KR100825500B1 - 경구 운반체의 개발을 위한 돼지 유래 신규 유산균 및 이의용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경구 운반체의 개발을 위한 돼지 유래 신규 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생체 내에서의 안전성과 경구 운반체로서의 효능을 가지는 돼지 유래의 락토바실러스 루테리 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 락토바실러스 루테리는 숙주로 사용할 경우 생체 내에서 질병 발생 가능성이 없으며, 경구 운반체로 사용하기 위해 필요한 기능을 보유하고 있다는 장점이 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 루테리는 경구 운반체를 위한 셔틀 벡터로 개발될 수 있는 신규 플라스미드를 가지고 있다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 루테리는 경구 운반체, 생균제, 정장제, 항균제 및 사료첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

생균제, 락토바실러스 루테리, 경구 운반체, 생체 내 안전성

Description

경구 운반체의 개발을 위한 돼지 유래 신규 유산균 및 이의 용도 {Novel Lactobacillus reuteri isolated from pig for the development of oral delivery system and use thereof}

도 1은 락토바실러스 속 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 방법을 도시한 것이다.

도 2는 49개 락토바실러스 속 균주 중 2-10kb의 플라스미드 DNA를 보유하고 있는 10개 락토바실러스 속 균주의 플라스미드 DNA 분석 결과이다.

M: 1kb DNA 마커 레인 1: L9

레인 2: L28 레인 3: L36

레인 4: L42 레인 5: L43

레인 6: L44 레인 7: L45

레인 8: L46 레인 9: L48

레인 10: L49

도 3은 플라스미드 DNA 분석을 통해 1차 선발된 10개의 락토바실러스 속 균주에 대하여 16S rRNA 유전자형을 통한 근연관계를 분석한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. L9가 8개 균주 (L9, L28, L36, L42, L44, L46, L48)의 대표 균주로 도면에 표기 되었다.

도 4는 플라스미드 DNA 분석을 통해 1차 선발된 10개의 락토바실러스 속 균주를 대상으로 RAPD 분석을 수행한 결과이다.

M: 1kb DNA 마커 레인 1: L9

레인 2: L28 레인 3: L36

레인 4: L42 레인 5: L43

레인 6: L44 레인 7: L45

레인 8: L46 레인 9: L48

레인 10: L49 레인 11: W6-14(양성 대조군)

레인 12: 블랭크(blank)

도 5는 본 발명의 유산균이 함유하고 있는 플라스미드 pILR091의 제한효소 부위의 그래픽 지도(A)와 효소 프로파일(B)을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 pILR091의 추정되는 ORF, 복제 원점 및 제한 효소의 구조적인 구성을 도시한 것이다. 각 ORF는 파랑색 화살표(복제 단백질)과 하늘색 화살표(추정되는 단백질)로 나타내었고, 추정되는 ORF의 잔제(ORF6)는 노란색 점선 화살표로 나타내었다. 복제 원점(ori)은 검정색 박스로 표시하였다. 회색 격자와 체크는 10bp DR과 21 또는 22bp DR을 나타낸다.

도 7은 DNasist 프로그램을 이용하여 본 발명의 pILR091과 다른 락토바실러스 속 균주 유래 플라스미드 간의 ori 서열을 비교한 결과이다. 분홍색 박스는 ori 사이트간의 보존된 부위를 나타내고 본 발명의 pILR091의 추정되는 복제 원점은 흰색 박스로 나타내었다.

도 8은 공지된 데이터베이스의 서열에 근거로 한 본 발명의 pILR091의 추정되는 각 ORF들의 일반적인 특성을 나타낸 것이다.

도 9는 DNasist 프로그램을 이용하여 락토바실러스 루테리로부터 유래한 본 발명의 pILR091과 pTE44의 복제 단백질들을 비교한 결과이다. 박스 내 빨강색 문자는 정확하게 일치하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 pILR091의 각 ORF와 다른 락토바실러스 균주 유래 게놈 DNA의 ORF 간의 G-C 함량을 비교한 결과이다.

도 11은 경구 운반체의 개발을 위한 본 발명의 돼지 유래 신규 유산균의 특성 및 동정을 나타낸 표이다.

본 발명은 경구 운반체의 개발을 위한 돼지 유래 신규 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생체 내에서의 안전성 및 경구 운반체로서의 효능을 가지는 돼지 유래의 락토바실러스 루테리 및 이의 용도에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 유산균은 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피 도박테리아(Bifidobacteria), 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 나뉜다. 유산균은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균이나 크로스트리디움(Clostridium sp.)과 같은 유해 세균의 성장 및 번식을 저해하고 설사와 변비를 개선할 뿐 아니라, 비타민 합성, 항암작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 또한, 유산균은 대식세포의 증식을 촉진하여 대식세포의 장내 유해 세균에 대한 인지능력, 살균능력 등을 강화시키고, 면역 관련 물질의 분비를 촉진하여 면역증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gabriela perdigon et al., J. of food Protection 53:404-410, 1990; Katsumasa sato et al., Microbiol. Immunol., 32(7):689-698, 1988). 특히, 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특정 단백질을 가지고 있어 정장 작용에 큰 도움을 준다.

이러한 유산균은 일반적으로 안전한 미생물로 알려져 있으며, 바이오 및 식품 산업 및 의료 목적으로 다양하게 사용되어 왔다. 그 중에서 생균제(probiotics)는 사람뿐만 아니라 동물의 건강증진을 위해 사용되는 유산균의 대표적 활용 부분이다. 그러나, 생균제는 살아있는 미생물로서 언제나 감염의 가능성을 가지고 있다. 기존의 연구 결과들에 의해 생균제가 식품으로서 사람에 안전하다고 알려졌으나(Adams, M. R. and Marteau, P. 1995. Int. J. Food Microbiol. 27, 263-264; Naudu, A. S. et al., 1999. Cit. Rev. Food. Sci. 39, 13-12; Reid, G. 2002. Clin. Infect. Dis. 35, 349-35), 간혹 전신 감염과 같은 부작용이 있는 것으로 보고 되었다(Mackie, R. I. et al., 1999. Am. J. Clin. Nutr. 69. 1035S- 1045; Marteau, P. R. 2002. Clin. Rev. Allergy Immunol. 22, 255-27; Rautio, M. et al., 1999. Nutrition. 18, 1159-11).

최근에는 생균제의 유용성 외에 안전성에 대한 부분이 종종 언급되고 있다(Aymerich, T. et al., 2005. J. Appl. Microbiol. 100, 40-4; Reid, G. et al., 2003. Clin. Microbiol. Rev. 16, 658-67; Wright, A. B. 2005. Cur. Pharmaceutical Design. 11, 17-2). 생균제의 안전성에 대한 가이드라인을 만들기 위하여 FAO/WHO 연합 워킹 그룹(working group)에서는 대사 활성(metabolic activities), 독소 생성, 용혈 작용, 면역 결핍 동물에 감염력, 항생제 내성과 음용자에게 생길 사고에 등과 같은 최소한의 특성 연구에 대해 추천하고 있다 (Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Organization 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Joint FAO and WHO Working Group Report. London, Ontario, Canada, April 30 and May 1). 이에 따라 최근 들어 생균제에 대한 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro) 상에서 안전성 검사가 실시되고 있다(Makelainen, H. et al., 2003. Microbiol Immunol. 47, 911-91; (Adams, M.R. and Marteau, P. 1995. Int. J. Food Microbiol. 27, 263-264).

이외에도 플라스미드 DNA 전이, 활성 효소, 세균의 대량 섭취시 유발될 수 있는 급성 또는 아급성 독성, 감염에 의한 장점막의 변성 및 여러 질병에 대한 부 작용과 같은 다양한 검사 내용들이 생균제의 안전성 검사를 위해 권장되고 있다(Reid, G. et al., 2003. Clin. Microbiol. Rev. 16, 658-67).

또한 생균제가 건강 증진을 위해 좋은 면을 가지고 있지만, 불량한 정착능과 정상 세균총과의 경쟁은 아직도 문제점으로 남아 있다. 이 문제는 아마도 비숙주-특이적인 유산균을 생균제로 사용하였기 때문으로 사료되고 있다. 이런 점은 이미 오래전에 밝혀진 바 있다.

다른 환경에서 분리한 유산균을 다른 문화와 지역적으로 차이가 있는 사람들에게 적용해 본 결과 생균제로서 효능이 좋지 않았고(Haddadin, M. S. Y. et al., 2004. J. Nutr. 3, 290-29), 상용화된 생균제의 음용을 멈추면 일주일 이내에 장관 내에서 급격히 유산균주의 수가 감소하는 것을 통해(Berg, R. D. 1998. Trends Microbiol. 6, 89-9), 상용화된 생균제 균주가 장관 내에서 제대로 정착하지 못하고 있음을 알 수 있다.

한편, 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 미생물은 유산균 중에서도 장관 내 생태계를 유지하는데 매우 중요한 미생물 중 하나이다(Sandine, W. E. 1979. J. Food Prot. 42, 259-26). 락토바실러스 속 미생물은 리스테리아 모노싸이토젠(Listeria monocytogenes)(Ashenafi, M. 1991. Food Microbiol. 8, 303-31; Aymerich, T. et al., 2005. J. Appl. Microbiol. 100, 40-4; Harris, L. J. et al., 1989. J. Food Prot. 52, 384-38; Mckay, A. M. 1990. Lett. Appl. Microbiol. 11, 15-1), 대장균(E. coli), 살모넬라 속(Salmonella spp.)(Chateau, N. et al., 1993. J. Appl. Bacteriol. 74, 36-4; Drago, L. et al., 1997. FEMS Microbiol. Lett. 153, 455-46; El-Ziney, M. G. et al., 1998. J. Food Prot. 61, 1275-128; Hudault, S. et al., 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63, 513-51) 외에도 여러 병원성 미생물에 대한 억제 효과를 가지고 있는 것으로 알려졌다(Axelsson, L. T. et al., 1989. Microb. Ecol. Health Dis. 2, 131-13; . Coconnier, M. H. et al., 1997. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1046-105; Olsen, A. et al., 1995. J. Appl. Bacteriol. 79, 506-51).

이는 유기산(organic acid), 애시도필린(acidophillin), 과산화수소(hydrogen peroxide), 박테리오신(bacteriocin) 또는 루테린(reuterin)과 같은 억제 물질을 생성하거나(Juven, B. J. et al., 1992. J. Food Prot. 55, 157-16; Axelsson, L. T. et al., 1989. Microb. Ecol. Health Dis. 2, 131-13), 장관 내에서 경쟁적인 정착능에 기인한다고 보고되었다. 또한, 락토바실러스 속 미생물은 설사 원인균의 증식을 억제하여 장내 균총을 정상화함으로써 설사를 멈추게 하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기 락토바실러스 속 미생물을 생균제 후보 균주로 선정하고, 이를 대상으로 돼지 장관 내 집락형성이 잘 일어나며 경구 운반체 로 사용 가능한 생균제를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 돼지로부터 분리한 락토바실러스 속 균주들 중에서 경구 운반체의 개발을 위한 효능 및 안정성 검사를 통해 우수한 활성을 가지는 균주를 선발하고 이의 특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지 장관 내 집락형성이 잘 일어나며, 경구 운반체로 사용 가능한 유산균 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체 내에서의 안전성과 경구 운반체로서의 효능을 가지는 돼지 유래의 신규 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 제공되는 유산균은 생체 내에서의 안전성과 경구 운반체로서의 효능을 가진다는 점에 특징이 있다.

본 발명자들은 돼지의 분변으로부터 분리한 락토바실러스 속 균주 중에서 셔틀 벡터의 제조를 위한 2-10kb의 플라스미드 DNA를 가지고 있는 균주를 1차로 선발한 후, 혈구용해검사, 인돌형성, 암모니아 형성 및 페닐알라닌 분해와 같은 안전성 검사를 통해 숙주로 사용하였을 때 생채 내 상태에서 질병 발생 가능성이 없는 균주를 2차로 선발하였다.

이후, 내산성, 내열성, 내담즙성, 장점착능, 항균효과 및 과산화수소 생성 등과 같은 경구 운반체를 위한 효능 검사를 통해 가장 우수한 활성을 가진 락토바실러스 균주를 최종적으로 선발하였다 (도 11).

최종적으로 선발된 락토바실러스 균주는 16s rRNA 분석 결과 락토바실러스 루테리와 가장 높은 근연관계를 보였다. 따라서 본 발명자들은 상기 균주를 "락토바실러스 루테리 L09(Lactobacillus reuteri L09)"라 명명하여 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터 (KACC) (경기도 수원시 권선구 서둔동 225 소재)에 2006년 9월 8일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC 9126P). 본 발명의 L. reuteri L09 균주는 그람 양성균이고, 콜로니 형태 및 세포 모양을 관찰한 결과, 막대 모양의 간균이었다. 또한 카탈라제 테스트에서 음성 반응을 나타내었다.

본 발명의 락토바실러스 루테리는 숙주로 사용할 경우 생체 내에서 질병 발생 가능성이 없으며, 경구 운반체로 사용하기 위해 필요한 기능을 보유하고 있다. 구체적으로 다음과 같은 특성을 가진다:

(1) 용혈작용 및 암모니아, 인돌, 페닐알라닌 생성능이 없고;

(2) Caco-2 세포에 대해 장 점착능을 가지고;

(3) S. typhi, S. typhimurium 및 P. mutocida type A에 대해 항균활성을 나타내고;

(4) pH 2에서 내산성, 0.3%(w/v)Oxgall에서 저항성 (내담즙성), 65℃에서 내열성 및 동결건조상태로 4℃에서 6개월 동안 생존하는 내냉성(cold-drying tolerance)을 나타내고;

(5) 산 생성능 및 과산화수소 생성능을 가지고;

(6) 호기성 성장(aerobic growth)을 하고; 또는

(7) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유함.

본 발명의 락토바실러스 루테리는 장 점착능이 매우 높아 돼지의 장 내에 쉽게 정착할 수 있다는 장점이 있다.

특히, 본 발명의 락토바실러스 루테리는 경구 운반체용 셔틀 벡터의 제조에 사용될 수 있는 신규 플라스미드 DNA를 가지고 있다는 점에서도 다른 유산균과 구별되는 특징이 있다. 본 발명자들은 상기 플라스미드를 "pILR091"이라 명명하였다.

상기 pILR091 플라스미드는 7,185개의 뉴틀레오티드(서열번호 1)로 구성되어 있다. 또한 평균 G-C 함량(content)은 39%이고, 복제수(copy number)는 24~25이다.

상기 pILR091에는 총 5개의 ORF(open reading frame)가 존재하고, 두 가지 RCR-복제 기점(replication origin)과 하나의 복제 단백질, 그리고 두 개의 반복 구조를 가지고 있다. 상기 pILR091은 그 크기가 세타-복제 플라스미드에 비해 작고, 잠적(crytic) 플라스미드와 같은 RCR 플라스미드와 비교해서는 큰 편이다.

본 발명의 pILR091은 RC 복제를 사용하나, G-C 함량 면에서는 세타-복제를 하는 비-잠적(non-cryptic) 플라스미드 DNA를 따르고 있다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 루테리가 가지고 있는 플라스미드 pILR091은 RC-복제(rolling circle replication) 플라스미드의 다양한 숙주 영역과 세타-복제(theta-replication) 플라스미드의 안정성의 두 가지 장점을 모두 가질 뿐 아니라 20계대 동안에도 복제수에 큰 변화를 나타내지 않아 안정하다는 장점이 있다.

또한 본 발명의 락토바실러스 루테리는 하기의 특성을 추가로 포함할 수 있다:

(1) 에스터라제(esterase), 에스터라제 리파제(esterase lipase), 리파제(lipase), 류신 아밀아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase), 크리스틴 아릴아미다제(crystine arylamidase), 산 포스파타제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다제(galactosidase), β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(glucuronidase) 및 α-글루코시다제를 보유하는 반면, 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase), 트립신(trypsin), α-키모트립신(chymotrypsin), β-글 루코시다제(glucosidase), N-아세틸-β-글루코사미니다제(N-acetyl-β-glucosaminidase), α-만노시다제(mannosidase) 및 α-푸코시다제(fucosidase)는 보유하고 있지 않고; 또는

(2) 카나마이신(kanamycin), 세폭시틴(cefoxitin), 세포탁시모(cefotaximo), 반코마이신(vancomycin), 에리쓰로마이신(erythromycin), 날리딕산(nalidixic acid), 티로신(tylosin) 및 니스태틴(nystatin)에 대하여 저항성을 나타내는 반면, 겐타마이신(gentamycin), 암피실린(ampicillin), 아목시실린(amoxicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 플로르페니콜(Florfenicol), 노보비오신(novobiocin) 및 리팜피신(rifampicin)에 대하여 감수성을 나타냄.

아울러, 본 발명의 락토바실러스 루테리는 Aph(2")-ld, lnu(A), MefA, MefE, tet(K), tet(W), vanA, vanB, vanC, vanE, vatC 및 vatE의 12종의 항생제 내성 유전자를 보유하고 있지 않다.

상기와 같은 특성을 갖는 본 발명의 락토바실러스 루테리는 인간 및 동물의 건강증진을 위한 용도, 즉 생균제, 항균용, 정장용 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 락토바실러스 루테리는 생체 내에서의 안정성 및 경구 운반체로서의 효능(특히, 높은 장 점착능 및 셔틀 벡터로 제조될 수 있는 유산균 자체 내 플라스미드 DNA의 보유)이 입증된 것이므로 효과적인 생균제 및 경구 운반체(예: 백신 운반체)로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 정장용 조성물은 장내 정상 세균총의 균형이 파괴로 인한 소화불량, 설사 유발 등을 예방 및/또는 개선할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 사료용 조성물은 동물의 정장효과 증진 및 면역기능 강화를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공되는 조성물들은 본 발명의 락토바실러스 루테리의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균체를 제거한 여액(원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리 또는 용해효소(lysozyme) 처리하여 얻은 세포 파쇄액, 상기 배양액을 농축시킨 농축물, 상기 배양액을 건조시킨 건조물 등을 포함한다. 각 조성물에 포함되는 락토바실러스 루테리의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물들은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 루테리 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다.

투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여대상의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는 1회 투여시 0.1 ㎎ 내지 15 ㎎, 보다 바람직하게는 6 ㎎ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 생균제용 조성물의 경우 조성물 내 생균수는 10⁷ 내지 10¹⁰ cells/㎖, 바람직하게는 10⁹ cells/㎖ 인 것이 바람직하다. 사료용 조성물의 경우에는 본 발명의 유산균을 사료 1 톤 (ton)당 1 내지 10kg의 양으로, 바람직하게는 0.5% (5 kg 생균/ton 사료): 1x10⁹ cfu/g의 양으로 첨가할 수 있으며, 첨가량은 필요에 의해 조정될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 락토바실러스 루테리와 여러 가지 미생물 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 락토바실러스 루테리를 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 락토바실러스 루테리로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 루테리는 통상적인 락토바실러스 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예컨대, MRS(deMan, Rogosa, and Sharpe) 배지 또는 BL 배지를 사용할 수 있다.

미생물의 배양은 통상의 유산균 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 30-45℃, 10-50시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 30℃에서 24시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 배양 후에는 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다.

농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 본 발명에 따른 락토바실러스 루테리는 공장에서 대량 배양하여 분말로 제조하는 경우에도 안정성(stability)이 유지된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

플라스미드 DNA를 보유하는 락토바실러스 속 균주의 1차 선발

돼지 장관내 집락형성이 잘 일어나며, 경구 운반체로 사용 가능한 유산균을 확보하기 위하여 돼지 분변으로부터 분리한 락토바실러스 속 49주(충북대학교 이완규 교수님으로부터 제공받음)를 대상으로 선발 실험을 수행하였다.

상기 락토바실러스 속 49주의 분리방법은 다음의 방법으로 분리된 것이다: 충청북도에 있는 돈사에서 수거한 돼지 분변을 락토바실러스 속 선택 배지, LBS 및 유산균 비특이 배양 배지인 BS에서 배양하였다. 각 배지를 37℃에서 48시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 전형적인 락토바실러스 속 콜로니를 택하여 BL 배지에서 37℃의 조건으로 48시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 이후, 호기 상태에서의 배양성, 그람 염색, 카탈라제 테스트(catalase test), 콜로니 형태 및 세포 모양 관찰 등을 수행하여 49개의 락토바실러스 속 균주를 분리하였다.

이후, 상기 49개의 락토바실러스 속 균주 중에서 셔틀 벡터로 개발 가능한 2~10kb 크기의 플라스미드 DNA를 가지고 있는 균주를 선발하기 위하여, 플라스미드 DNA 분석을 수행하였다. 각 균주로부터 플라스미드 DNA는 O'sullivan and Klaenhammer(Applied Environmental and Microbiology, 59, 2730-2733, 1993)의 방법을 이용하여 분리하였다.

실험 방법은 분리 효율을 올리기 위하여 일부 변형하였으며(도 1 참조), 분리된 플라스미드 DNA는 0.7% 아가로스 겔에서 50V의 조건으로 4시간 동안 분리하여 분석하였다.

그 결과, 총 49개 락토바실러스 속 균주 중에 10개 균주가 2~10kb 크기의 플라스미드 DNA를 보유하고 있는 것으로 나타났다(도 2 참조).

< 실시예 2>

선발된 균주의 동정 및 유전학적 분석

<2-1> 균주의 동정

상기 실시예 1에서 플라스미드 분석으로 1차 선발된 10개의 락토바실러스 속 균주를 동정하기 위하여 표현형 및 유전형 분석을 실시하였다.

a. 표현형 분석

10개 락토바실러스 속 균주의 동정을 위해 생리적 특성을 분석하기 위하여 API CH50L 키트(bioMerieux. Inc Durham. NC, USA)를 사용하였다. 그 결과, 10개의 균주 중 L9, L28, L36, L42, L44, L46, L48 및 L49의 8개 균주는 락토바실러스 퍼르멘툼(Lactobacillus fermentum)으로, 그리고 L45 균주는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis)로 동정되었다. 그러나, L43 균주는 락토바실러스 퍼르멘툼과 류토노스톡 락티스의 특성을 모두 가지고 있어 동정할 수가 없었다.

b. 유전형 분석

16S rRNA 유전자 분석(Flint, J. F. and Angert, E. R. 2005. J. Microbiol. Methods, 61: 235-243)을 이용하여 수행하였으며, 16S rRNA의 유전자는 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 및 DNasist 프로그램으로 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자의 염기서열을 Megalign 프로그램을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)로 나타내었다.

그 결과, 상기 a. 표현형 분석에서 락토바실러스 퍼르멘툼으로 밝혀진 8개의 균주(L9, L28, L36, L42, L44, L46, L48 및 L49)는 동일한 유전자 서열을 가지고 있는 것으로 나타났으나, L. fermentum이 아닌 L. reuteri에 더욱 가까운 염기서열을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이와 같이 동일한 유전자형을 보인 8개 균주는 계통수 상에서 L. reuteri와 가장 높은 근연관계를 보였다(도 3 참조).

한편, L43과 L45 균주의 유전자 염기서열을 다른 형태를 보였다. L43 균주의 경우에는 근연관계를 보이는 균주를 찾을 수 없었고, L45 균주는 L. salivarius 와 L. pentosus 와 근연관계를 보여주었다(도 3 참조).

<2-2> RAPD ( Random amplified polymorphic DNA ) 분석

RAPD를 통한 DNA의 특성 연구를 위해, 랜덤 프라이머 5 (5'-AACGCGCAAC- 3')(서열번호 2)와 프라이머 6 (5'-CCCGTCAGCA-3')(서열번호 3)을 이용하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 증폭하였다.

게놈 DNA의 준비는 상용화된 키트(Wizard Genomic DNA Purification kit. Promega)를 사용하였다. PCR 반응은 2회에 걸쳐 실시하였다. 처음에는 94℃에서 5분간 실시한 후, 34℃에서 1분간, 그리고 72℃에서 5분간 4 회 반응시켰다. 두 번째로 94℃에서 1분, 34℃에서 1분, 그리고 72℃에서 2분간 30회 반응하였다. 각 PCR 산물을 1.5% 아크릴아미드 겔 상에서 비교 분석하였다(Tynkkynen, S. et al., 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3908-39).

10개의 락토바실러스 속 균주의 게놈 DNA를 랜덤 프라이머로 증폭한 결과, 700bp와 1,400bp의 특이적인 밴드 패턴을 관찰할 수 있었다. 균주 동정 분석에서 동일한 균주로 밝혀진 8개 균주를 제외한 L43과 L45 균주에서는 플라스미드 프로파일(도 2)에서와 유사하게 다른 밴드 패턴을 보였다(도 4 참조).

< 실시예 3>

안전성 평가( safety assessment )를 통한 2차 선발

상기 실시예 1의 플라스미드 DNA 분석을 통해 1차 선발된 10개의 락토바실러스 속 균주 중에서 숙주로 안전하게 사용될 수 있는 균주를 2차 선발하기 위하여 안전성 검사를 실시하였다.

이를 위해 용혈 반응 및 유해 대사산물 생성에 대해 조사하였다. 용혈 검사는 양 혈액 배지(sheep blood agar)에 각 균주를 배양한 후 용혈 여부를 확인하였다. 용혈 검사를 위한 양성 대조군으로는 S. agalactiae(서울대학교 수의과대학 전염병학 실험실)을 사용하였다.

또한 유해 대사산물 생성 조사는 인돌, 암모니아 및 페닐알라닌 생성에 관하여 각각의 배지에 균을 배양하여 실시하였다(Cappuccino, J.G. and Sherman, N. 1987. Urease test. Microbiology: a laboratory manual. Pp. 157-160. Bejamin/Cummings Publishing Co. Inc., Menlo park, C.A., U.S.A; Isenberg, H.D. 1992. Indole test/Urease. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol.1, pp.1.19.13-1.19.15./2.6.8. American Society of Microbiology, Washington D.C., U.S.A.; Ishibashi, N. and Yamazaki, S. 2001. Probiotics and safety. Am. J. Clin. Nutr. 73, 465S-470S).

암모니아 생성을 위한 양성 대조군으로는 Proteus vularis를, 음성 대조군으로는 E. coli를 각각 사용하였다. 또한 인돌 생성을 위한 양성 대조군으로는 E. coli를, 음성 대조군으로는 P. aeruginosa를 각각 사용하였다. 페닐알라닌 생성을 위한 양성 대조군으로는 Proteus vulgaris를, 음성 대조군으로는 E. coli를 각각 사용하였다.

양성 대조군 또는 음성 대조군으로 사용한 모든 균주는 서울대학교 수의과대학 전염병학 실험실에 제공받은 것이다.

그 결과, L43과 L45 균주에서 약한 α-헤모라이시스(hemolysis)가 관찰되었다. 또한 L42 균주에서만 암모니아 생성이 관찰되었다. 인돌 생성 및 페닐알라닌 분해(dissolution)는 10개의 락토바실러스 속 균주에서 모두 관찰되지 않았다. 하기 표 1에서 보는 바와 같이, L9, L28, L36, L44, L46, L48 및 L49의 7개 균주가 시험관 내(in vitro)에서 위험성이 관찰되지 않았다.

안정성 평가

	실시예 1에서 선발된 10개의 락토바실러스 속 균주
안정성 평가	L9	L28	L36	L42	L43	L44	L45	L46	L48	L49
용혈반응	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-
암모니아 생성	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-
인돌 테스트	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
페닐알라닌 생성물	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

+: 양성반응

-: 음성반응

안정성 평가를 통하여 생체 내(in vivo) 상태에서의 질병을 야기할 수 있는 균주를 배제하고 7개 균주를 다시 선발하였다.

< 실시예 4>

기능적 특성 조사를 통한 최종 선발

상기 실시예 3의 안정성 검사를 통하여 2차 선발된 7개의 락토바실러스 속 균주 중에서 경구(백신) 운반체로 사용하기 위하여 필요한 기능을 보유하고 있는 균주를 최종적으로 선발하기 위하여, 장 점착능, 항균효과, 내산성, 내담즙성, 내열성, 내건조성 및 과산화수소 생성 여부를 조사하였다.

<4-1> 장점착능 검사( adhesion assay )

장관세포 유사 Caco-2 세포(ATCC HTB-37)를 8-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark) 에 1.5× 10⁵ cells/well이 되도록 분주한 후, 단일층(monolayer)을 형성할 때까지 배양하였다.

배양된 Caco-2 세포들을 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척한 후 200 ㎕의 α-MEM을 보충하고 30분간 배양하였다. 최종 균수가 1× 10⁵ cells/㎖ 가 되도록 200 ㎕의 각 락토바실러스 속 균주의 배양 희석액을 플레이트에 접종한 후, 37℃에서 1시간 배양하였다.

이후, PBS를 이용하여 세척하여 점착하지 않은 균주들을 제거하였다. 200 ㎕의 메탄올을 세포에 처리하여 고정시켰다. 300 ㎕의 김자 염색 용액(Giemsa stain solution, 1:20)(Merck, Darmstadt, Germany)을 이용하여 세포를 염색한 후, 색이 완전히 제거되도록 세척하고, 배양기에서 밤새 건조하였다.

다섯 곳의 임의 장소에서 점착한 락토바실러스를 현미경하에서 각각 관찰하였고, 각 점착능 검사는 세 번 계대한 세포 상에서 두 번 반복하여 측정하였다.

그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이, 7개의 균주 중에서 L9가 가장 높은 장 점착능을 보였다.

장 점착능 검사

	L9	L28	L36	L44	L46	L48	L49
점착능 활성 (Bacterium/x1000 magnitude)	≥100	27± 2.6	70± 26	14± 3.5	19± 6.6	18± 2	20± 16

<4-2> 항균작용 검사(antimicrobial activity assay)

밤새 배양한 각 락토바실러스 속 균주의 배양액을 원심분리하여 상층액을 수거한 후, 96-웰 플레이트에서 LB 브로쓰(broth)에 1:64 비율까지 단계적으로 희석하였다.

장관 내 병원성 및 상재 균주를 지표 균주로 사용하였다. 병원성 균주로는 S. typhi ATCC 19430, S. typhimurium ATCC 14028를 사용하였고, 일반 균주로는 E. coli(서울대학교 수의과대학 전염병학 실험실)를 사용하였다. Pasterella multocia type A(서울대학교 수의과대학 전염병학 실험실)는 비장관성 균주로서 비교 균주로 사용하였다.

배양한 각 균주를 락토바실러스 배양 상층액이 단계 희석되어 준비된 96-웰 플레이트에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 각 웰의 흡광도를 620 nm(GeneQuant pro, amershampharmacia biotech, England)에서 두 시간 간격으로 측정하여 항균효과를 분석하였다.

그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 7개의 락토바실러스 속 균주 모두 항균 효과를 가지고 있는 것으로 나타났으나, 각 검사 균주에 대한 항균 효과는 다르게 나타났다. 모든 락토바실러스 속 균주가 정상 세균총인 E. coli에 대해 억제 효과를 보이지 않았다. 그러나, S. typhi와 S. typhimurium에 대해서는 각 균주의 배양 상층액의 희석 농도에 따라 성장 억제 효과를 보여주었다.

특히, S. typhimurium은 각 균주의 배양 상층액의 1/4 희석액에서 성장이 완전히 멈추었다(하기 표 3의 ^* 표시). 비교 균주로 사용한 P. multocida A에 대해서도 성장 억제 효과가 극명히 나타났다.

항균효과 검사

항균활성	L9	L28	L36	L44	L46	L48	L49
E. coli	-	-	-	±	-	-	-
S. typhi(ATCC 19430)	+	+	+	+	+	+	+
S. typhimurium(ATCC 14028)	+	+*	+*	+*	+*	+*	+*
Pasterella multocia type A	+	+	+	+	+	+	+

<4-3> 내산성, 내담즙성 및 산 생성능

각 실험은 96-웰 플레이트에서 수행하였으며, 각 실험에 사용한 배지는 산성(acidic) MRS 배지(pH 2.0, pH3.0, pH4.0 adjusted with 1.0N NaOH), 0.3% oxgall 함유 MRS 배지 및 정상 MRS 배지이며, late-log phase까지 배양한 1× 10⁶ cells/㎖의 각 락토바실러스 속 균주를 함께 배양하였다.

흡광도의 변화는 620 nm (GeneQuant pro)에서 측정하였으며, 배양 시작 후 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 24시간 후의 흡광도 변화를 비교 관찰하였다. 배양 4시간 후 각기 다른 조건하에서 검사 중인 균주를 MRS 배지에서 37℃의 조건으로 24시간 배양한 후 각 콜로니의 형성 여부를 관찰하였다.

배양액의 산도 변화는 pH 미터 스틱(pH meter stick)과 pH 미터 기계(pH meter machine)으로 측정하였다.

그 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이, 대부분의 락토바실러스 속 균주가 산과 담즙에 대한 저항성을 보였으나, L46에서만 그 저항성이 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다.

또한 양성 대조군(L. casei)에 비해 pH 2에서 성장이 억제되는 것이 관찰되었으나, L46을 제외한 모든 균주가 생존하여 콜로니를 형성하였다. 0.3% 담즙산에 대해서도 유사한 경향이 나타나 L46이 성장이 지연되는 것을 제외하고 대부분 락토바실러스 속 균주가 담즙에 저항성을 보였다. 또한 7개의 락토바실러스 속 균주가 모두 산 생성능을 보유하고 있는 것으로 나타났다.

내산성, 내담즙성 및 산 생성능 조사

		L9	L28	L36	L44	L46	L48	L49
pH 내성	pH 2.0	+	+	+	+	-	+	+
	pH 3.0	+	+	+	+	+	+	+
	pH 4.0	+	+	+	+	+	+	+
내담즙성		+	+	+	+	-	+	+
산 생성능		4.03	4.41	4.32	4.06	4.29	4.49	4.51

<4-4> 내열성 및 내냉성( cold - drying tolerance )

내열성을 알아보기 위하여 밤새 배양한 각 락토바실러스 속 균주를 1× 10⁸ cells/㎖이 되도록 균수를 조정하여 에펜도프 튜브(eppendorf tube)에 각각 분주하였다.

각 튜브를 50, 55, 60, 65, 70, 75 및 80℃로 조정된 수조(water bath)에 10분간 담가 열 충격(Heat-shock)을 유발하였다. 열 충격이 유발된 각 균주를 100㎕ 분주하여 MRS 배지에 접종하였다. 30℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 형성된 콜로니수를 측정하였다.

한편, 내냉성을 알아보기 위하여 각 락토바실러스 속 균주를 20% 스킴 밀크(skim milk)와 함께 동결 건조하였다. 동결 건조된 락토바실러스 속 균주의 생존력을 측정하기 위하여 4℃에서 6개월간 보관하면서 매달 동결 전 배지와 동량의 배지를 첨가하고 단계적으로 희석하여 MRS 배지 상에서 배양 후 형성된 콜로니 수를 측정하였다.

그 결과, 대부분의 락토바실러스 속 균주가 60℃의 온도에 10분간 노출시 저항성을 보였는데, 특히 L9와 L46 균주는 65℃의 온도에서도 저항성을 보여 콜로니를 형성하였다. 또한, 내냉성 검사에선 대부분의 균주가 균수의 변화 없이 6개월간 생존하였으나, L28과 L46 균주는 4개월 이후 급격히 생존 균수가 떨어지는 것으로 관찰되었다.

<4-5> 과산화수소 생성능

TMB(Tetramethyl-benzidine) 배지는 과산화수소-생성 미생물을 탐지하는데 사용되어 왔다(Eschenbach, D. A. et al., 1989. J. Clin. Microbiol. 27, 251-25; Song, Y. L. et al., 1999. J. Clin. Microbiol. 37, 3062-306).

본 실험에서도 상기 TMB 배지를 이용하여 락토바실러스 속 균주의 과산화수소 생성능을 조사하였다. 먼저, 100 ㎖의 MRS 배지를 5.5g MRS 파우더와 1.5g 아가를 사용하여 준비하였다. 상기 배지를 고압멸균된 50℃ 수조에 방치하여 온도를 낮춘 후 미리 준비한 TMB(25 mg)와 HRP(horseradish peroxidase)(1 mg)를 배지에 첨가한 후 약하게 저어 주어 잘 섞이도록 하였다.

준비된 TMB 배지 10 ㎖를 페트리디쉬에 부어 배지를 완성한 후 7개의 락토바실러스 속 균주를 각각 접종하여 30℃에서 24시간 및 48시간 동안 혐기상태로 배양하였다. 과산화수소의 생성은 배지 위에 진한 보라색 콜로니(dark-purple colonies)의 형성으로 판단하였다.

그 결과, 검사된 락토바실러스 속 균주 모두 TMB 배지 상에서 보라색 콜로니를 형성하였다. 이를 통해 7개의 락토바실러스 속 균주가 과산화수소 생성능을 보유하고 있음을 확인하였다.

상기 실시예 <4-1> 내지 <4-5>의 기능적 특성 조사에서 우수한 활성을 나타내는 하나의 균주를 최종적으로 선발하였다. 선발된 균주는 특히 장 점착능 및 내열성 면에서 우수하였다.

상기 균주를 “락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) L09”라 명명하였으며, 이를 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터 (KACC) (경기도 수원시 권선구 서둔동 225 소재)에 2006년 9월 8일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC 9126P).

< 실시예 5>

L. reuteri L09 의 추가적 특성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 최종적으로 선발된 L. reuteri L09의 추가적인 특성 연구를 위해 활성 효소 및 항생제 내성 경향을 조사하였다.

<5-1> 효소 프로파일( ZYM test )

본 발명의 락토바실러스 루테리의 대사 최종 산물을 API ZYM 테스트(bioMeriex, Inc Durham, NC, USA)를 통하여 검색하였다.

구체적으로 설명하면, 배양한 균주를 API 현탁액 배지(suspension medium)에 탁도가 5-6 McFarland가 되도록 준비한 후 스트립(strip)에 접종하였다. 접종된 스트립을 물이 담긴 플라스틱 리드(plastic lid)에 방치 시킨 후 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. ZYM A과 B 시약을 한 방울씩 각 큐플(cupule)에 차례로 첨가하고 5분 후 각 큐플의 색깔 변화를 관찰하였다.

그 결과, 하기 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 L. reuteri L09는 에스터라제(C4), 에스터라제 리파제(C8), 리파제(C14), 류신 아릴아미다제, 발린 아릴아미다제, 크리스틴 아릴아미다제, 산 포스파타제, 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제 및 α-글루코시다제를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

그러나, 알칼린 포스파타제, 트립신, α-키모트립신, β-글루코시다제, N-아세틸-β-글루사미니다제, α-만노시다제 및 α-푸코시다제는 가지고 있지 않았다.

본 발명에 따른 L. reuteri L09의 활성 효소

효소 테스트	L. reuteri L09
대조군	-
알칼린 포스파타제	-
에스터라제(C4)	+
에스터라제 리파제(C8)	+
리파제(C14)	(+)
류신 아릴아미다제	+
발린 아릴아미다제	+
크리스틴 아릴아미다제	(+)
트립신	-
α-키모트립신	-
산 포스파타제	+
나프톨-AS-BI-포스포히드롤라제	+
α-갈락토시다제	+
β-갈락토시다제	+
β-글루쿠로니다제	+
α-글루코시다제	+
β-글루코시다제	-
N-아세틸-β-글루사미니다제	-
α-만노시다제	-
α-푸코시다제	-

+: 양성, (+): 의양성, (-):음성

<5-2> 항생제 내성

본 발명에 따른 L. reuteri L09의 항생제 내성 경향을 알아보기 위하여 각 항생제에 대한 MIC(minimum inhibitory concentration) 검사를 실시하였다. NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)에 따라 15종류의 항생제에 대해 마이크로-희석(micro-dilution) 법으로 시행하였다.

구체적으로, 각 항생제를 0.5 내지 500 g/㎖의 범위로 96-웰 플레이트에 단계적으로 희석하여 준비한 후, 100 ㎕의 L. reuteri L09(1× 10⁵ cfu/㎖)를 접종하여 배양하고, MIC에 대한 결과를 판독하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

발명의 L. reuteri L09는 카나마이신, 반코마이신, 에리쓰로마이신, 날리식산, 티로신 및 니스태틴에 대해 높은 MIC를 나타내었다. 그러나, 페니실린(암피실린, 아목시시실린) 및 클로람페니콜(클로람페니콜, 플로르페니콜)에 대해서는 감수성을 보이는 경향이 있었다.

본 발명에 따른 L. reuteri L09의 항생제 내성

항생제		MIC(㎍/㎖)
아미노글리코시드 (aminoglycoside)	카나마이신	128
	겐타마이신	16
페니실린 (penicillin)	암피실린	4
	아목시실린	1
세파로스포린 (cephalosporins)	세폭시틴	56
	세포탁시모	32
글리코펩티드 (glycopeptide)	반코마이신	≥500
클로람페니콜	클로람페니콜	8
	플로르페니콜	16
마크로리드 (macrolide)	에리쓰로마이신	≥500
퀴놀론 (quinolones)	날리딕산	≥500
	노보비오신	4
	티로신	≥500
니스태틴	니스태틴	≥500
리팜핀 (rifampin)	리팜피신	≤0.5

<5-3> 항생제 내성 유전자의 검출

생체 내성 유전자는 aph(2")-Id, lnu(A), mefA, tet(K), tet(W), vanE, vatC and vatD 에 대해 PCR 기법을 이용하여 존재 여부를 알아보았다 (Kleerebezem, M., Beerthuyzen, M.M., Vaughan, E.E., de Vos, W.M. and Kuipers, O.P. 1997. Controlled gene expression systems for lactic acid bacteria: transferable nisin-inducible expression cassettes for Lactococcus, Leuconostoc, and Lactobacillus spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 4581-4584).

또한, Lactobacillus spp.의 경우 내성 유전자 없이 vancomycin resistance를 증명하기 위하여 van A, B, 그리고 C에 대한 추가적인 실험을 하기 표 7과 같이 실시하였다 (Oatley, J.T., Rarick, M.D., Ji, G.E. and Linz, J.E. 2000. Binding of aflatoxin B1 to Bifidobacteria in vitro. J. Food Prot. 63, 1133-113; Tynkkynen, S., Singh, K.V. and Varmanen, P. 1998. Vancomycin resistance factor of Lactobacillus rhamnosus GG in relation to enterococcal vancomycin resistance (van) genes. Inter. J. Food Microbiol. 41, 195-204).

본 발명의 L. reuteri L09는 항생제 내성 유전자를 가지고 있지 않았다 (표 8). 하기 표 8에서 보는 바와 같이, tet(W)와 lnu(A) 유전자만 L36과 L44에서 탐지 되었다.

이는 내성 유전자가 아닌 본 발명의 L. reuteri L09 자체의 구조적 특성에 의해 내재된 저항성임을 의미하며, 이로 인해 최근 문제시 되는 항생제 내성 유전자 전이 문제없이 항생제에 저항 할 수 있는 균주를 사용할 수 있음을 뜻한다.

이는 축산 산업에서 예방적으로 항생제를 사용하는데, 이때 장관 내에서 항생제에 영향을 받지 않고 오래 생존할 수 있음을 말하는 것으로써 안정성과 효능 면에서 아주 뛰어난 효과를 발휘할 것으로 사료된다.

<실시예 6>

L. reuteri L09 로부터 플라스미드의 분리 및 이의 특성 분석

상기 실시예 1에서 본 발명의 L. reuteri L09가 플라스미드 DNA를 보유하고 있는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 상기 L. reuteri L09로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 이의 특성을 규명하였다.

<6-1> 플라스미드 DNA 의 분리

본 발명의 L. reuteri L09를 MRS 배지(Merck)에서 30°C의 조건으로 혐기상태로 정치배양하였다.

이후, 도 1에 도시된 방법에 따라 L. reuteri L09 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리한 전체 플라스미드 DNA를 SalI, SphI, EcoRI, PstI, XhoI, BamH, KpnI, HindⅢ, SmaI, XmaI 및 ApaI(Takara)의 제한 효소로 처리한 후 제한 효소 지도를 작성하였다.

L. reuteri L09의 전체 플라스미드 DNA를 여러 제한 효소를 이용하여 분석한 결과, SalI 및 HindⅢ의 두 효소가 원-컷 사이트(one-cut site)를 가지고 있었다.

이를 통해 L. reuteri L09는 10 kb이하의 플라스미드 DNA 두 개를 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Primose, S., Twyman, R. and Old, B. 2001. Principles of Gene Manipulation, 6th ed. Blackwell Science Ltd. London, UK. p43-63). 그 중 제한 효소 분석에 의해 약 7kb 크기의 플라스미드 DNA를 “pILR091”이라 명명하였다.

이후, 원-컷 사이트인 SalI을 이용하여 pILR091을 E. coli 벡터인 pQE30Xadp 에 클로닝하였다. 먼저, SalI으로 pILR091을 절단하여 이를 선상 플라스미드 DNA로 생성하였다. 선상 플라스미드 pILR091를 동일한 제한효소로 절단된 pQE30Xa 발현 벡터(QIAGEN)와 20℃에서 5시간 동안 라이게이션(ligation)시킨 후, 컴페턴트(competent) E. coli M15에 열충격 방법(heat shock method)을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환체는 25㎍/ml의 카나마이신과 100㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 아가에 분주(plating)하여 37℃의 조건에서 16시간 배양하였다. 이후, 클로닝된 유전자는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

<6-2> 시퀀싱

염기서열은 ABI 377 자동화 DNA 시퀀서(Perkin-Elmer)를 이용하여 분석하였다. 하기 표 9에 나타낸 pQE-유니버설 프라이머(서열번호 28 및 서열번호 29)와 5쌍의 워킹 프라이머(서열번호 30 내지 서열번호 39)를 이용하여 pILR091의 전체 유전자 염기서열을 얻었다. 얻은 전체 유전자 염기서열은 새로 제작한 6쌍의 워킹 프라이머(서열번호 40 내지 서열번호 51)를 이용하여 PCR로 증폭하여 재확인하였다.

프라이머 워킹을 통한 시퀀싱에 사용된 프라이머의 염기서열

시퀀싱 타켓	프라이머	방향	염기서열	서열번호
pIL-01	pQE primer a	정방향 (Forward)	5'-CCCGAAAAGTGCCACCTG-3'	28
	pQE primer a	역방향 (Backward)	3'-GGTCTTACTGGAGTCTTG-5'	29
	왼쪽	Part #1	ACCATCACCATCACGGAT	30
		Part #2	TCACTTTGGCGTTTAAGTTGG	31
		Part #3	AGACAGCAAGGTCTTGTTTATGAAT	32
		Part #4	CGACCATTTTAGAAAGGAGTAGG	33
		Part #5	TATTATCAGCTTGAACTTGGCTCAT	34
	오른쪽	Part #1	AGTTCCCGCAATGGACTATG	35
		Part #2	GAATCTCAATCTTTGATGCGTTT	36
		Part #3	GACTTCCATACCATGTTTACCAG	37
		Part #4	ATTCTACTGATACCAACCAATTC	38
		Part #5	GTCGAAGCCCTAACTAGATTTGAC	39
pILR091	Portion #1	정방향	5'-TTATTGTGGTGTTGCTGTAACAG-3'	40
		역방향	3'-AGCTCTCTAGCGTAATTTGAACG-5'	41
	Portion #2	정방향	5'-CGCAAGTTAGGGTTATGAATATCTG-3'	42
		역방향	3'-TCAAAATCATATCGGAATTCTTGTT-5'	43
	Portion #3	정방향	5'-CGCATATTCACATTGTTTTGATTAC-3'	44
		역방향	3'-TTGATCCATTTTTGGGTAGTCTT-5'	45
	Portion #4	정방향	5'-ATCTTGATTGAGTATGGTGTTTGGT-3'	46
		역방향	3'-GTTATCATGTTGGCTTGAATGAA-5'	47
	Portion #5	정방향	5'-TTGATGAGTTCGATTACATTTGA-3'	48
		역방향	3'-CGATAATGTTGACAATTAACAAACG-5'	49
	Portion #6	정방향	5'-CATCTGAAACAAGTCAAAGAGGA-3'	50
		역방향	3'-TTACAGGTCCACCATAATAATCACC-5'	51

^a: pQE-유니버설 프라이머(pQE universal primers)

시퀀싱을 통해 pILR091의 전체 염기가 7,185bp임을 확인하였으며, 이의 염기서열을 서열번호 1로 기재하였다. 또한 pILR091의 전체 효소 부위를 염기서열 분석을 통해 재검증하였으며, 그 결과를 도 5에 도시하였다.

<6-3> pILR091 염기서열의 분석

상기 실시예 <6-2>로부터 얻어진 염기서열은 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 염기서열간 유사성을 분석하였으며, ORF 파인더(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 이용하여 각 ORF를 찾아내었다. 또한 DNasist(v1.02)를 이용하여 염기서열간의 유사성과 염기서열의 화학적 및 물리적 특성을 조사하였다.

a. G-C 함량 분석 결과

pILR091의 전체 G-C 함량은 39%이었으며, 이는 L. reuteri의 게놈 DNA의 G-C 함량과 유사하였다. 구체적으로 G 함량은 1,505 nucleotides(20.9%), T는 2,063 nucleotides(28.7%), A는 2,319 nucleotides(32.3%) 그리고 C는 1,298 nucleotides(18.1%)이었다. 본 발명에 따른 pILR091의 각 ORF와 락토바실러스 균주 유래 게놈 DNA의 ORF 간의 G-C 함량 비교 결과를 도 10에 도시하였다.

b. 추정되는 단백질 부위( putative replication region )의 확인 및 상대적인 비교 결과

타 연구를 통하여 알려진 RCR-플라스미드의 컨센서스 닉-사이트 서열(consensus nick-site sequence)을 본 발명의 pILR091에 적용한 결과, 본 발명의 pILR091의 서열상에 pC194-RCR 패밀리 서열(TCTTATATCTTGATAC)(Desmond, C., Ross, R.P., Fitzgerald, G. and Stanton, C. 2005. Plasmid. 54, 160-175)과 L. curvatus LTH 유래 플라스미드의 ori 사이트(TACTACGA)(Le Bourgeois, P., Lautier, M., Mata, M. and Ritzenthaler, P. 1992. J. Bacteriol. 174, 6752-6762)가 존재함을 알 수 있었다(도 6 참조).

pC194-RCR의 서열은 복제 단백질 서열인 ORF1의 63bp 상부(upstream)에 위치하고 이것은 다른 락토바실러스의 ori 사이트와 높은 유사성이 나타내었다(도 7 참조). 한편, L. curvatus의 ori 사이트(Klein, J. R., Ulrich, C. and Plapp, R. 1993. Plasmid. 30, 14-29)는 ORF3 서열에 위치하였나, 복제 단백질로 밝혀진 ORF 서열은 찾을 수가 없었다(도 6 참조).

결과적으로 본 발명에 따른 pILR091의 추정되는 복제 원점(TTTATATTGAT)은 pC194-RCR 패밀리에 속하기는 하나 염기서열에서 다소 차이점이 있는 것으로 나타났다.

또한 2가지 타입의 반복된 염기서열이 본 발명의 pILR091의 ORF3 상에서 발견되었다 (도 6 참조). 첫 번째 염기서열은 10-bp 직접 반복 서열(NTGA(T/C)(T/G)T(T/A)NN)로 4회 반복되며, 두 번째 염기서열은 20 또는 21bp 추정되는 인테론(putative iteron)(ANNNAAAANNNN(3or4)ANNNNANAA)으로 4.5회 반복되었다.

c. 추정되는 ORFs 의 일반적인 특성 조사 결과

본 발명의 pILR091에서는 총 5개의 ORF가 확인되었다(도 6 참조). 코딩 서열은 모두 4,966 nucleotides이고 이는 플라스미드 크기의 70.4%를 차지하고 있다. 또한 pILR091에는 1개의 ORF의 잔제(orf6)로 예상되는 구조도 있다(도 6 및 도 8 참조).

c-1. 추정되는 복제 단백질

본 발명에 따른 pILR091의 ORF1은 플라스미드 DNA의 복제를 담당하는 것으로 밝혀졌으며, L. reuteri 뿐만 아니라 오에토코커스 오에니(Oenococcus oeni)(Genebank Access. No. BAD91409.1, E-value 4e-09, 24% identity No. NP_254271.1, E-value 9e-09, 22% identity)와 같은 다른 그람 양성 세균의 복제 단백질과도 상동성을 보였다.

비록 낮은 E-value를 보였지만 스타필로로커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(No. YP_492679., E-value, 0.18, 21% identity; No., AAM94141.1, E-value 0.14, 22% identity; No. CAD55143.1, E-value 0.31, 21% identity)의 복제 단백질과도 상동성을 보였다.

그러나 ORF1의 경우 다른 락토바실러스 속의 복제 단백질 서열 상의 유사성은 낮았는데, 특히 같은 L. reuteri에서 분리된 플라스미드인 pTE44조차와도 낮은 유사성을 보였다(도 9 참조).

c-2. 추정되는 ORFs

본 발명의 pILR091의 ORF2는 푸소박테리움 뉴클레툼. 빈센티(Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii) ATCC 49256의 헤모라이신(hemolysin)과 유사성을 보였다(도 8 참조).

비록 낮은 E-value지만 Knob-associated histidine-rich protein precursors와도 유사성을 보였다. 그러나, ORF3과 ORF4는 다른 물질과의 유사성이 없는 것으로 나타났다. 반면, ORF5는 높은 아미노산 동일성(100%)과 E-value (7e-20)를 보였으나, 그 기능은 아직 명확히 밝혀지지 않았다.

한편, ORF6은 101개의 아미노산의 긴 가상 단백질(101aa long hypothetical protein), 2-옥소글루타레이트 디히드로게나제 E1 구성요소(2-oxoglutarate dehydrogenase E1 component), 열 충격 단백질(heat shock protein) 16.9 등과 높은 아미노산 염기서열의 유사성을 보였으나 종결 유전 코드(termination genetic code)인 TAA, TGA 그리고 TAG가 관찰되지 않는 것으로 보아 ORF의 잔제로 사료되었다(도 8 참조).

이와 같이 본 발명에 따른 pILRO91의 각 ORF의 정체성과 특성을 단백질 데이터를 바탕으로 BLAST 프로그램을 조사하였으나, 정체성과 기능 그리고 E-value 등이 L. reuteri 유래의 데이터를 제외하면 전반적으로 낮은 수치를 보였다.

<6-4> 플라스미드 복제수의 산출 및 안정성 조사

a. 복제수 산출

플라스미드 DNA의 복제수를 계산하기 위하여 정량(quantitative)-PCR을 실시하였다. 절대수치를 구하기 위하여 pILR091의 일부를 클로닝한 5.6kb의 pIL-01의 농도를 구한 후 이를 기준으로 절대치를 구하였다(Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. 2001. Methods. 25, 386-401).

십진 계단 희석(Ten-fold serial dilution)한 pIL-01을 표준 샘플로 하여 각각 PCR을 실시하였다. 총 DNA 와 표준 샘플의 농도를 구한 후 각 샘플을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 프라이머(서열번호 52 내지 서열번호 53)는 복제 부위가 포함될 수 있도록 제작하였다(하기 표 10 참조).

PCR은 총 25 사이클 반응시켰으며 다음과 같은 조건으로 실험을 진행하였다: 변성 94℃에서 30초; 어닐링 55℃에서 30초; 및 신장 72℃에서 30초. PCR 산물은 아가로스 겔 상에서 분석하였다.

플라스미드 복제수 산출에 사용된 프라이머의 염기서열

타켓	프라이머 명	방향	염기서열	서열번호
pILR091	ori frag.b	정방향	5'-ACCCTCTGATTCGGTGTTTG-3'	52
		역방향	3'-AGTTCCCGCAATGGACTATG-5'	53

^b: frag. meant the fragment of pILR091

아가로스 겔 상의 DNA 밀도(density)를 Quantity-Oneprogram(Bio-Rad, Hercules, CA., U.S.A)을 이용하여 구한 후, 이를 통해 얻어진 표준식을 이용하여 플라스미드 DNA의 양과 복제수를 산출하였다. 게놈 DNA의 양은 총 DNA에서 플라스미드 DNA의 양을 뺀 부분이며, 산출식(Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. 2001. Methods. 25, 386-401)을 통해 얻어낸 플라스미드 DNA와 게놈 DNA의 양을 비교하여 복제수를 산출하였다.

게놈 DNA의 크기는 락토바실러스 속 균주들의 일반적인 게놈 DNA 크기인 1.84-2.36Mb의 평균치인 2Mb로 하였다(Abs El-Osta, Y.G., Hillier, A.J., Davidson, B.E. and Dobos, M. 2002. Electrophoresis. 23, 3321-3331; El-Osta, Y.G., Hillier, A.J. and Dobos, M. 2005. Microbiology. 151, 875-892; Le Bourgeois, P., Lautier, M., Mata, M. and Ritzenthaler, P. 1992. J. Bacteriol. 174, 6752-6762; Lortal, S., Rouault, A., Guezenec, S. and Gautier, M. 1997. Curr. Microbiol. 34, 180-185).

그 결과, DNA의 밀도는 1ng 의 pIL-1(9.1kb)와 10ng의 게놈 DNA(2Mb)에서 동일하게 나왔다. 따라서, 전체 DNA인 10 ng에서 플라스미드 DNA의 질량인 1ng을 뺀 9ng이 게놈 DNA의 양이다. 이를 바탕으로 the equation of Giulietti A(Methods. 25, 386-401, 2001)을 적용하면 1ng의 pIL-01은 1 x 10⁸ molecules이 되며 9ng의 게놈 DNA는 4.095 x 10⁶ molecules을 보유하고 있게 된다. 게놈 DNA와 플라스미드의 분자수를 비례로 나타내면 약 1:24.5가 되며, 이로부터 pILR091의 복제수가 24~25임을 확인할 수 있었다.

b. 안정성 조사

또한 pILR091의 안정성을 알아보기 위하여 L. reuteri L09를 항생제가 들어있지 않는 MRS 10ml에 배양하였다. 10㎕ 의 배양액을 10^-3배 희석이 되도록 신선한 MRS 10ml에 24시간 간격으로 재접종하여 20계대를 한 후 상기 실시예 <6-4>의 a.에 기재한 방법으로 플라스미드의 복제수를 구하였다.

그 결과, 20 계대 후에도 본 발명의 pILR091의 복제수(24~25)는 지속되었으며, 이를 통해 본 발명의 pILR091이 숙주인 락토바실러스에서 안정적으로 증식됨을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 락토바실러스가 가지고 있는 플라스미드 pILR091은 셔틀 벡터 제작을 위한 조작에 의해서도 복제수를 안정적으로 유지할 것을 나타낸다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 돼지 분변으로부터 신규 유산균을 분리하고 이의 특성을 규명하였다. 본 발명의 락토바실러스 루테리는 숙주로 사용할 경우 생체 내에서 질병 발생 가능성이 없으며, 경구 운반체로 사용하기 위해 필요한 기능을 보유하고 있다는 장점이 있다.

특히, 본 발명의 락토바실러스 루테리는 경구 운반체를 위한 셔틀 벡터로 개발될 수 있는 신규 플라스미드를 가지고 있다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 루테리는 경구 운반체, 생균제, 정장제, 항균제 및 사료첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pILR091을 함유하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri).
2. 제1항에 있어서, 에스터라제(esterase), 에스터라제 리파제(esterase lipase), 리파제(lipase), 류신 아밀아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase), 크리스틴 아릴아미다제(crystine arylamidase), 산 포스파타제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다제(galactosidase), β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(glucuronidase) 및 α-글루코시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 발현하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리.
3. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리는 기탁번호 KACC91266P인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리.
4. 제1항의 락토바실러스 루테리 또는 이의 배양물을 포함하는 생균제(probiotics) 조성물.
5. 제1항의 락토바실러스 루테리 또는 이의 배양물을 포함하는 항균용 조성물.
6. 제1항의 락토바실러스 루테리 또는 이의 배양물을 포함하는 사료용 조성물.
7. 제1항의 락토바실러스 루테리 또는 이의 배양물을 포함하는 정장용 조성물.
8. 삭제

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