KR102488609B1 - 장내 유해세균 억제 기능을 가진 락토바실러스 파라부크네리 nsmj16 (kacc81129bp) 및 락토바실러스 브레비스 nsmj23(kacc81130bp) - Google Patents

장내 유해세균 억제 기능을 가진 락토바실러스 파라부크네리 nsmj16 (kacc81129bp) 및 락토바실러스 브레비스 nsmj23(kacc81130bp) Download PDF

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Abstract

본 발명은 장내 유해세균에 대한 억제 기능을 가지며 숙주의 장내미생물 군집 개선에 도움이 될 수 있는 신규한 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16(Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주에 관한 것이다.

Description

장내 유해세균 억제 기능을 가진 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (KACC81129BP) 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(KACC81130BP){Lactobacillus parabuchneri NSMJ16 and Lactobacillus brevis NSMJ23 with antagonistic effect against pathogenic bacteria in intestinal tract}
본 발명은 장내 유해세균에 대한 억제 기능을 가지며 숙주의 장내미생물 군집 개선에 도움이 될 수 있는 신규한 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16(Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주에 관한 것이다.
사람 및 동물의 위장관 내에서 숙주(host)의 장내 미생물환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 유산균이나 비피더스균과 같은 유익균 및 이스트(효모)의 범위를 포함한다. 유산균이 프로바이오틱스로서 효과가 있기 위해서는 기본적으로 섭취된 후 장까지 도달해서 장 표면에 부착하여 유지되어야 하므로 기본적으로 균주의 내산성, 내담즙산성, 및 장 상피세포 부착능력이 우수해야 하며, 장내 유해세균을 제어할 수 있는 항균성 역시 보유해야 한다.
본 발명은 장내 유해세균에 대한 억제 기능을 가지며 숙주의 장내미생물 군집 개선에 도움이 될 수 있는 신규한 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16(Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주에 관한 것이다.
선행특허 대한민국 등록특허공보 10-0858840 (2008.09.17 공고)에는 락토바실러스 부치네리 이뮨01 KCTC 13312 균주에 대해서 언급되어 있고, 대한민국 등록특허공보 10-2109195 (2020.05.08 공고)에는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 균주에 대하여 언급되어 있으나, 장내 유해세균에 대한 억제 기능에 대해서는 기재하고 있지 않다.
대한민국 등록특허공보 10-0858840 (2008.09.17 공고) 대한민국 등록특허공보 10-2109195 (2020.05.08 공고)
해결하고자 하는 과제는, 내산성, 내답즙성, 세포소수성 및 항균성과 같은 기본 프로바이오틱스 특성을 가지며, 특히 장내 유해 병원성 미생물 억제능을 보유하고 있는 신규한 균주를 제공하고자 하는 것이다.
과제 해결수단은, 장내 유해세균 억제 기능을 가진 수탁번호 KACC81129BP의 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 균주이다.
또한 장내 유해세균 억제 기능을 가진 수탁번호 KACC81130BP의 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주로 실시될 수 있다.
또한 상기 균주 중에서 1종 이상을 포함하는 유산균 제제, 사료 첨가제 및 식품 첨가제이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16(Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23)은 내산성, 내답즙성, 세포소수성, 항균성과 같은 기본 프로바이오틱스 특성을 가지며, 특히 두 미생물의 장내 유해 병원성 미생물 억제능을 실험적으로 확인하였다.
본 발명의 균주들은 장내미생물 균총 개선 및 질병억제에 도움을 줄 수 있는 것으로, 친환경적 축산동물용 사료첨가용 생균제, 프로바이오틱스 등 유산균 생균제로 사용될 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.
도 1은 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23의 내산성 실험결과를 각각 나타내는 도면이다.
도 2는 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23의 내담즙산성 실험결과를 각각 나타내는 도면이다.
도 3은 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23의 세포소수성 실험결과를 각각 나타내는 도면이다.
도 4는 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23의 항균활성능 실험결과를 각각 나타내는 도면이다.
도 5는 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23의 장내 유해세균에 대한 제어능 실험결과를 각각 나타내는 도면이다.
김치 및 막걸리에서 분리된 유산균을 대상으로 내산성, 내답즙산성, 항균활성능 평가를 통해 모든 항목에서 우수한 활성을 갖는 NSMJ16 및 NSMJ23 균주를 선별하였다.
16S rRNA 유전자 염기서열 기반 선별 균주의 분류 동정을 수행하여 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23로 명명하였다.
성장 평가, 당 이용성 및 효소 활성능 평가를 통해 두 균주의 특성을 파악ㅎ하였으며, 특히 축산동물 분변샘플을 활용한 실제 장내미생물 배양법 및 마이크로바이옴 분석을 통해 NSMJ16 및 NSMJ23 균주의 장내 유해세균에 대한 조절능을 평가하였다.
락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16(Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23)은 모두 약 82% 수준의 내산성으로 대조군 LGG(71%)보다 높았다. 두 균주의 내답즙성은 모두 대조군 LGG(89%)보다 높았다. 두 균주의 세포소수성은 각각 80% 및 78% 수준으로 대조군 LGG(26%)보다 높았다. 두 균주는 모두 대표적 병원균이자 항생제 내성균인 Staphylococcus aureus (그람양성), Escherichia coli (그람음성)의 성장을 억제시켰다. NSMJ16 및 NSMJ23의 유산균 상등액 처리에 따른 장내미생물군집 변화 분석 결과, control(무처리구)와 비교하였을 때, 두 균주는 사람 혹은 동물의 감염성 질환의 원인균으로 보고되고 있는 Morganella morganii, Escherichia fergursonii, Vibrio vulnificus와 같은 유해 세균들을 억제하였다. 이들 유해 세균은 항생제 내성을 보유하는 것으로 알려져 있으며, 내성 전파 및 환경으로의 노출 또한 문제시될 수 있는 유해세균들이다.
실시예 1. 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (KACC81129BP) 또는 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(KACC81130BP) 균주
락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (KACC81129BP) 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(KACC81130BP) 균주는 프로바이오틱스 기본 특성과 장내 유해세균 억제능을 보유하고 있으므로, 각각 또는 함께 사용되어 프로바이오틱스 기능을 갖는 제품으로 실시될 수 있다. 또한 , 각 균주도 선택적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따라서, 장내 유해세균 억제 기능을 가진 수탁번호 KACC81129BP의 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 균주로 실시될 수 있다. 또한, 장내 유해세균 억제 기능을 가진 수탁번호 KACC81130BP의 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주로 실시될 수 있다. 또한, 상기 균주 중에서 1종 이상을 포함하는 유산균 제제, 사료 첨가제 및 식품 첨가제로 실시될 수 있다.
실험예 1. 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23 균주의 분리
1) 김치 및 막걸리 시료를 단계적으로 희석하여, MRS 배지에 도말한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 얻어진 콜로니를 루프로 수거하여 MRS broth에 접종하였고, 30℃에서 48시간 배양 후 배양액을 동량의 30% 글리세롤과 혼합 후 -70℃ 이하에서 동결보존 하였다. GTG-PCR을 통해 총 57주의 균주를 확보하였으며, 아래의 내산성, 내담즙산성, 세포소수성, 항균활성 평가를 통해 우수한 활성을 갖는 균주를 확보하였다.
2) 그 중 NSMJ16 균주는 16S rDNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 파라부크네리 표준균주(Lactobacillus parabuchneri NBRC 107865T)와 가장 높은 상동성(100%)을 나타내어 “락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16”로 명명하였으며, NSMJ23 균주는 락토바실러스 브레비스 표준균주(Lactobacillus brevis ATCC 14869T)와 가장 높은 상동성(99.87%)을 나타내어 “락토바실러스 브레비스 NSMJ23”로 명명하였다.
실험예 2. 균주의 내산성, 내담즙성, 세포소수성 및 항균활성 평가
1-1) 내산성 평가(Acid tolerance test): 분리균주들의 내산성을 확인하기 위해 MRS 액체배지에 OD600=1.0까지 배양한 후 배양액 1 ml을 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 배지성분을 제거하였다. 1X PBS (pH7.5)를 이용하여 잔여 배지성분을 제거하고, 유산균 세포에 1 ml 1X PBS (pH2.5)를 넣고 37℃에서 2시간 동안 노출시킨 후 MRS 고체배지를 이용한 plate counting 방법으로 노출 전과 후의 CFU/ml을 비교하였다.
1-2) 내산성 실험결과
Lactobacillus parabuchneri NSMJ16 및 Lactobacillus brevis NSMJ23은 도 1에서 나타난 바와 같이 산성환경(pH2.5)에 대한 생존율이 최초(0 hr) 대비 각각 약 82% 수준으로, 대조군인 LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)(71%)보다 높았다.
2-1) 내담즙산성 평가(Bile-salt tolerance test): 분리균주들의 내담즙산성을 확인하기 위해 MRS 액체배지에 OD600=1.0까지 배양한 후 배양액 1 ml을 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 배지성분을 제거하였다. 1X PBS (pH7.5)를 이용하여 잔여 배지성분을 제거하고, 0.3% bile salts가 포함된 1 ml MRS 액체배지에 넣고 37℃에서 3시간 동안 노출시킨 후 MRS 고체배지를 이용한 plate counting 방법으로 CFU/ml을 측정하였다. 내답즙산성(%)는 bile-salt가 포함되지 않은 MRS 액체배지에서의 3시간 배양 후 CFU/ml와 비교하여 측정하였다.
2-2) 내담즙산성 실험결과
Lactobacillus parabuchneri NSMJ16 및 Lactobacillus brevis NSMJ23은 도 2에서 나타난 바와 같이 0.3% bile salt에 대한 생존율은 대조군인 LGG(89%)보다 높게 나타났다.
3-1) 세포소수성 평가(Cell surface hydrophobicity test): 분리균주들의 세포소수성을 확인하기 위해 MRS 액체배지에 배양한 후, 배양액 1 ml을 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 배지성분을 제거하였다. PBS (pH7.5) 버퍼로 잔여 배지성분을 제거하고, 같은 버퍼를 이용하여 OD560=1.0 (Ab0)으로 세포농도를 맞추었다. 0.2 ml n-Hexadecane (sigma)를 넣고 2분간 혼합하고, 37℃에서 2시간 동안 정치 후 수용액 층(aqueous phase)의 OD560 (Ab1)를 측정하였다. 세포소수성(%)은 『(Ab0-Ab1)/Ab0 X 100』으로 계산하였다.
3-2) 세포소수성 실험결과
Lactobacillus parabuchneri NSMJ16 및 Lactobacillus brevis NSMJ23은 도 3에서 나타난 바와 같이 세포소수성 측정 결과 각각 약 80% 및 78% 수준으로, 대조군인 LGG(26%)보다 높게 나타났다.
4-1) 항균활성 평가(Antagonistic activities): 분리균주들의 항균활성은 double layer agar법을 사용하였다. 항생제내성을 갖으며 대표적 그람양성 및 그람음성 병원성 세균으로 알려진 Escherichia coli CCARM 1G440 및 Staphylococcus aureus CCARM 3A860을 지시균주로 사용하였다. 1 ul 유산균배양액(OD600=1.0)을 MRS agar 위에 spotting, 30℃에서 48시간 배양 후, 클로로포름 증기에 20분간 노출시켜 성장을 정지시켰다. 약 106 CFU/ml의 지시균이 포함된 3.5 ml low-melt BHI (BHI with 2% (w/v) low melting agar (Bio-Rad, USA))를 MRS-agar에 붓고 굳힌 다음 37℃에서 48시간동안 배양시켰다. 배양 후, 유산균의 항균활성을 콜로니 주변에 형성된 투명환(clear zone)의 크기를 기초로 평가하였다.
4-2) 항균활성능 실험결과
도면 4에 도시된 바와 같이 축산동물의 대표적 병원균이자 항생제 내성균인 Staphylococcus aureus (그람양성 병원균), Escherichia coli (그람음성 병원균)의 성장을 억제시켰다.
실험예 3. 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23 균주의 생리학적 특성 평가
1-1) 성장조건 평가: 성장을 위한 온도범위는 5-50℃(5℃ 간격)에서 4일 동안 MRS 고체배지에 배양하면서 평가하였다. pH 범위는 4일 동안 30℃에서 pH3.0-10.0(pH0.5 간격)의 MRS 액체배지를 사용하여 평가하였다. NaCl(%) 범위는 4일 동안 30℃에서 0-12%(1% 간격)의 MRS 액체배지를 사용하여 평가하였다.
1-2) 성장조건 평가결과
NSMJ16 및 NSMJ23의 생장특성을 분석한 결과, 간균, 운동성(-), 그람염색(+), 통성혐기성, 당발효(+)의 일반적 유산균의 특징을 보였다. NSMJ16 균주는 10-40℃, pH3.5-8.0, 0-7% NaCl에서 생장으로 보였으며, 생장최적조건은 30-40℃, pH6.0-7.0, 0-3% NaCl이었다[표 1]. NSMJ23 균주는 10-40℃, pH3.5-8.0, 0-5% NaCl에서 생장으로 보였으며, 생장최적조건은 30-40℃, pH6.0-6.5, 0-2% NaCl이었다(표 1).
Figure 112020101725529-pat00001
2-1) 당 이용성 및 효소 활성능 평가: API 50 CH 및 API ZYM 키트(bioMerieux, France)를 사용하여 균주의 당 이용성 및 효소 활성능을 분석하였다.
2-2) 당 이용성 및 효소 활성능 평가결과
NSMJ16 균주의 당이용성 및 효소활성능을 분석한 결과, L-Arabinose, D-Ribose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, Methyl-D-glucopyranoside, Esculine, D-Maltose, D-Melibiose, D-Saccharose, D-Melezitose, D-Raffinose, D-Turanose, Potassium gluconate, Potassium 5-keto-gluconate를 발효에 이용할 수 있음을 나타내주며(표 2), Leucine arylamidase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 3).
NSMJ23 균주의 당이용성 및 효소활성능을 분석한 결과, L-Arabinose, D-Ribose, D-Xylose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, Methyl-D-glucopyranoside, N-acetylglucosamine, Esculine, D-Maltose, Potassium gluconate, Potassium 2-keto-gluconate, Potassium 5-keto-gluconate를 발효에 이용할 수 있음을 나타내주며(표 2), Leucine arylamidase, Valine arylamidase, Acid phosphatase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase, β-glucosidase 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 3).
Figure 112020101725529-pat00002
Figure 112020101725529-pat00003
실험예 4. 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16( Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 및 락토바실러스 브레비스 NSMJ23( Lactobacillus brevis NSMJ23)의 축산동물 장내미생물 조절능 평가
장내미생물 군집은 호스트 내 소화되지 않는 음식물의 소화, 에너지 대사, 유해균 방어, 균형적 면역체계 형성에 매우 중요한 역할을 한다. 그러한 이유로, 적절한 장내 미생물군집 형성은 호스트 건강을 유지하는데 중요하다. 일반적으로는 건강한 호스트 내 장내미생물 군집에는 유익 혹은 유해한 영향을 주는 다양한 미생물 개체들이 존재하는데, 균형적인 장내 미생물군집은 유해균에 대한 집락형성을 계속적으로 제어하는 경향을 가진다.
반면, 식이, 외부영향, 질병상태로부터의 미생물 군집 변화는 면역체계 붕괴, 장염, 설사와 같은 질병으로 이어질 수 있다. 특히, (기회성)병원균은 호스트 건강에 질병 유발과 같은 역효과를 주는 장내미생물 개체로, 균형 있는 미생물 군집과 이것에 의한 정상면역체계가 무너질 때 크게 증가될 수 있고 결과적으로 호스트 건강에 문제를 일으킬 수 있다. 또한 이들은 항생제 내성을 갖고 있어 항생제 과다사용으로 인해 오히려 출현 빈도가 증가되어 숙주건강이나 환경에 문제를 일으킨다.
유산균은 생성하는 항균물질들(유기산, 항균성 펩타이드_박테리오신 등)에 의한 항균작용과 함께 균형적 장내 미생물 균총에 도움을 주고 장내 불균형의 위험을 감소시킬 수 있는 역할을 하는 것으로 프로바이오틱스 개발에 대상이 되고 있다.
따라서, 항생제 내성 보유하는 유해 병원성균에 대한 항균능을 갖는 NSMJ16 및 NSMJ23 균주에 대하여, 특히 실제 장내 유해세균에 초점을 맞추어 실제 장내미생물 제어 기능을 갖는지 평가하였다.
1) In-vitro 장내미생물 배양법 및 마이크로바이옴 분석을 통한 장내미생물 조절능 평가법
- 장내미생물 제어능을 평가하기 위해 축산동물 중 소(cattle)의 분변을 이용하였다. 10%(w/v) 농도로 분변을 PBS (pH7.5)와 혼합하고 2000 rpm에서 낮은 속도에서 10분간 원심분리한 후 얻어진 상등액을 장내미생물로 사용하였고, 장내미생물 조절능을 평가하기 위해 MRS 액체배지에 키운 NSMJ16 및 NSMJ23의 각각의 배양액(OD600=1)을 다시 동일배지에 1%(v/v) 접종 후 48시간 배양 후 얻어진 각각의 상등액을 사용하였다. 장내미생물을 10%(v/v) 농도로 BHI (brain heart infusion) 액체배지에 혼합 후 각각의 배양상등액을 처리, 무처리군 포함 16시간 동안 배양하였다.
- 배양기간 중 8 및 16시간에 수거한 장내미생물 배양액의 미생물 군집을 분석하기 위해 PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, USA)를 이용하여 total DNA를 추출하였다. Two-step PCR 반응을 통해 total DNA 내 16s rRNA 유전자 V3-V4 영역을 증폭하였다. 증폭산물을 Illumina Miseq platform (Illumina, USA) 장비를 사용하여 시퀀싱하였다. 시퀀싱을 통해 얻어진 염기서열 reads들 가운데 low-quality, ambiguous, chimera 염기서열을 제거하고 97% 상동성 기준으로 clustering 하여 OTU(operational taxonomic unit)를 형성하였다. 각 OTU의 대표 염기서열 read들을 NCBI 16S microbial reference DB에 BLASTN을 통해 비교하고 best-hit 정보를 통해 taxonomic classification을 수행하였다.
2) In-vitro 장내미생물 배양법 및 마이크로바이옴 분석을 통한 장내미생물 조절능 평가 결과
- NSMJ16 및 NSMJ23의 유산균 상등액을 각각 처리함에 따른 미생물군집 변화 분석 결과, control(무처리구)와 비교하였을 때, 특히 항생제 내성 보유 질병유발 가능 병원균으로 분류될 수 있는 Escherichia fergursonii, Morganella morganii, Vibrio vulnificus가 16시간 배양 동안 감소되었다(도면 5).
Escherichia fergursonii는 넓은 스펙트럼의 항생제 내성을 지니며 인간 및 동물의 감염병에 원인이 될 수 있는 것으로 잘 알려져 있으며(Savini et al., 2008; Forgetta et al., 2012), Morganella morganii는 wound infection 및 요로감염에 원인되는 병원균이자 가축(소)의 높은 치사율과 병변에 원인이 될 수 있는 것으로 알려지고 있다(Liu et al., 2016; Li et al., 2018). Vibrio vulnificus는 폐혈증과 같은 감염병 원인균이 될 수 있는 것으로 보고되고 있다(Heng et al., 2017).
국립농업과학원 KACC81129BP 20200731 국립농업과학원 KACC81130BP 20200731

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  1. 수탁번호 KACC81129BP의 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 균주 및 수탁번호 KACC81130BP의 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주 중에서 1종 이상을 포함하고,
    장내 유해 병원균인 Escherichia fergursonii, Morganella morganii 및 Vibrio vulnificus의 억제 기능을 가지는 것을 특징으로 하는, 유산균 제제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 수탁번호 KACC81129BP의 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 균주 및 수탁번호 KACC81130BP의 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주 중에서 1종 이상을 포함하고,
    장내 유해 병원균인 Escherichia fergursonii, Morganella morganii 및 Vibrio vulnificus의 억제 기능을 가지는 것을 특징으로 하는, 사료 첨가제.
  5. 수탁번호 KACC81129BP의 락토바실러스 파라부크네리 NSMJ16 (Lactobacillus parabuchneri NSMJ16) 균주 및 수탁번호 KACC81130BP의 락토바실러스 브레비스 NSMJ23(Lactobacillus brevis NSMJ23) 균주 중에서 1종 이상을 포함하고,
    장내 유해 병원균인 Escherichia fergursonii, Morganella morganii 및 Vibrio vulnificus의 억제 기능을 가지는 것을 특징으로 하는, 식품 첨가제.
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