.0)를 사용하여 초음파 분해(50/60Hz, 30 sec, 30times)를 수행한 후, 4.0 mg/ml의 ONPG를 기질로 사용하여 30 ℃에서 5 분간 반응할 경우 최적의 효소 활성을 얻을 수 있다.

실시예 5: 온도와 pH에 따른 락타아제 활성

락타아제는 락타아제의 양, pH, 온도 그리고 저해제와 같이 다양한 조건에 영향을 받는다고 알려져 있으며[Hood. S. K. and E. A. Zottola, 1988. Effect of low pH on the ability of Lactobacillus acidophilus to survive and adhere to human intestinal cells. J. Food Sci. 53: 1514-1516], 균주가 생산하는 락타아제의 종류에 따라 적정 효소 반응 온도 또한 다를 것이다. 본 발명에서도 LA-12가 생산하는 락타아제에 대하여 온도와 pH에 따른 효소 활성을 비교하였다. 온도에 따른 활성의 경우 도 6에서 나타난 바와 같이 55 ℃에서 측정된 효소 활성이 37 ℃에서 측정된 효소 활성에 비해 약 20 ~ 40% 정도 증가되는 것으로 확인되어 본 발명 균주의 락타아제 활성의 최적 온도는 55 ℃임을 확인할 수 있었다.

본 발명 균주의 pH에 따른 락타아제 활성의 차이를 조사하였다. 본 발명 균주의 경우 pH 6 ~ 7에서 높은 효소 활성을 나타내었으며 이후 급격히 감소되는 것을 확인하였다[도 7]. 이상의 결과로부터 본 발명 균주 LA-12는 55 ℃, pH 6 ~ 7 에서 최대 효소 활성이 나타나는 것을 확인 할 수 있었으며 상업화의 경우 고온에서도 안정한 효소 활성을 유지할 수 있을 뿐 아니라 락타아제 대량 생산 시 별 다른 pH 조정이 필요 없어 그 경제성이 우수하다고 할 수 있다.

한편, 실제 선별 균주가 생산하는 효소 락타아제가 락토오스를 갈락토오스와 글루코오스로 분해하는지 확인하기 위하여 HPLC를 이용하여 반응액을 분석하였다.

0.5 g 락토오스를 대조군으로 사용하여 LC 분석을 수행한 결과, 대조군(control)으로 사용된 락토오스에 해당하는 피크는 RT 3.72 min에서 관찰되었으며, 발명 균주의 경우 RT 3.32 min과 3.27 min에서 갈락토오스와 글루코오스에 해당하는 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있었다[도 8]. 이 결과로부터 선별 균주가 생산하는 락타아제는 락토오스 분해능을 가진 것으로 확인할 수 있었으며 산업적인 이용 가능성을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 장내환경요인에 따른 유산균의 내성

(1) 인공위액에 대한 내성

구강을 통해 섭취되는 유산균의 경우 낮은 pH의 위액을 통과하여야 한다. 순수한 위액의 pH는 1.4 ~ 2.0 정도로 거의 대부분의 미생물은 사멸되나 위에 음식물이 유입되면서 음식물의 완충작용에 의해 다소 pH가 상승하여 미생물의 사멸을 어느 정도 감소시킬 수 있다. 그러나, 유산균이 정장작용 등 체내에서 여러 가지 생리적 기능을 발휘하려면 음식물이 위에 머무르는 2 ~ 3시간 동안 위 내의 낮은 pH에서 생존 가능해야 한다[D. Wang, M. Sakakibara. 1997. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in sonicated fermentation with Lactobacillus strains. Ultrasonics Sonochemistry. 4: 255-261].

본 발명에서는 pH 2.0, 2.5, 3.0으로 조정한 인공위액이 첨가된 MRS 액체배지를 사용하여 위액에 대한 내성을 조사하였으며 시판되는 유산균 2종과 비교하였다. MRS 액체배지에서 37 ℃, 24시간 배양하여 배양액 1 ml을 원심 분리한 후 균체를 회수하였다. 균체에 인공위액을 1:1 (v/v) 비율로 첨가하여 3시간 배양한 후 MRS 고체배지에서 37 ℃, 48시간 배양하였으며 생균수 측정을 통하여 인공위액에 대한 내성을 측정하였다. 그 결과, 표 4에서 나타난 바와 같이 본 발명 균주 LA-12의 경우 pH에 따른 생균수의 변화가 거의 없이 높은 생존율을 나타내었으며 시판되는 유산균 락토바실러스 불카리커스(Lactobacillus bulgaricus)와 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)의 내성과 비교하였을 때 그 차이가 없다는 것을 확인하였다.

구강을 통해서 섭취되는 유산균이 위와 십이지장을 거쳐 장에 도달하려면 췌장에서 십이지장으로 분비되는 담즙액에 대한 내성이 있어야 한다[Giannella, R. A., S. A. Broitman. and N. Zamchick. 1972. Gastric acid barrier to ingested microorganisms in man : studies in vivo and in vitro. Gut. 13: 251-256]. 그러나, 장 유래성이 아닌 락토바실러스의 경우 LBS 배지에서 성장하지 못하며 매우 낮은 농도의 담즙산액에 대해서도 민감하다고 보고된 바 있다[Chung, S. H., H. J. Suh, and H. Lee. 1997. Utilization of soybean curd whey as a medium for Lactobacillus acidophilus and acid and bile-tolerance of cultured strains. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 26: 872-877,Giannella, R. A., S. A. Broitman. and N. Zamchick. 1972. Gastric acid barrier to ingested microorganisms in man : studies in vivo and in vitro. Gut. 13: 251-256]. 이에 본 발명에서는 인공 위액을 처리한 후 인공 담즙산액에 대한 본 발명 균주의 생존력과 락타아제 활성을 시판되는 유산균(양성대조군)과 비교, 조사하였다. 그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 LA-12는 0.3% 인공 담즙액에 대해 24시간 반응 후 인공 담즙액이 포함되지 않은 대조군과 비교하여 생존력이 1-2 log CFU/ml 정도 감소되는 것이 관찰되어 본 발명 균주 또한 담즙액에 민감하다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 시중에 판매되고 있는 유산균 두 종과 비교하였을 때 배양 24시간 후의 생균수가 크게 차이가 없는 것으로 확인되었으며, 반응 후 남아있는 유산균만으로도 충분히 프로바이오틱으로서 기능을 충분히 발휘할 수 있으므로 본 발명 균주인 LA-12는 위액과 담즙액에 내성을 가지고 있다고 할 수 있을 뿐만 아니라 목적 부위인 장도 도달하여 프로바이오틱으로서의 그 역할을 기대할 수 있다.

상기 결과들로부터 본 발명 균주 LA-12는 높은 생존력과 우수한 효소 활성을 나타냄으로써 유당불내증 저감 기능을 발휘할 것으로 기대되며, 현재 시중에 유통되고 있는 유제품에 사용되는 균주와 비교하여 위액과 담즙산액에 대한 내성 또한 우수하여 기능성 유가공 식품 혹은 기타 유제품 제작 시 상품화 가치가 우수하다고 사료된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 아시도필러스 LA-12[KCTC 10961BP]는 김치 유래의 락타아제를 생산하는 신균주로서 한국인의 장내 정착율이 우수하고 안정한 효소 활성을 가진다. 또한, 위액 및 담즙액에 대한 내성이 매우 높아 장내 생존력이 뛰어나고, 락타아제를 생산하므로 유당불내증 저감 기능을 가지고 있고 시판되고 있는 유산균과 비교하여 효소 활성과 위액 및 담즙액에 대한 내성 또한 우수하여 기능성 유제품에 대한 이용 가능성이 매우 높은 발명 균주이다.

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Claims

락타아제(Lactase)를 생산하며 위액 및 담즙액에 대한 내성이 우수한 락토바실러스 아시도필러스 LA-12[KCTC 10961BP].
펩톤(peptone) 1 ~ 20 g/L, 육 추출물(beef extract) 1 ~ 20 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 1 ~ 10 g/L, K₂HPO₄ 1 ~ 10 g/L, 암모늄 시트르산(ammonium citric acid) 1 ~ 10 g/L, 글루코오스(glucose) 10 ~ 30 g/L, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트 0.1 ~ 5 g/L, 소듐 아세트산(sodium acetic acid) 1 ~ 10 g/L, 식염수 1 ~ 10 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 ~ 25 g/L 및 MnSO₄ㆍ2H₂O 40 ~ 70 g/L에,

L-시스테인ㆍHCl 0.01 ~ 1.0 g/L, KH₂PO₄ 1 ~ 10 g/L, (NH₄)₂HC₆H₅O₇ 0.5 ~ 7 g/L, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.001 ~ 0.5 g/L, 및 Mn, Co, Zn, Mo 및 Cu 중에서 선택된 1종 이상의 미량원소(trace elements) 0.01 ~ 0.1 g/L를 첨가한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 아시도필러스 LA-12[KCTC 10961BP]로부터 락타아제를 대량 생산하기 위한 배지 조성물.