KR102234835B1 - 신규한 락토바실러스 루테리 lbr_c1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스 lba_c5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 루테리 lbr_c1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스 lba_c5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물 Download PDF

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김동욱
황영민
박영빈
정성영
김철
강재구
김양선
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우진 비앤지 주식회사
재단법인 농축산용미생물산업육성지원센터
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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물에 관한 것으로서, 상기 균주들은 병원성 세균에 대한 항균능 및 면역증강효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 사료 또는 사료첨가제 조성물로서 이용할 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물{Composition for enhancing immunity of companion animals comprising novel Lactobacillus Luteri LBR_C1 strain and novel Lactobacillus Ashdophilus LBA_C5 strain}
본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
생균제는 일반적으로 숙주에 유익한 작용을 하는 미생물 제제 또는 미생물의 성분으로 정의된다. 일반적으로 생균제용 미생물로는 유산균을 많이 사용하고 있는데, 그중에서 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 대표적인 균주로 알려졌다. 유산균은 동물의 장내세균총 생태계 균형 유지와 병원성 세균의 억제에 중요한 역할을 하는 유익한 균으로 알려졌는데, 일반적으로 소장에는 락토바실러스, 엔테로코커스 등의 통기성 유산균이, 대장에는 비피도박테리움과 같은 편성혐기성 유산균이 우점종으로 분포하고 있다.
생균제의 체내 유용효과는 크게 항균성 물질의 생산을 통한 길항작용, 병원체의 부착부위나 영양성분의 경쟁, 숙주의 조절작용, 세균의 독소 생성 및 활성의 억제 작용이다. 이 외에도 생균제는 비타민 E, 유기산, 아미노산 등의 소화 및 흡수개선, 비타민 B군의 합성, 장내 면역반응 증가, 혈중 IgG 수준 조절, 대식세포의 활성과 면역기능 향상 등 다양한 작용을 하는 것으로 보고되고 있다.
우수한 생균제가 갖추어야 하는 특성으로는 위산에 대한 내산성, 담즙산에 대한 내담즙성, 장 상피세포에 대한 부착성, 병원성 세균에 대한 항균물질 생성능, 숙주에 대한 면역활성능력 등 다양한 특성이 요구되고 있다.
현재 세계적으로 개 생균제용 유산균주 개발에 대한 연구는 다른 산업동물에 비해 부족한 상태이지만, 안전하고 항생제를 대체할 수 있다는 장점과 친환경적 소재를 선호하는 최근의 경향에 맞추어 점차 그 사용빈도가 증가하고 있다. 국내에서도 아직 개 생균제 개발에 대한 연구는 초기단계이지만, 생균제에 대한 관심은 더욱 높아질 것으로 예상한다.
개의 장내세균총은 품종, 사육환경, 사료 등 다양한 요인에 따라 변화하며, 종 특이성을 포함하기 때문에, 개 생균제용 유산균주는 개 유래의 균주를 사용하는 것이 가장 이상적임에도 불구하고, 국내에서는 출처가 불분명한 다양한 외부 유래의 생균제용 균주도 사용되고 있다.
국내공개특허 제10-2018-0053169호, "생쥐의 락토바실러스 존스니 및 이를 이용한 면역증진용 조성물" (2018.05.21) 국내등록특허 제10-2003822호, "반려동물의 모질을 개선하는 효능을 갖는 유산균과 이를 포함하는 생균제 조성물을 유효성분으로 함유하는 모질 개선을 위한 동물 사료용 첨가제 및 동물 사료 조성물" (2019.07.19)
이에 본 발명자들은 개 분변에서 분리된 유산균인 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주, 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주의 병원성 세균에 대한 항균 효과 및 면역증강 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강용 생균제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강용 생균제 조성물을 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강용 생균제 조성물을 함유하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주, 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강 용도에 관한 것이다.
본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 2종의 균주는 백신 접종에 따른 항체 형성 효율을 강화하는 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 국내의 소형견 분변으로부터 생균제용 유산균을 분리하고 생균제가 갖추어야 할 특성 조사와 함께, 면역 활성 검증을 통해 개 생균제로 사용하기에 가장 적합한 유산균을 선발, 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주이다.
본 발명의 다른 양태는 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주이다.
본 발명의 또 다른 양태는 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강용 생균제 조성물이다.
상기 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주는 5:1 내지 1:5, 5:1 내지 1:3, 5:1 내지 1:1, 3:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3, 3:1 내지 1:1, 1:1 내지 1:5 또는 1:1 내지 1:3의 비율로 포함되는 것일 수 있고, 예를 들어, 1:1의 비율로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생균제 조성물은 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주를 1.0*106 cfu/g 내지 1.0*1010 cfu/g, 1.0*106 cfu/g 내지 1.0*109 cfu/g, 1.0*106 cfu/g 내지 1.0*108 cfu/g, 1.0*107 cfu/g 내지 1.0*1010 cfu/g, 1.0*107 cfu/g 내지 1.0*109 cfu/g, 1.0*107 cfu/g 내지 1.0*108 cfu/g, 1.0*108 cfu/g 내지 1.0*1010 cfu/g 또는 1.0*108 cfu/g 내지 1.0*109 cfu/g, 예를 들어, 1.0*108 cfu/g의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생균제 조성물은 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 1.0*106 cfu/g 내지 1.0*1010 cfu/g, 1.0*106 cfu/g 내지 1.0*109 cfu/g, 1.0*106 cfu/g 내지 1.0*108 cfu/g, 1.0*107 cfu/g 내지 1.0*1010 cfu/g, 1.0*107 cfu/g 내지 1.0*109 cfu/g, 1.0*107 cfu/g 내지 1.0*108 cfu/g, 1.0*108 cfu/g 내지 1.0*1010 cfu/g 또는 1.0*108 cfu/g 내지 1.0*109 cfu/g, 예를 들어, 1.0*108 cfu/g의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주는 탄소원 4% 및 질소원 2%를 함유하는 배양조건에서 배양되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주는 탄소원 2% 및 질소원 2%를 함유하는 배양조건에서 배양되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 가축군은 소, 돼지, 양, 닭 및 오리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 반려동물군은 개 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강용 생균제 조성물을 함유하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 생균제 조성물의 약제학적 유효량 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 홍역(distemper), 간염(hepatitis), 파보장염(parvovirus) 및 파라인플루엔자(parainfluenza)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 감염질환에 대하여 항체 형성 효율을 증가시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 생균제 조성물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 가축군 또는 반려동물군에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군 또는 반려동물군의 면역 증강용 생균제 조성물을 함유하는 사료 조성물이다.
본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주 및 신규한 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주를 포함하는 반려동물의 면역 증강용 조성물에 관한 것으로서, 상기 균주들은 병원성 세균에 대한 항균능 및 면역 증강 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 사료 또는 사료첨가제 조성물로서 이용할 수 있다.
도 1은 다양한 탄소원에 대한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주의 배양 생장률을 확인한 그래프이다.
도 2는 다양한 질소원에 대한 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주의 배양 생장률을 확인한 그래프이다.
도 3은 탄소원의 농도별 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주의 배양 생장률을 확인한 그래프이다.
도 4는 질소원의 농도별 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주의 배양 생장률을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 신규 미생물의 분리 및 동정
1-1. 신규 미생물의 분리
분리원으로 사용된 시료는 화성시 근교 일반 가정집과 주변 공장에서 사육하고 있는 포유자견(2 내지 4주령) 4마리, 이유자견(2 내지 3개월령) 5마리, 성견(1 내지 6세) 6마리의 합계 15마리로부터 분변을 채취하여 사용하였다. 품종은 푸들, 말티즈, 시추, 포메라니안, 잡종견 등을 사용하였다.
분리원으로부터 적당량의 시료를 취하여 균질기(glass homogenizer, pyrex)에서 균질화한 후, 멸균 희석액으로 십진 희석하였다. 희석액을 MRS 배지(medium)(Difco)에 도말 접종한 다음 37℃, 72시간 동안 혐기배양 하였으며, MRS 한천 플레이트(agar plate)에서 유백색의 단일 콜로니(colony)를 분리, 수 회 계대 배양 순수화하여 얻은 약 400종의 균주를 실험에 사용하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 2종의 균주를 최종 선별하였다.
1-2. 신규 미생물의 동정
분리한 2종의 균주에 대해 API 50CHL 키트를 이용하여 당 이용성을 확인하였다. 분리된 균주의 당 이용성을 하기 표 1에 나타내었다. 당 이용도를 바탕으로 한 생화학적 특성은 각각 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)와 유사한 것으로 나타났다.
당 발효(Sugar-fermentation)
Glycerol　 Negative Salincin　 Positive
Erythritol　 Negative D-Cellobiose　 Negative
D-Arabinose　 Negative D-Maltose　 Positive
L-Arabinose　 Negative D-Lactose (bovine)　 Positive
D-Ribose　 Negative D-Melibiose　 Negative
D-Xylose　 Negative D-Saccharose(sucrose)　 Positive
L-Xylose　 Negative D-Trehalose　 Positive
D-Adonitol　 Negative Inulin　 Negative
ß-Methl-D-Xyrose　 Negative D-Melazitose　 Negative
D-Galactose　 Positive D-Raffinose　 Positive
D-Glucose　 Positive Amidon (Starch)　 Negative
D-Fructose　 Positive Glycogen　 Negative
D-Mannose　 Positive Xylitol　 Negative
L-Sorbose　 Negative Gentiobiose　 Positive
L-Rhamnose　 Negative D-Turanose　 Negative
Duleitol　 Negative D-Lyxose　 Negative
Inositol　 Negative D-Tagatose　 Negative
D-Mannitol　 Negative D-Fucose　 Negative
D-Sorbitol　 Negative L-Fucose　 Negative
Methyl-α D-Mannopyranoside Negative D-Arabitol　 Negative
Methyl-αD-Glucopyranoside Negative L-Arabitol　 Negative
N-Acethyl-Glucosamine Positive Potassium Gluconate　 Negative
Amygdalin　 Negative Potassium 2-Keto-Gluconate Negative
Arbuitin　 Positive Potassium 5-Keto-Gluconate Negative
Esculin ferric citrate　 Negative 　　
분리된 균주를 MRSA 배지에서 24시간 동안 배양하여 한국미생물보존센터에 동정 의뢰하였다. 표 2의 분리 균주 2종의 16s rRNA 유전자 염기서열은 각각 락토바실러스 루테리 및 락토바실러스 아시도필러스와 99.0%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규 미생물이 각각 락토바실러스 루테리 및 락토바실러스 아시도필러스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
서열번호 명칭 서열
1 LBR_C1 균주 16s rRNA CAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCGCATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGACG
2 LBA_C5 균주 16s rRNA ACATGCAGTCGAGCGAGCTGAACCAACAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC
실시예 2: 신규 미생물의 특성화
2-1. 내산성 및 내담즙성 평가
내산성 실험은 pH 1.5 및 2.5으로 각각 조절한 인산염 완충액에 초기 균수가 108 CFU/ml이 되도록 시험균을 접종하여 수행하였다. 이들을 pH 1.5에서 30분 및 1시간, pH 2.5에서 2시간 동안 반응시킨 후 생균수(CFU/ml)를 측정하여 생존율을 측정하였다.
내담즙성 실험은 담즙염 0.3% 및 1%로 각각 조절한 인산염 완충액에 초기 균수가 108 CFU/ml이 되도록 시험균을 접종하여 수행하였다. 이들을 4시간 동안 반응시킨 후 생균수(CFU/ml)를 측정하여 생존율을 측정하였다.
내산성(Acid tolerance)
0 h pH 1.5, 30min pH 1.5,
1 hr		 pH 2.5,
2 hr
LBR_C1 생균수 7.57 ± 0.05a 7.26 ± 0.00c 3.58 ± 0.10d 7.42 ± 0.01b
LBR_C1 생존율(%) 　 95.9 47.3 98.1
LBA_C5 생균수 5.85 ± 0.07b - - 5.43 ± 0.12c
LBR_C5 생존율(%) 　 0 0 92.9
내담즙성(Bile tolerance)
0.3%,
2 hr		 1.0%,
2 hr
LBR_C1 생균수 7.61 ± 0.02a 7.65 ± 0.07a
LBR_C1 생존율(%) 100.6 101.1
LBA_C5 생균수 6.16 ± 0.13a 6.32 ± 0.03a
LBR_C5 생존율(%) 105.3 107
표 3 및 4에서 확인할 수 있듯이, 내산성 평가 결과 본 발명의 분리 균주인 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주는 pH 2.5의 산성 조건에서도 안정하게 생균수가 유지되고 있어, 균주의 내산성을 확인할 수 있었다.
또한 내담즙성 평가 결과 본 발명의 분리 균주인 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주는 1%의 담즙염 조건에서도 안정하게 생균수가 유지되고 있어 균주의 내담즙성을 확인할 수 있었다.
2-2. 항생제 내성 평가
항생제 내성 평가는 항생제 11종을 마이크로 희석(micro-dilution) 방법을 이용하여 수행하였으며, 각 항생제는 Sigma 사로부터 구입하여 사용하였다.
항생제의 농도는 MRS 배지를 이용하여 256, 128, 32, 16, 8, 4, 2, 1 및 0.5 ug/ml의 농도로 희석하여 준비하였으며, 항생제가 포함된 희석액을 96 웰 플레이트에 100 ul씩 분주하고 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 1% 접종 후 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 OD660 값을 측정함으로써 각 항생제 별 최소성장저해농도 (Minimal Inhibition Concentration, MIC)를 측정하였다. 실험의 오차를 줄이기 위하여 모든 실험은 3회 반복하였고, 이들의 평균값을 취한 후 MIC 값을 최종 측정하였다.
각 균주에 대한 MIC는 다음의 방법으로 결정하였다. 실험군과 동일한 실험기간에 항생제가 포함되지 않은 MRS 배양액 100 ul에 균주를 1% 접종한 후 곧바로 -4℃에 보관하였다. 16시간 후 -4℃에서 균주의 성장을 억제시킨 군의 OD값을 기준으로 하여 실험군에서 그 이하의 OD660 값을 보이는 항생제의 농도를 MIC로 정의하였다.
락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주의 각 항생제에 대한 MIC 값은 표 5에 표시하고, 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주의 MIC 값은 표 6에 표시하였다. 정량적 항생제 감도는 미생물 균주에 대한 최소 억제 농도로 표현되고, 내성 (≥32 및 256 ug/ml, R) 또는 항생제에 민감한 것으로 분류하였다.
항생제(Antibiotics) 항생제 감도(Antibiotic sensitivity)
Lactobacillus reuteri LBR_C1
Amoxcillin/Clavulanic acid ≥0.38
Ampicillin ≥0.25
Clindamycin ≥0.032
Erythromycin ≥0.75
Gentamicin ≥4
Impenem ≥0.047
Kanamycin R
Metronidazole R
Tetracycline ≥8
Trim/Sulfa R
Vancomycin R
항생제(Antibiotics) 항생제 감도(Antibiotic sensitivity)
Lactobacillus acidophilus LBA_C5
Amoxcillin/Clavulanic acid ≥0.5
Ampicillin ≥0.25
Clindamycin ≥4
Erythromycin ≥0.25
Gentamicin ≥16
Impenem ≥0.064
Kanamycin R
Metronidazole R
Tetracycline ≥1
Trim/Sulfa R
Vancomycin ≥0.5
표 5 및 6에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주는 대부분의 항생제에 대해서 대부분 낮은 농도에서 생육이 억제되었으나 일부 항생제에 대해 내성이 있는 것을 확인하였다. 공통적으로 카나마이신(Kanamycin), 메트로니다졸(Metronidazole) 및 Trim/Sulfa에서 내성을 확인하였고 LBR_C1은 반코마이신(Vancomycin) 에서도 내성을 가지는 것을 확인하였다. 이들 경구용 항생제와 병용사용 시에도 죽지 않고 장까지 도달하여 항생제 급여 시 설사 발생을 예방할 수 있을 것으로 예상된다.
2-3. 일반 세균 및 설사 유발 세균 억제 실험
일반 세균 및 설사 유발 세균 억제 시험은 MRS 배지(broth)에 선발 균주인 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 접종하여 24시간 동안 혐기배양한 후 원심 분리하여 상등액을 분리하고 이를 0.2 ㎚ 주사기 필터로 여과하여 적용하였다.
유해 균주는 바실러스 섭틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii) ATCC 6633, 슈도모나스 애뤼지노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027, 캔디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10231 및 스타필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스(Staphylococcus aureus subsp. aureus) ATCC 6538을 이용하였고, 설사 유발 세균은 대장균(Escherichia coli) ATCC 8739, 대장균(Escherichia coli) ATCC 25922, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) ATCC 14028을 이용하였다.
일반 세균 및 설사 유발 세균은 TSA 배지에서 37℃로 24시간 동안 배양한 후 단일 콜로니(colony)를 얻어 이를 TSB 배지에 접종한 후 1차 선발 균주 배양 상등액을 10% 첨가하여 선발균주 배양 상등액의 일반세균 및 설사 유발 세균의 억제능을 확인하였다. 일반 세균 및 설사 유발 세균의 억제능은 2시간 간격으로 24시간 동안 OD 660 ㎚ 값을 측정함으로써, OD값이 낮게 측정되는 균주를 억제능이 높은 균주로 선발하여 표 7과 같이 표시하였다. W는 약한 양성을 나타낸다.
균주명 락토바실러스 루테리
LBR_C1		 락토바실러스 아시도필러스
LBA_C5
Bacillus subtilis ATCC6633 + +
Candida albicans ATCC10231 W -
Esherichia coli ATCC8739 + +
Esherichia coli ATCC25922 + +
Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 + +
Staphylococcus aureus ATCC6538 + +
Salmonella typhimurium ATCC14028 + +
표 7에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주의 억제능에 있어서, 캔디다 알비칸스 ATCC 10231 균주의 경우 일부 억제되고 그 외 나머지 6개 균주에 대해서는 억제능을 나타내었다. 또한 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주의 억제능에 있어서는, 캔디다 알비칸스 ATCC 10231 균주의 경우 억제능이 확인되지 않았고, 그 외 나머지 6개 균주에 대해서는 억제능을 나타내었다.
2-4. 장 정착성 평가
락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주의 장 정착성에 대한 평가는 사람 대장암 세포주 HT-29를 대상으로 수행하였고, 락토바실러스 람노수스 (L.rhamnosus) GG ATCC53103를 대조군으로 사용하였다.
구체적으로, HT-29 세포주에 락토바실러스 루테리 LBR_C1, 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 및 락토바실러스 람노수스 GG ATCC53103 균주를 각각 1시간 동안 처리한 후 생균수를 측정함으로써 균주의 장 정착능력을 비교하여 표 8에 나타내었다.
Variable 정착시간(Adhesion period) LBR_C1 LBR_C5 락토바실러스 람노수스GG
(ATCC53103)
장 정착성
(Intestinal cell adhesion)		 0 hr 8.72 ± 0.06b 7.28 ± 0.11c 9.08 ± 0.05a
2 hr 7.48 ± 0.00a 4.40 ± 0.04b 7.15 ± 0.10a
정착 능력 (Adhesion ability, %) 85.78 60.44 78.74
표 8에서 확인할 수 있듯이, 장 정착성이 좋은 균주로 알려진 락토바실러스 람노수스 GG는 78.74%의 정착성을 보인 반면, 본 발명의 락토바실러스 루테리 LBR_C1는 85.78%의 더 우수한 장 정착성을 나타내었다.
결과적으로 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하여 섭취 후 위장을 거쳐 소장 및 대장까지 도달할 가능성이 높을 것으로 판단된다. 특히 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주는 유해균 억제능이 있으며, 장 정착성이 좋은 균주로 알려진 락토바실러스 람노수스 GG 보다 우수한 정착성을 나타내기 때문에 프로바이오틱스 (probiotics)로서 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
실시예 3: 산업배지 조성 선정
산업배지 조성선정을 위해 유산균 배양 완료액의 균밀도(bacterial density)를 분광광도계 (660 nm)를 이용하여 측정하였고, MRS 한천(agar)배지를 사용하여 주입평판법으로 완료액의 cfu를 확인하였다.
3-1. 탄소원 (carbon source) 선정
기본배지에서 나머지 영양분의 변화를 주지 않고, 탄소원만 변화를 주어 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주의 배양 과정에서 탄소원의 영향을 조사하였다. 모든 탄소원 (Glucose, sucrose, lactoase, maltose, corn starch, potato starch)은 기본배지의 탄소량과 같은 2%를 첨가하였으며, 37℃, 정치배양 조건으로 24시간 동안 배양하여 균밀도와 균수를 관찰하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 그 결과 상기 두 균주 모두 글루코스(glucose)를 처리하였을 때 생균수의 양이 가장 많은 것으로 나타났다.
3-2. 질소원 (nitrogen source) 선정
기본배지에서 나머지 영양분의 변화를 주지 않고, 질소원만 변화를 주어 락토바실러스 루테리 LBR_C1 및 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주의 배양 과정에서 질소원의 영향을 조사하였다. 모든 질소원 (Yeast extract, soy peptone, sodium casein, casein peptone, soy bean powder)은 기본배지의 질소량과 같은 2%를 첨가하였으며, 37℃, 정치배양 조건으로 24시간 동안 배양하여 균밀도와 균수를 관찰하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 그 결과 락토바실러스 루테리 LBR_C1은 효모 추출물(Yeast extract), 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5는 소이펩톤(Soy peptone)을 처리하였을 때 생균수의 양이 가장 많은 것으로 나타났다.
3-3. 탄소원 및 질소원의 농도 결정
상기 선정된 탄소원과 질소원의 농도에 따른 균밀도 및 생균수를 조사하였다. 구체적으로, 기본배지에서 탄소원, 질소원, 무기염의 농도를 고정한 상태에서 상기 탄소원 (glucsoe)과 질소원 (yeast extract, soy peptone)을 각각 0 내지 5% 사이의 농도로 혼합하여 처리하였다.
도 3 및 4에서 확인할 수 있듯이, 그 결과 락토바실러스 루테리 LBR_C1는 총 탄소원(glucose)이 4%, 질소원(Yeast extract)이 2%를 함유했을때 생균수가 가장 많은 것으로 나타났고, 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5는 총 탄소원(glucose)이 2%, 질소원(Soy peptone)이 2%를 함유하였을 때 생균수가 가장 많은것으로 나타났다.
실시예 4: 반려견을 이용한 동물실험
4-1. 유산균 분말 제조
상기 선정된 산업배지 조성을 바탕으로 30 L 발효기(jar fermenter)를 사용하여 배양하였다. 상기 배지성분에서 전배양한 유산균 종균을 1% 농도로 접종하고 37℃, pH 5.0 내지 5.8, 80 rpm, 혐기 조건에서 16시간 내지 30시간 동안 발효배양하였다. 유산균 배양이 종료된 후 완료액을 연속식 원심분리기(separator)를 이용하여 분리 및 농축하였다. 분리된 유산균체는 동결보호제 등을 첨가하여 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 유산균체를 분쇄하여 일정한 입도를 가지게 한 후 유산균 원말로 제조하였다.
상기 공정을 통해 수득된 유산균 원말은 다음과 같은 생균수를 가지는 것으로 측정되었다.
락토바실러스 루테리 LBR_C1 (5.0 x 1010 CFU/g 이상)
락토바실러스 아시도필루스 LBA_C5 (1.0 x 1010 CFU/g 이상).
4-2. 반려견을 대상으로 한 시험품의 안전성 평가
본 실험은 전북대학교 실험동물센터 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행하였고 공시동물은 소화기계 관련 임상증상이 전혀 없으며 항생제 처리를 하지 않은, 반려견 암수 5마리를 대상으로 선정하였다.
공시동물은 실험동물이 아닌 반려동물로서, 일반적인 반려견 사육환경(가정)에서 사육하는 반려견을 선정하며, 일반적인 동물실험실의 환경과 최대한 근접한 환경을 선정하여 대상 반려견으로 투입하였다. (온도 23±2℃, 상대습도 55±10％, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간(07:00 내지 19:00), 조도 150 내지 300 lux를 기준으로 조사)
반려견 시험 대상군 선정 및 동기화를 위해 대상으로 선정된 반려견은 시험품 투여 1주 전부터 보호자 교육 및 식이 동기화를 실시하였으며, 시험 전 경구 항생제(엔로플록사신, 아시엔로정50(아시쉬라이프사이언스), 체중 10 kg 당 하루 본제 1정(체중 1kg당 엔로플록사신 5mg)을 5 내지 10일간 투여)를 투여하여 설사를 유발시켜 장내 세균총을 제거하고 전혈검사 (Complete Blood Counts) 및 혈청생화학검사 (Serum Biochemistry)를 전체 패널(full panel)로 실시하였다(pre-evaluation).
시험품(Lactobacillus reuteri 1.0*108 cfu/g, Lactobacillus acidphilus 1.0*108 cfu/g, 1:1 비율) 투여 후 1주차에 임상증상 발생 유무 및 특이사항을 기록하고, 전혈검사 (Complete Blood Counts) 및 혈청생화학검사 (Serum Biochemistry)를 전체 패널로 실시하여 안전성평가를 실시하였고(post-evaluation), 안전성 평가의 대상인 반려견 개체 당 시험기간은 동기화 기간 및 투여, 평가를 포함하여 총 4주로 실시하였다.
임상적 평가에 있어서, 항생제 투여, 시험품 투여, 백신 접종과 같은 전체적인 실험 진행 동안 신체검사를 실시하였고 특이적인 이상 증상이나 증후를 확인하였으나 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았다.
혈액학적 평가에 있어서, 시험품 투여 전과 투여 4주 후 반려견의 혈액을 체취하여 전혈액검사 (Complete blood counts)를 하였다. 투여 전후의 혈액검사 결과 (백혈구수, 적혈구, 혈소판)를 비교하여 표 9에 나타내었고, 혈액화학적검사 결과 (간수치, 신장수치)를 비교하여 표 10에 나타내었다.
실험반려견
(실험군)		 혈액검사의 결과
0주 4주
백혈구수(WBC) 적혈구수(RBC) 혈소판수(PLT) 백혈구수(WBC) 적혈구수(RBC) 혈소판수(PLT)
시험품
투여군		 1 12.7 6.6 355 11.4 6.4 366
2 8.2 7.5 323 10.2 7.2 314
3 9.0 6.8 402 12.3 6.4 418
4 11.9 5.7 300 10.0 6.1 426
5 17.1 5.5 617 13.9 5.7 511
6 14.3 6.1 548 9.4 6.5 533
7 10.4 8.1 459 8.8 7.9 485
8 11.8 7.0 540 11.1 6.7 518
9 8.5 6.3 252 10.3 6.2 438
10 11.2 6.7 349 14.7 6.5 504
시험품
비투여군		 11 12.9 5.9 337 11.2 6.1 329
12 11.5 5.7 290 10.8 5.8 306
13 10.4 6.5 286 10.4 6.3 284
14 13.2 6.6 375 12.5 5.9 304
15 9.7 7.2 269 10.2 6.9 287
16 12.2 7.4 332 9.2 7.3 320
17 11.9 7.1 501 8.9 7.0 485
18 9.9 5.4 363 10.3 6.2 356
19 8.7 7.3 244 10.6 7.1 313
20 13.4 8.2 476 12.2 8.0 422
정상값 6~17x103/uL 5.5~8.5x106/uL 200~500x103/uL 6~17x103/uL 5.5~8.5x106/uL 200~500x103/uL
실험반려견
(실험군)		 혈청화학적(간수치, 신장수치) 검사 결과
0주 4주
ALP ALT BUN CREA ALP ALT BUN CREA
시험품
투여군		 1 201 60 12.4 0.7 175 62 16.1 1.1
2 154 57 11.1 1.3 234 55 12.3 0.9
3 143 34 10.0 0.5 212 46 11.2 0.6
4 104 42 10.3 0.4 200 54 10.8 0.5
5 437 108 9.2 1.1 386 69 10.9 1.3
6 218 73 14.6 1.0 225 51 14.2 0.7
7 136 55 10.4 0.5 169 52 12.0 0.6
8 100 45 10.8 0.6 102 45 11.4 0.8
9 97 38 12.9 0.7 118 44 11.3 1.1
10 152 82 9.2 0.5 220 63 10.1 0.9
시험품
비투여군		 11 202 46 10.5 0.9 137 34 11.3 1.2
12 107 54 10.1 0.5 83 38 10.4 0.6
13 124 41 11.5 0.5 95 40 11.2 0.7
14 98 67 12.2 1.4 92 54 10.1 0.5
15 132 33 14.3 0.6 104 43 12.6 0.7
16 145 58 11.0 0.4 91 49 10.4 0.5
17 109 49 10.6 1.1 102 52 10.1 0.8
18 115 35 10.4 0.8 106 41 10.0 0.5
19 86 22 8.7 0.6 87 45 9.5 0.9
20 113 40 12.2 0.5 102 50 10.9 0.7
정상값 20~155 U/L 3~50 U/L 5~30 mg/dl 0.5~1.5 mg/dl 20~155 U/L 3~50 U/L 5~30 mg/dl 0.5~1.5 mg/dl
표 9 및 10에서 확인할 수 있듯이, 그 결과 시험품을 투약한 개체들로부터 뚜렷한 부작용이나 특이적인 임상증상들은 관찰되지 않았다.
4-3. 반려견을 대상으로 한 시험품의 in vivo 면역증진 효능 평가
본 실험은 전북대학교 실험동물센터의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서에 따라 수행하였고 공시동물은 표 11과 같이 소화기계 관련 임상증상이 전혀 없으며 항생제 처리를 하지 않은, 반려견 암수 20마리를 대상으로 하였다. 공시동물의 사육환경은 4-2와 동일하다. 반려견 시험 대상군 선정 및 동기화를 위해 대상으로 선정된 반려견은 시험 전 항생제(엔로플록사신, 아시엔로정50 (아시쉬라이프사이언스), 체중 10 kg 당 하루 본제 1정(체중 1kg당 엔로플록사신 5mg)을 5~10일간)를 투여하여 장내세균총을 제거한 후 시험에 투입하였다.
실험반려견
(실험군)		 이름 품종 나이(년) 성별
소인 1 둥이 슈나우져 13 중성화 암컷
2 줌마 믹스 비글 9 중성화 암컷
3 바밤바 믹스 비글 4 중성화 암컷
4 돌돌 시츄 12 수컷
5 쥐똥 믹스 16 중성화 수컷
6 밍키 시츄 10 암컷
7 점박이 믹스 비글 7 암컷
8 아지 시츄 9 중성화 수컷
9 ?S?S 시츄 2 암컷
10 솔이 닥스훈트 2 중성화 수컷
11 흰눈 포메라니안 4 중성화 수컷
12 참치 믹스 5 수컷
13 웅이 믹스 비글 8 중성화 암컷
14 당근 슈나우져 11 중성화 수컷
15 알콩 말티즈 6 중성화 수컷
16 나라 푸들 13 중성화 암컷
17 하늘이 요크셔테리어 8 중성화 수컷
18 가디 시바견 1 중성화 수컷
19 송이 프렌치 불독 3 암컷
20 은이 믹스 비글 5 중성화 암컷
시험품은 락토바실러스 루테리 LBR_C1, 락토바실러스 아시도필러스 LBR_C5 균주 1.0 x 108 CFU/g를 분말형태로 적용(Lactobacillus reuteri 1.0*108 cfu/g, Lactobacillus acidphilus 1.0*108 cfu/g, 1:1 비율)하였고 부형제로 포도당을 혼합하였다. 1회 투여시에 시험품, 포도당은 각각 50 g씩 정량하여 4주 동안 1일 1회 투여하였고 시험품의 면역증진 효능과 안전성 등의 평가를 위하여 시험품 투여군(10마리)과 시험품 비투여군(10마리)으로 실험군을 나누어 평가하였다.
측정에 있어서, 시험품 투여 1주 전부터 보호자 교육 및 식이 동기화를 실시하고, 경구 항생제를 투여하여 설사를 유발시켜 장내 세균총을 제거한 후 rapid type antibody titre 검사 (immunocomb)를 실시하여 baseline Ab titre를 측정하였다(pre-evaluation).
시험품 투여 후 2주차에 임상증상 발생 유무 및 특이사항을 기록하고, DHPPi 백신 적용(Vaccination)을 실시하였으며, 공격접종 후 3주차에 임상증상 발생 유무 및 특이사항을 기록하고, rapid type antibody titre 검사를 실시하여 baseline Ab titre를 측정하였다(post-evalution).
시험품 투여군 및 비투여군에 DHPPi 백신을 접종한 후 면역항체 형성 결과를 확인하였다. 항체진단키트 (immunocomb test kit)를 사용하였으며, 투여 전과 4주 후 결과를 표 12에 나타내었다.
실험반려견
(실험군)		 면역항체 형성의 결과
0주 4주
홍역
(Distemper)		 파보장염
(Parvo)		 홍역
(Distemper)		 파보장염
(Parvo)
시험품
투여군		 1 1 1 4 5
2 2 1 3 3
3 1 1 4 4
4 2 2 5 3
5 2 2 6 5
6 3 1 4 5
7 1 3 4 6
8 1 2 3 4
9 1 2 4 4
10 2 1 5 6
시험품
비투여군		 11 2 2 4 3
12 1 3 3 3
13 1 2 1 3
14 1 2 2 2
15 3 3 2 1
16 4 2 3 2
17 2 1 3 3
18 1 1 4 5
19 2 2 4 4
20 1 1 3 2
표 12에서 확인할 수 있듯이, 시험품 투여군에서 DHPPi 백신을 접종한 후 4주 후에 뚜렷한 항체 형성 결과값을 보였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12427P 20190111 한국미생물보존센터(국외) KCCM12428P 20190111
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  3. 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주가 3:1 내지 1:3의 비율로 혼합된 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군의 면역 증강용 생균제 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 면역 증강은 홍역(distemper) 및 파보장염(parvovirus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 감염질환에 대하여 백신 접종에 따른 항체 형성 효율을 증가시키는 것인, 가축군의 면역 증강용 생균제 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 생균제 조성물은 락토바실러스 루테리 LBR_C1 균주를 1.0*105 cfu/g 내지 1.0*1011 cfu/g의 농도로 포함하는 것인, 가축군의 면역 증강용 생균제 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 생균제 조성물은 락토바실러스 아시도필러스 LBA_C5 균주를 1.0*105 cfu/g 내지 1.0*1011 cfu/g의 농도로 포함하는 것인, 가축군의 면역 증강용 생균제 조성물.
  7. 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주가 3:1 내지 1:3의 비율로 혼합된 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군의 면역 증강용 생균제 조성물을 함유하는 약제학적 조성물.
  8. 수탁 번호 KCCM12428P로 기탁된 신규한 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LBR_C1 균주, 및 수탁번호 KCCM12427P로 기탁된 신규한 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) LBA_C5 균주가 3:1 내지 1:3의 비율로 혼합된 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 가축군의 면역 증강용 생균제 조성물을 함유하는 사료 조성물.
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