KR20200042165A - 신규한 락토바실러스 살리바리우스 및 이를 유효성분으로 포함하는 양식 어류 및 갑각류용 사료첨가제 - Google Patents

신규한 락토바실러스 살리바리우스 및 이를 유효성분으로 포함하는 양식 어류 및 갑각류용 사료첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 양식 어류 및 갑각류용 사료첨가제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 어류 또는 갑각류의 질병을 유발하는 병원성 세균에 대해 우수한 항균 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 및/또는 배양물을 포함하는 사료첨가제를 급여 제공함으로써, 양식 어류 또는 갑각류의 질병을 예방하고 생산성 향상에 기여할 수 있다. 또한, 본 발명은 종래 항생제와 달리 어류나 갑각류 내에 잔류하거나 내성균 발생의 위험이 없어, 양식에 안전하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 살리바리우스 및 이를 유효성분으로 포함하는 양식 어류 및 갑각류용 사료첨가제{NOVEL LACTOBACILLUS SALIVARIUS AND FEED ADDITIVES FOR AQUACULTURAL FISH AND CRUSTACEA COMPRISING THE SAME}
본 발명은 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 양식 어류 및 갑각류용 사료첨가제에 관한 것이다.
세계 인구가 증가하고 생활 수준이 향상됨에 따라 미국, 유럽, 일본 등의 선진국에서는 성인병 예방을 위한 식생활 개선에 대하여 관심이 증가하고 있다. 이에, 수산물의 수요가 지속적으로 증가되어 어류 양식의 생산량은 급증하고 있다. 또한, 국제연합식량농업기구(Food and Agriculture Organization, FAO)에 따르면, 어류의 소비는 인구 증가와 비례하여 지속적으로 증가되어, 양식 어류의 공급이 1990년대 이후 가파르게 증가하고 있다고 보고되었다. 이와 같이, 양식 산업은 크게 성장하고 있으며, 양식업은 많은 나라에서 주요한 경제적 수단이 되고 있다. 그러나, 양식 중 발생하는 어류의 질병이 양식 산업 발전을 저해하는 결정적인 요인으로 작용하고 있으며, 이는 경제적 발전에 커다란 영향을 미치고 있는 실정이다(Jose Luis Balcazar et al., 2000).
국내 양식 산업의 경우, 적은 수면적에 과다한 어류를 양식하는 고밀도 사육을 하고 있어, 세균성 질병의 발병 빈도가 높다. 또한, 질병 예방을 위해 사용되는 항생제의 오·남용과 단기간 성장을 위한 사료의 과다 투입으로 인하여, 병원체의 내성이 증가되고 수질오염이 심화되어 질병 발생이 증가하는 악순환이 계속되고 있다. 따라서, 양식 어류의 면역 증강과 질병 예방에 도움이 되며, 항생제 사용에 따른 문제점을 해소할 수 있는 사료첨가제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 양식 산업이 크게 성장함에 따라, 양식 어류의 면역증강제로서 프로바이오틱스(probiotics)가 높은 관심을 받고 있다. 프로바이오틱스는 1989년 R. Fuller에 의해 "숙주동물의 장내 미생물 균총의 개선으로 숙주동물에 유익한 작용을 하는 생균제"라고 정의 되었다. 생균제로 사용되는 균주로는 락토바실러스, 엔테로코커스, 비피도박테리움, 바실러스 등의 세균류, 사카로마이세스를 포함하는 효모류, 아스퍼질러스 등을 포함하는 곰팡이류 등이 있다. 프로바이오틱스는 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되며, 사람과 동물에 대한 독성유전자를 보유하고 있지 않으며 병원성물질 또한 생산하지 않는다.
Jose Luis Balcazar et al., Veter.Microbio. 114(2006):173-186; Laurent venrschuere et al. Microbio.Mot. Biol.Rev. Dec. 2000.655-671.
이에, 본 발명자들은 병원성 세균에 대한 항균 활성이 우수한 프로바이오틱스를 개발하기 위해 지속적으로 연구하던 중, 갈치속젓에서 분리한 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주가 양식 어류의 질병을 유발하는 병원성 세균에 대한 우수한 항균 활성 및 양식 어류의 면역증강 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주를 유효성분으로 포함하는 어류 또는 갑각류의 면역증진용 사료첨가제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) B4 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 어류 또는 갑각류의 면역증진용 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 어류 또는 갑각류의 질병을 유발하는 병원성 세균(예, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Vibrio ichthyoenteri)에 대해 우수한 항균 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 및/또는 배양물을 포함하는 사료첨가제를 사료에 첨가하여 급여 제공함으로써, 양식 어류 또는 갑각류의 질병을 예방하고 생산성 향상에 기여할 수 있다. 또한, 본 발명은 종래 항생제와 달리 양식 생물 내에 잔류하거나 내성균 발생의 위험이 없어, 안전한 양식 생물 생산에 기여할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주가 Streptococcus iniae(S. iniae), Edwardsiella tarda(E. tarda), Vibrio ichthyoenteri(V. ichthyoenteri)에 대한 항균 활성을 확인한 것이다.
도 2는 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 동정하여 다른 락토바실러스 살리바리우스 균주와의 상동성 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 살리바리우스 B4가 Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Vibrio ichthyoenteri에 대한 항균 활성을 확인한 것이다.
도 4는 락토바실러스 살리바리우스 B4균주 배양액을 pH 조건을 달리하여 방치하였을 때 Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성 변화를 확인한 것이다.
도 5는 락토바실러스 살리바리우스 B4균주 배양액을 80℃ 열처리 시 열처리 시간별 E. tarda에 대한 항균 활성 변화를 확인한 것이다.
도 6은 락토바실러스 살리바리우스 B4균주 배양 시간별 E. tarda에 대한 항균 활성 변화를 확인한 것이다.
도 7은 락토바실러스 살리바리우스 B4균주 배양 온도별 E. tarda에 대한 항균 활성 변화를 확인한 것이다.
도 8은 락토바실러스 살리바리우스 B4균주를 포함한 사료첨가제를 넙치에 급여 시 혈청 내 라이소자임(lysozyme) 활성에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 9는 락토바실러스 살리바리우스 B4균주를 포함한 사료첨가제를 넙치에 급여 시 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium) 환원능에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 10은 넙치에 S. iniae 병원성 세균으로 감염증 유발 시 탈장 증상이 발생하는 것을 확인한 것이다.
도 11은 넙치에 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 활용한 사료첨가제 급여 시 S. iniae 병원성 세균으로 감염 유발 2주 후 생존율을 확인한 것이다.
도 12는 락토바실러스 살리바리우스 B4균주를 활용한 사료첨가제를 뱀장어에 급여 시 혈청 내 라이소자임 활성에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 13은 락토바실러스 살리바리우스 B4균주를 활용한 사료첨가제를 뱀장어에 급여 시 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨 환원능에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 14는 뱀장어에 E. tarda 병원성 세균으로 감염증 유발 시 배 아래쪽에 발적 증상이 발생하는 것을 확인한 것이다.
도 15는 뱀장어에 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 활용한 사료첨가제 급여 시 E. tarda 병원성 세균으로 감염 유발 2주 후 생존율을 확인한 것이다.
본 발명은 일 측면으로, 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) B4 균주를 제공한다.
본 발명자들은 갈치속젓으로부터 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주를 분리 및 동정하였다. 본 발명자들은 상기 균주를 첨가한 사료를 어류에 급이하였을 시 어류의 면역증강 및 어류 병원성 세균에 대한 우수한 항균 활성을 확인하여, 상기 신규한 균주를 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주로 명명하였고, 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection)에 2018년 7월 27일자로 기탁하였다(기탁번호 제KACC92234P호). 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 가질 수 있다.
이때, 본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 배양시 사용가능한 배지는 MRS, ATP, 엘리커(Elliker), 토마토주스 로고사(Rogosa) SL, 토드 휴잇(Todd Hewitt) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배양의 최적 pH는 pH 4.5 내지 7.5, 구체적으로, pH 6.0 내지 7.0일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배양의 최적 온도는 20℃ 내지 40℃, 구체적으로, 25℃ 내지 37℃, 30℃ 내지 35℃일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로, 본 발명의 균주는 리터(L) 당 포도당 10g 내지 120g, 당밀 20g 내지 50g, 효모 추출물 2g 내지 30g, 옥수수 침지액 20g 내지 70g, K2HPO4 1g 내지 3g, 및 나트륨 아세테이트 2g 내지 8g을 포함하는 배지에 0.05 내지 10 중량%를 접종한 후, 20℃ 내지 37℃에서 14시간 내지 30시간 동안 배양함으로써 대량 생산될 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균제를 제공한다.
일 구체예로, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
다른 구체예로, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 및 이의 사균체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체 및 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또 다른 구체예로, 상기 항균제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제KACC92234P호의 락토바실러스 살리바리우스는 어류 병원성 세균에 대해 항균능력을 보유하고 있으며, 내산성이 있고, 내염성이 있으므로 생균제(probiotics)로서 유용하게 이용될 수 있다.
구체적으로, 상기 생균제는 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 또는 배양액과 같은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 락토스, 글루코스, 탈지유(skim milk), 제올라이트(zeolite) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 부형제를 함께 포함할 수 있다. 부형제를 포함하는 경우, 상기 락토바실러스 살리바리우스는 생균제의 총 중량을 기준으로 10 내지 95 중량%일 수 있고, 부형제는 생균제의 총 중량을 기준으로 5 내지 90중량%를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 생균제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체를 또는 이의 배양액은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법으로 제조된 생균제는 사료에 투여하여 급여 제공함으로써 양식 어류 또는 갑각류의 질병 발생을 억제시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "사균체"란 초음파처리, 가열, 가압, 약물처리 등으로 살균 처리된 균체를 의미한다. 또한, 균체 성분은 효소 처리, 균질화(homogenize), 초음파 처리 등으로 세포를 파괴한 파쇄물, 또는 세포벽 분획을 분취한 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용한 용어, "배양액"은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다. 이때, 본 발명의 배양액은 건조분말 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어, "항균(antimicrobial)"의 의미는 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 어류 또는 갑각류의 면역증진용 사료첨가제를 제공한다.
일 구체예로, 상기 면역증진용 사료첨가제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역증진용 사료첨가제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역증진용 사료첨가제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
다른 구체예로, 상기 면역증진용 사료첨가제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 및 이의 사균체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역증진용 사료첨가제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역증진용 사료첨가제는 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체 및 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또 다른 구체예로, 상기 면역증진용 사료첨가제는 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 사료 첨가제는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수, 쌀 등과 같은 곡물; 콩, 해바라기 등을 주성분으로 하는 식물성 단백질 사료; 혈분, 육분, 골분, 생선분 등과 같은 동물성 단백질 사료; 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등의 당분 및 유제품; 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등의 지질; 영양보충제; 소화 및 흡수향상제; 성장촉진제; 질병 예방제 등의 첨가제가 추가적으로 포함될 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
일 구체예로, 상기 사료 첨가제는 106 cfu/g 내지 107 cfu/g의 생균을 포함할 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 1 내지 15 중량%의 사균체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 1 내지 30 중량%의 배양액 건조물을 포함할 수 있다. 이외에, 상기 사료첨가제는 바실러스, 효모, 올리고당, 비타민, 미네랄 등을 추가적으로 혼합하여 제조될 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 용어 "항균(antimicrobial)"은 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 어류 또는 갑각류 병원성 세균에 대해 항균 능력을 가지고 있다. 특히, 본 발명에 따른 사료 첨가제는 Streptococcus 속, Edwardsiella 속 및 Vibrio 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주에 대해 항균 활성을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 사료 첨가제는 Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda 및 Vibrio ichthyoenteri로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주에 대한 활성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역증진은 어류 또는 갑각류의 혈청 내 라이소자임(lysozyme) 활성 증가를 통해 이루어질 수 있다. 또한, 상기 면역증진은 어류 또는 갑각류의 백혈구의 활성 증진을 통해 이루어질 수 있으며, 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium) 환원능이 증가하는 것을 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 라이소자임 활성 및 나이트로블루 테트라졸륨 환원능 확인으로 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함하는 사료첨가제 급여 시 어류 또는 갑각류의 면역능이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 사료 첨가용 부형제는 포도당, 유당, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 사료 첨가제는 어류 또는 갑각류에게 단독으로 투여되거나 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로 투여될 수 있다. 일 구체예로, 상기 사료 첨가제는 어류용 사료 조성물 기준으로 0.05%(w/w) 내지 1.5%(w/w)으로 배합될 수 있으며, 구체적으로 0.1%(w/w) 내지 0.3%(w/w)으로 배합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "어류 또는 갑각류"는 양식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 어류 또는 갑각류는 잉어, 뱀장어, 참돔, 방어, 넙치, 문어, 대하, 보리새우, 새우, 꽃게, 전복, 소라, 해삼 및 성게로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 넙치, 뱀장어 및 흰다리새우에 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 급여함으로써, 면역능 및 생존율 향상, 및 질병 예방 효과를 확인하였다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 사료 첨가제를 어류 또는 갑각류에 급이하여 병원성 세균에 대한 면역력을 증가시키는 방법을 제공한다. 이때, 상기 사료 첨가제의 구성, 제제 형태 및 투여 방법은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 분리 및 동정
실시예 1.1. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 분리 및 특성 확인
어류 내장, 양식수, 양식장 퇴적물, 젓갈, 갯벌로부터 수득한 80여종의 시료들을 멸균된 생리식염수에 희석하였다. 이후, 브로모크레졸 자주색 시약(Bromocresol purple)이 0.0001%(w/v) 첨가된 MRS 아가(agar) 배지에 도말하여 30℃ 및 혐기적 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이 중에서 유기산 생산 균주가 생산한 유기산에 의해, 균주 주변의 pH가 낮아져 노란색을 띄는 190여종의 균주를 선별하였다. 그 다음, 상기 선별된 균주들 중, Edwardsiella tarda 균에 대해 항균 활성을 가지는 유산균을 선별하기 위하여, 인산 완충액(pH 7.0)이 0.1N 농도로 첨가된 MRS 아가(p-MRS 아가) 배지에서 30℃ 및 혐기적 조건으로 배양하였다. 여기에 Edwardsiella tarda 배양액을 오버레이(overlay)하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후, Edwardsiella tarda의 생육저지환(Inhibition halo)이 생기는 17종의 균주를 1차 선별하였다.
그 다음, 어류 및 갑각류의 주요 질병 원인체로 알려진 Streptococcus iniae 와 Vibrio ichthyoenteri에 대한 항균 활성을 보유한 균주를 확보하기 위하여, 1차 균주 선별 방식과 동일한 방법에 병원성 균주들을 달리하여 두 균주 모두에 항균 활성이 있는 균주를 선별하는 과정을 수행하였다. 그 결과, 갈치속젓에서 유래된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 최종 선별하였다. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Vibrio ichthyoenteri에 대한 항균 활성을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 최종 선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특성을 확인한 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주는 그람 양성 간균으로서, 카탈라아제 음성이며, 글루코스를 이용하여 CO2를 생산하지 않는다.
형태 및 생화학적 특징 반응
콜로니 형태(Colony shape) 소형의 둥근형태
콜로니 색 (Colony color) 옅은 아이보리
세포 형태 짧은 간균
그람 염색 (Gram staining) 그람 양성
호기 조건 통성 혐기성
포자 형성능 (Endospore) 음성
글루코스로부터 CO2 생성 음성
카탈라아제 테스트 (Catalase test) 음성
실시예 1.2. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 효소 활성 확인
상기 실시예 1.1에서 최종 선별된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 효소 활성을 확인하기 위하여, API ZYM 키트(biomerieux사, 프랑스)를 이용하여 효소 반응의 범위를 0(반응 없음) 내지 5점(최대반응)으로 표시하였다. 상기 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 루신 아릴아미다제 및 β-갈락토시다제의 활성이 매우 높았으며, 벤조피렌을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-글루쿠로니다제의 경우 활성이 없어 안전한 균주임을 확인할 수 있었다.
효소 반응 정도
알칼리 포스파타아제 (Alkaline phosphatase) 0
에스터라아제(Esterase) C4 3
에스터라아제 리파아제(Esterase Lipase) C8 2
리파아제(Lipase) C14 0
루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 4
발린 아릴아미다제(Valine arylamidase) 4
시스틴 아릴아미다제(Cystine arylamidase) 4
트립신(Trypsine) 0
α-키모트립신(α-chimotrypsine) 0
산 포스파타아제(Acid phosphatase) 4
나프톨-AS-BI-포스포히드로라제
(Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase) 		4
α- 갈락토시다제(galactosidase) 4
β- 갈락토시다제 4
β- 글루쿠로니다제(glucuronidase) 0
α- 글루코시다제(glucosidase) 0
β- 글루코시다제 1
N-에틸-β-글루코사미니다제(glucosaminidase) 0
α- 만노시다제(mannosidase) 0
α- 푸코시다제(fucosidase) 0
실시예 1.3. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 당이용성 확인
상기 실시예 1.1에서 최종 선별된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 당이용성을 API 50 CHL 키트(bioMerieux사, 프랑스)를 이용하여 분석하였다. 상기 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타난 바와 같이, 일반적으로 락토바실러스 살리바리우스 균주는 만니톨을 이용할 수 있으나, 본 발명의 균주의 경우 만니톨을 이용할 수 없는 특성이 있다.
스트립(STRIP) 0-25
튜브/기질		 +/- 스트립 26-49
튜브/기질		 +/-
1 글리세롤 - 26 살리신(salicin) -
2 에리트리톨(erythritol) - 27 셀로비오스(cellobiose) -
3 d-아라비노스(arabinose) - 28 말토스(maltose) -
4 l-아라비노스 - 29 락토스(lactose) +
5 리보스(ribose) - 30 멜리비오스(melibiose) +
6 d-자일로스(xylose) - 31 수크로스(sucrose) +
7 l-자일로스 - 32 트레할로스(trehalose) +
8 아도니톨(adonitol) - 33 이눌린(inulin) -
9 β-메틸-d-자일로스 - 34 멜레지토스(melezitose) -
10 갈락토스(galactose) + 35 라피노스(raffinose) +
11 글루코스(glucose) + 36 전분 -
12 프럭토스(fructose) + 37 글리코겐(glycogen) -
13 만노스(manose) + 38 자일리톨(xylitol) -
14 소르보스(sorbose) - 39 젠티오비오스(gentiobiose) -
15 람노스(rhamnose) - 40 d-투라노스(turanose) -
16 둘시톨(dulcitol) - 41 d-릭소스(lyxose) -
17 이노시톨(inositol) - 42 d-타가토스(tagatose) -
18 만니톨(manitol) + 43 d-푸코스(fucose) -
19 솔비톨(sorbitol) + 44 l-푸코스 -
20 α-메틸-d-만노시드(mannoside) - 45 d-아라비톨(arabitol) -
21 α-메틸-d-글루코시드 - 46 l-아라비톨 -
22 n-아세틸-글루코사민 + 47 글루코네이트(gluconate) -
23 아미그달린(amygdalin) - 48 2-케토-글루코네이트 -
24 알부틴(arbutin) - 49 5-케토-글루코네이트 -
25 에스쿨린(esculin) -
실시예 1.4. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 동정
염기서열을 분석한 결과, 본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지고 있었다. 또한, 본 발명의 균주는 락토바실러스 속 UCC118 균주와 약 99% 상동성을 나타내는 신규한 균주임을 알 수 있었다(도 2).
상기 결과에 따라, 최종 선별된 균주를 락토바실러스 살리바리우스 신균주로 동정하고, 이를 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주로 명명하여 국립농업과학원에 2018년 7월 27일자로 기탁번호 제 KACC92234P로 기탁하였다.
실시예 2. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 내산성 확인
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 장 도달성을 알아보기 위하여, 내산성을 확인하였다. 먼저, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 정치 배양한 후 원심분리 하여 균체만 회수하였다. 회수된 균체에 pH가 2.03으로 조절된 새로운 MRS 배지를 첨가하고 균체를 현탁하여 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이후, 상기 균주의 생존률을 확인하였다. 그 결과를 표 4 에 나타내었다.
표 4 에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 생존률이 85.6%로서, 내산성이 우수함을 알 수 있었다.
생균수(CFU/mL) 생존율(%)
처리 전 2.71 X 109 100.0
pH 처리 후 2.32 X 109 85.6
실시예 3. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 유기산 생산능 확인
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양 시 생산되는 유기산 양을 알아보기 위하여, 상기 균주를 MRS 액상배지에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 이후, 식품첨가물 공전(2003년도 판)의 젖산정량법으로 유기산 양을 확인하였다.
그 결과, 젖산을 기준으로 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 배양물은 2.8%의 유기산을 함유하고 있어, 본 발명에 따른 균주는 다량의 유기산을 생산함을 알 수 있었다.
실시예 4. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 항균 활성
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 항균 활성을 알아보기 위하여, 양식 어류 및 갑각류의 질병 유발 균주인 Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, 및 Vibrio ichthyoenteri에 대한 항균 스펙트럼을 조사하였다.
먼저, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 20시간 동안 정치 배양하였다. 이후, 균체를 제거하고 6N NaOH를 이용하여 pH를 6.0±0.2로 조절하고, 0.45 um 멸균 여과기로 여과한 후, 여액을 실험 시료로 사용하였다. 상기 준비된 시료를 Brain heart infusion 배지(BD 사)와 2:3 비율로 혼합하였다. 이후, Brain heart infusion 배지에서 활성화된 상기 질병 유발균(지시균)들을 0.5%(v/v)가 되게 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 분광광도계(1650PC; Simadzu사)를 이용하여 660 nm에서 흡광도 값을 측정하였고, 지시균 생장저해율(%)로 나타낸 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 세 종류의 병원성 균주들에 대해 36% 이상의 항균 활성을 나타내었다. 특히, Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성은 82% 이상으로 매우 높음을 알 수 있었다.
실시예 5. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 항균 활성 물질의 특성
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주가 생산하는 항균 활성 물질의 특성(pH 안정성 및 열 안정성)을 확인하였다.
실시예 5.1. pH 안정성
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 16 내지 20시간 동안 정치 배양하였다. 배양 후 배양액의 pH는 3.9±0.2이었다. 18% HCl 및 6N NaOH를 이용하여 상기 pH를 2, 4, 6, 8 및 10으로 조절하였다. 그 다음, 균체를 제거하고 37℃에서 2시간 동안 방치한 후, pH를 6.0±0.2로 재조절하고 Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성(%)을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 배양 후 pH 조절을 하지 않은 시료의 항균 활성을 100%로 하였을 때, pH 2 내지 6까지는 항균 활성이 약 100%로 항균 물질이 안정하였으나, pH가 8 이상으로 높아지면 급격히 감소하는 특징이 있었다.
실시예 5.2. pH 안정성
6N NaOH를 이용하여 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 배양액을 pH 6.0으로 조절하였다. 이후, 0.45 um 여과기를 이용하여 제균하고, 80℃에서 방치하면서 5분, 15분, 30분 및 60분 간격으로 시료를 취해 Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성(%)을 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 80℃에서 60분간 열처리 할 경우에는 항균 활성이 73%로서, 무처리에 비해 약 89% 정도로 항균 활성을 유지하여 열에 매우 안정함을 알 수 있었다.
실시예 6. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양 조건
실시예 6.1. 배양 시간에 따른 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 생장 및 항균 활성
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 혐기적으로 48시간 동안 배양하면서, 배양 후 16시간, 24시간, 38시간 및 48시간째 배양액을 취해 생균수 및 배양액의 pH를 측정하엿다. 상기 측정 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
배양시간(시)
16 24 38 48
생균수(cfu/mL) 2.1 X 109 1.4 X 109 6.4 X 108 1.7 X 108
배양액 pH 4.02 3.97 3.84 3.82
표 5에서 나타난 바와 같이, 배양 16시간 이후의 pH는 배양시간에 관계없이 유사하게 나타났으며, 생균수는 더 이상 증가하지 않았으나, 38시간 이후로 감소하는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 배양액의 pH를 6.0±0.2로 보정한 후, Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성을 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방식으로 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 16시간에서 24시간 배양한 배양물에서의 항균 활성이 82.1%로 가장 높음을 알 수 있었다. 또한, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주 배양물 내 존재하는 항균 활성 물질은 박테리오신(bacteriocin)과 같이 생장-연관(Growth-associated) 형태로 생산되고, 배양 시간이 48시간 이상이 되면 항균 활성이 감소되는 것으로 보아 일정시간이 지나면 항균 활성 물질이 분해되는 것으로 추측할 수 있었다.
실시예 6.2. 배양 온도에 따른 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 생장 및 항균 활성
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 MRS 액상 배지에서 1차 활성화하고, 활성화된 균액을 새로운 MRS 액상 배지에 0.2%가 되게 접종하였다. 이후, 혐기적으로 15℃, 25℃, 30℃, 37℃ 및 40℃ 에서 16시간 배양하고, 이의 생균수 및 배양액의 pH를 측정하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
배양온도(℃)
15 25 30 37 40
생균수(cfu/mL) 3.5 X 108 1.9 X 109 2.5 X 109 1.5 X 109 1.1 X 108
배양액 pH 4.87 4.05 3.96 3.88 3.93
표 6에서 나타난 바와 같이, 25℃ 및 30℃에서 배양한 경우 1.9 X 109 cfu/mL 및 2.5 X 109 cfu/mL의 생균수를 나타내어 가장 우수하였다. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 15℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 생장이 우수하여 다양한 수온에서 어류 및 갑각류의 생균제로서 사용 가능함을 확인하였다.
또한, 상기와 동일한 방법으로 배양한 균주의 Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성을 실시예 4의 방법으로 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 30℃에서 배양하였을 때, Edwardsiella tarda에 대한 항균 활성이 가장 높게 나타났다.
실험예 1. 양식 어류 및 갑각류용 사료첨가제 제조
양식 어류 및 갑각류에 항균 활성을 가지는 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주, 이의 사균체 및/또는 배양물을 이용하여 하기 표 7과 같은 조성으로 사료첨가제를 제조하였다. 이때, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체 제조를 위해, 먼저 5,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리를 수행하여 균체를 회수하고, 회수된 균체는 초기 부피 대비 1/20 정도가 되도록 식염수에 현탁하였다. 현탁된 균체액은 70℃에서 30분간 열처리한 뒤, 탈지분유를 현탁액 부피대비 10%가 되도록 첨가한 후, 분무건조기를 이용하여 분말화하였다. 또한, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 배양물은 수용성 전분(soluble starch)을 배양물 부피 대비 약 8%가 되도록 첨가하여 현탁한 후, 분무건조기를 이용하여 분말화하였다. 이때, 부형제로서 포도당을 사용하였다. 상기 제조한 사료첨가제는 4℃에 냉장 보관하면서 사용하였다.
성분 함량(/kg)
시료 1 시료 2
Lactobacillus salivarius B4 1.0 X 109 CFU 1.0 X 109 CFU
Lactobacillus salivarius B4 사균체 - 10 g
Lactobacillus salivarius B4 배양액 건조분말 100 g 100 g
실험예 2. 넙치 사육실험
넙치(Paralichthys olivaceus, 입수시 체중 25 g 내지 30 g)는 완도 소재의 양식장에서 구입하여 시험에 사용하였다. 278 ㎝ × 75 ㎝ × 55 ㎝ 크기의 FRP수조(수량: 300 리터 수준으로 유지, 수온: 22±2℃)를 지속적으로 폭기하면서 실험실 수조에 상기 넙치를 입수한 후, 다소 안정화된 시점부터 서서히 급이를 시작하여 2주 동안 순치하였다. 사료첨가제 시료 1 및 2는 넙치치어용 펠렛사료(Fish Top Power No.5, 우성사료, 대전)에 0.1% 농도가 되도록 흡착한 후, 35일간 급여하였다. 사료 급여는 오전 9시와 오후 6시로 하루에 두 번 급여하였다. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 이용한 사료첨가제의 급여가 넙치의 비특이적 면역에 미치는 영향을, 라이소자임(lysozyme) 활성 및 나이트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium, NBT) 환원능 측정으로 확인하였다.
실험예 2.1. 넙치 혈청 내 라이소자임 활성 측정
넙치 혈청의 라이소자임 활성 측정을 위하여, 96-웰 플레이트에 0.2 M 인산완충액(pH 5.8)에 2 mg/mL의 Micrococcus lysodeikticus(Sigma)를 부유시킨 용액을 웰당 70 ㎕씩 넣고 혈청 30 ㎕를 첨가하여 25℃에서 반응시켰다. 반응 개시 30초 후부터 4분 30초까지 감소하는 흡광도의 양을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)로 405 nm에서 기록하였다. 이때, 분당 0.001의 흡광도가 감소하는 양을 1 unit으로 표현하였다. 상기 넙치 혈청의 라이소자임 활성 측정 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제를 급여할 경우, 급여하지 않을 경우에 비해 넙치 혈청 내 라이소자임 활성이 증가하였다. 특히, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체를 첨가하였을 때 유의적으로 증가하였다.
실험예 2.2. 넙치 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨 환원능 측정
나이트로블루 테트라졸륨 환원능을 측정하기 위하여, 넙치 신장 중 부신에서 분리한 백혈구를 96 웰 플레이트에 200 ㎕씩 분주한 후, 120 ×g 에서 5분간 원심분리 하였다. Phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.2)으로 2회 세척한 후, 1 ㎍/mL의 phorbol myristate acetate(PMA)를 첨가하였다. 다시 1 mg/mL의 나이트로블루 테트라졸륨을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 70% 메탄올로 고정하고 PBS로 2회 세척하고, 120 ㎕의 2 M KOH 및 dimethyl sulfoxide를 첨가하였다. 첨가 후, 마이크로플레이트 리더로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 나이트로블루 테트라졸륨 환원능은, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 시료 1 및 2를 급여 받은 넙치의 백혈구 모두에서 유의성 있는 증가를 보였다. 상기 라이소자임 활성 및 나이트로블루 테트라졸륨 환원능 확인을 통해, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여 시 넙치의 비특이적 면역능이 향상되는 것을 알 수 있었다.
실험예 2.3. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여가 넙치의 항병력에 미치는 영향 확인
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제의 급여가 넙치의 항병력에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Streptococcus iniae KTCT 3657 균주로 공격시험을 수행하였다. Streptococcus iniae 균주는 shaking incubator(Vision, Korea)에서 48시간(150 rpm, 30℃) 동안 배양하였다. 배양된 세균수의 측정은 평판 배양법에 따라 계열 희석하여, 세균 100 ㎕를 Brain Heart Infusion agar(BHIA)를 굳힌 페트리 접시(Petri dish) 위에 떨어뜨린 후, 37℃에 24시간 동안 배양하여 집락을 계수하였다. 균수는 3개의 평판에서 자란 집락 계수의 평균값을 취하였다.
공격 시험을 위해, 배양액을 4℃에서 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 집균하고, 0.85% (w/v) 멸균 생리식염수를 이용하여 1x107 CFU/mL으로 조제하여 0.1 mL씩 복강 내 주사(1x106 CFU/마리)하였다. 공격시험 기간 동안, 시험어는 FRP수조(수량: 300 리터, 수온: 22℃)에 유지하였다. 상기 세균(S. iniae)은 상기 감염 용량에서 적절한 수의 동물이 사망함을 예비시험을 통해 확인하였다. 본 시험에서 투여 후, 치사의 변화가 대체적으로 완료되는 2주일간의 누적 치사를 계수하여, 사료첨가제의 급여가 질병예방 효과에 유의적으로 관련성이 있는지를 평가하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10에 나타나는 바와 같이, 넙치에 병원성 세균인 Streptococcus iniae를 투여하였을 때, 탈장 증상이 발생하였으며 안구돌출을 일으키는 개체도 있었다. 내부적으로는 신장막의 결절이 일어났다. 감염개시 1주일 정도에서 대량폐사가 관찰되었다. 2주 후 최종 생존율을 확인한 결과, 도 11에 나타나는 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여 시 넙치의 생존이 유의적으로 증가되었다. 특히, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체가 포함된 사료첨가제를 급여 시, 무처리 군에 비해 생존율이 40% 정도 증가하였다.
실험예 3. 뱀장어 사육실험
뱀장어(Anguilla japonica, 입수시 체중 17-22 g)는 전북 소재의 양식장에서 구입하여 시험에 사용하였다. 76 ㎝ × 76 ㎝ × 70 ㎝ 크기의 FRP수조(수량: 200 리터 수준으로 유지, 수온: 26±2℃)를 지속적으로 폭기하면서, 실험실 수조에 상기 뱀장어를 입수 후, 다소 안정화된 시점부터 서서히 급이를 시작하여 2주 동안 순치하였다, 사료첨가제 시료 1 및 2는 뱀장어 반죽사료에 0.1% 농도가 되도록 혼합하여 35일간 급여하였다. 사료 급여는 오전 9시와 오후 6시로 하루에 두 번 급여하였다. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제의 급여가 뱀장어의 비특이적 면역에 미치는 영향을 라이소자임 활성 및 나이트로블루 테트라졸륨 환원능으로 확인하였다.
실험예 3.1. 뱀장어 혈청 내 라이소자임 활성 측정
상기 실험예 2.1과 동일한 방법으로 뱀장어 혈청의 라이소자임 활성을 측정하였다. 뱀장어 혈청의 라이소자임 측청 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제를 급여할 경우, 급여하지 않을 경우에 비해 뱀장어 혈청 내 라이소자임 활성이 증가되었다.
실험예 3.2. 뱀장어 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨 환원능 측정
상기 실험예 2.2와 동일한 방법으로 뱀장어 신장에서 분리한 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨 환원능을 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 뱀장어 신장에서 분리한 백혈구의 나이트로블루 테트라졸륨 환원능은, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 시료 1 및 2를 급여 받은 뱀장어의 백혈구 모두에서 증가하였다. 특히, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주의 사균체를 첨가한 시료에서 환원능이 더욱 높게 나타났다.
상기 라이소자임 활성 및 나이트로블루 테트라졸륨 환원능 확인을 통해, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여 시 뱀장어의 비특이적 면역능이 향상되는 것을 알 수 있었다.
실험예 3.3. 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여가 뱀장어의 항병력에 미치는 영향 확인
락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여가 뱀장어의 항병력에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Edwardsiella tarda KTCT 122679 균주로 공격시험을 수행하였다. Edwardsiella tarda 균주는 2.5x107 CFU/mL로 조제하여 0.1 mL씩 복강 내 주사(2.5x106 CFU/마리)하였다. 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 뱀장어에 병원성 세균인 Edwardsiella tarda를 투여하였을 때, 배쪽 부위에 발적이 관찰되었으며, 이는 뱀장어 Edwardsiella tarda 균 감염증상의 하나로 알려져 있다. 폐사한 뱀장어를 부검 시, 간장 및 신장 등에 농양이 확인되었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 감염 개시 2주 후 대조군의 경우 60% 이상 폐사하였으나, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제를 급여한 군에서는 생존율이 30% 이상 개선되었다. 상기 결과를 통해, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제가 질병 예방에 효과가 있는 것을 확인하였다.
실험예 4. 흰다리새우 사육실험
흰다리새우는(Penaeus vannamei, 입수시 체중 17-22 g)는 전라북도 익산 소재의 양식장에서 입수한 치하를 사용하였다. 지름 50 cm 및 높이 65 cm의 FRP 수조(수량: 50 L를 유지, 수온: 28±2℃)를 지속적으로 폭기하면서, 16주간 사육하였다. 사육 종료 후, 생존율, 평균 체장, 체중 및 사료계수(FCR; feed-conversion ratio, 사료섭이량/증체량)를 확인하여 하기 표 8에 정리하여 나타내었다.
표 8에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주를 포함한 사료첨가제 급여 시 생존율이 높게 나타났고, 평균 체장, 체중 및 사료계수가 개선되는 효과가 있었다. 상기 결과를 통해, 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주는 흰다리새우의 생존율 및 생장을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실험군 대조군 시료 1 시료 2
성장사항 생존율 % 50 72 76
평균체장 cm 8.0 8.7 8.8
평균체중 g 7.7 8.4 8.4
FCR ratio 2.66 1.68 1.36
[수탁기관]
기탁기관명 : 농업유전자원센터
수탁번호 : KACC92234P
수탁일자 : 20180727
<110> CHEIL BIO, CO., LTD. <120> NOVEL LACTOBACILLUS SALIVARIUS AND FEED ADDITIVES FOR AQUACULTURAL FISH AND CRUSTACEA COMPRISING THE SAME <130> FPD/201808-0071 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 997 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus salivarius B4 16S rRNA <400> 1 agggacgttg ttcgggattt attgggcgta agggaacgca ggcggtcttt taagtctgat 60 gtgaaagcct tcggcttaac cggagtagtg cattggaaac tggaagactt gagtgcagaa 120 gaggagagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 180 ggcgaaagcg gctctctggt ctgtaactga cgctgaggtt cgaaagcgtg ggtagcaaac 240 aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt 300 ccgcccttca gtgccgcagc taacgcaata agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag 360 gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 420 gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccttt gaccacctaa gagattaggt 480 tttcccttcg gggacaaagt gacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 540 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttgtc agttgccagc attaagttgg 600 gcactctggc gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc 660 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcaaga 720 ccgcgaggtt tagctaatct cttaaagccg ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 780 cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cgaatcagca tgtcgcggtg aatacgttcc 840 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agccggtggg 900 gtaaccgcaa ggagccagcc gtctaaggtg ggacagatga ttggggtgaa tctacaaaag 960 gaggaaccaa aattcctctc tttcccctcc cgaggaa 997

Claims (8)

  1. 기탁번호 제KACC92234P호로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 B4 균주.
  2. 제1항의 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배양액은 건조분말 형태인 것인, 항균제.
  4. 제1항의 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 어류 또는 갑각류의 면역증진용 사료첨가제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 배양액은 건조분말 형태인 것인, 면역증진용 사료첨가제.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 면역증진은 어류 또는 갑각류의 혈청 내 라이소자임 활성 증진을 통해 이루어지는 것인, 면역증진용 사료첨가제.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 면역증진은 어류 또는 갑각류의 백혈구의 활성 증진을 통해 이루어지는 것인, 면역증진용 사료첨가제.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 어류 또는 갑각류는 잉어, 뱀장어, 참돔, 방어, 넙치, 문어, 대하, 보리새우, 새우, 꽃게, 전복, 소라, 해삼 및 성게로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 면역증진용 사료첨가제.
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